III. BAHAN DAN METODE
3.3 Metode Penelitian
Dalam penelitian ini dilakukan beberapa tahapan kerja yaitu: (1) persiapan inokulum, (2) persiapan sampel yang di-inokulasi dengan E.coli ATCC 25922, (3) Inkubasi dan pembacaan hasil pertumbuhan, (4) perhitungan hasil. melakukan analisa pertumbuhan, menghitung recovery rate, menghitung waktu analisa, dan menghitung biaya yang digunakan.
3.3.1 Persiapan inokulum bakteri dan sampel
Kultur bakteri yang akan dipergunakan diambil dari cryobank dan diremajakan menggunakan media Brain Heart Infusion Broth (BHIB) sebelum digunakan. Untuk perhitungan jumlah sel dalam stok suspensi, satu ml suspensi kultur dari BHIB yang sudah berumur 24 jam dibuat seri pengenceran sampai 10-9 menggunakan Peptone Dilution Fluid (PDF). Dari masing-masing pengenceran diambil satu ml dan ditanam di cawan petri yang berisi Plate Count Agar (PCA) yang telah ditambahkan TTC (Triphenyl Tetrazolium Cloride) 1%, dengan metode cawan tuang. Penambahan TTC dilakukan untuk memudahkan
perhitungan koloni karena warna koloni menjadi merah. Sambil menunggu hasil perhitungan, stok suspensi bakteri tersebut disimpan dalam lemari pendingin. Stok suspensi ini selanjutnya akan digunakan untuk melakukan cemaran ke sample air proses maupun pembuatan kontrol positif dengan larutan PDF.
Sampel air proses diambil dari PT Yummy Food Utama pada pagi hari dengan menggunakan botol laboratori steril ukuran 1000 ml. Sampel air disiapkan sebanyak 8 botol untuk 4 macam perlakuan dengan masing-masing dua ulangan. Semua sampel dibawa dalam cool box dengan ice pack untuk menjaga agar tetap dingin selama perjalanan ke Laboratorium PPOMN. Pengambilan sampel dan pengujian dilakukan dalam tiga periode yaitu tanggal 18 Mei (sampel 1), 3 Juni (sampel 2), dan 26 Juni 2008 (sampel 3) sesuai dengan tanggal pengujian.
Dari 8 botol sampel air proses tersebut 6 botol sampel digunakan untuk perlakuan sampel + cemaran dengan 3 konsentrasi cemaran, masing-masing dua ulangan yaitu S1C dan S2C. Dua botol sampel air proses lainnya digunakan untuk perlakuan sampel tanpa cemaran (dua ulangan S1 dan S2). Sebagai kontrol positif yaitu perlakuan cemaran digunakan larutan PDF steril sebanyak 1 liter dengan dua ulangan yaitu C1 dan C2. Masing-masing ulangan dibuat duplo. Sampel air proses dan larutan PDF steril yang akan dicemari tersebut dituang secara aseptis (di dalam Laminar Air Flow) kedalam tabung erlenmeyer steril ukuran dua liter dan diinokulasi dengan suspensi bakteri standar yang sudah disiapkan.
Dalam penelitian ini digunakan tiga konsentrasi bakteri E. coli pada setiap sampel sedemikian rupa sehingga konsentrasi akhir pada sampel yang akan diinokulasikan ke media adalah konsentrasi rendah (< 10 cfu/ml), konsentrasi sedang (10-50 cfu/ml), dan konsentrasi tinggi (50-100 cfu/ml). Untuk membuat sampel ber E.coli rendah (<10 cfu/ml) diambil satu ml dari pengenceran 10-6 dengan konsentrasi bakteri sebesar 4.103 kemudian diinokulasikan ke 1000 ml larutan PDF steril dan 1000 ml sampel air proses, sehingga diperoleh sampel ber E.coli 4 cfu/ml. Dengan cara yang sama dibuat sampel ber E.coli 10-50 cfu/ml dari satu ml dari pengenceran 10-5 dengan konsentrasi sebesar 4.104 cfu/ml sehingga diperoleh konsentrasi sel pada sampel sebesar 40 cfu/ml. Untuk membuat sampel ber E.coli 50-100 cfu/ml diambil dua ml dari pengenceran 10-5
sehingga diperoleh konsentrasi sel pada sampel sebesar 80 sel/ml. Setelah di gojog sampai homogen, semua jenis sampel diatas tersebut diambil masing-masing 10 ml dan dimasukkan ke tabung steril 20 ml yang sudah disiapkan. Dari perhitungan yang dilakukan saat pembuatan inokulum maka konsentrasi akhir dari sample adalah 4 cfu/ml (rendah), 40 cfu/ml (sedang), dan 80 cfu/ml (tinggi).
3.3.2 Inokulasi sampel
Penelitian ini merupakan penelitian laboratorium untuk membandingkan empat macam metode pengujian bakteri E coli di sampel air. Keempat metode pengujian tersebut adalah metode Angka Paling Mungkin konvensional, metode APM cepat, metode Angka Lempeng Total cepat dan metode Presence Absence cepat. Skema penelitian dan urutan kerja bisa dilihat dalam Gambar 8.
Yang pertama adalah analisa APM konvensional yang menjadi standar pengujian Koliform dan E.coli di SNI dan FDA (FDA, 2006; SNI, 1992 dan 2006b). Yang kedua adalah metode APM cepat menggunakan media baru yang mengandung substrat fluorogenik kromogenik yang sudah diakui oleh USEPA (USEPA, 2001 dan 2007). Kedua metode APM ini menggunakan seri lima tabung yaitu dengan jumlah sampel 10 ml, 1 ml, dan 0,1 ml dengan demikian total sampel yang dianalisa tiap set seri pengenceran adalah 55,5 ml. Sesuai dengan jumlah inokulum/sampel yang digunakan, maka volume media broth yang digunakan untuk jumlah sampel 10 ml adalah 10 ml media broth LST atau LMX double strength. Untuk jumlah sample 1 ml digunakan media 5 ml - single strength dan jumlah sampel 0.1 ml digunakan media 5 ml - single strength (APHA, 2005).
Pada metode APM konvensional, apabila didapat hasil positif gas pada media LST setelah inkubasi 48 jam maka dilakukan inokulasi ke media EC Broth. Setelah inkubasi 48 jam di media EC Broth, setiap tabung yang positif gas (terduga E.coli) akan digores ke media Levine EMB Agar. Koloni terduga E.coli adalah koloni warna pink dengan kilap logam. Beberapa koloni terduga diperbanyak dengan Nutrient agar miring untuk dilakukan konfirmasi dengan uji IMVIC’s. Pada metode APM cepat dengan media Fluorocult LMX Broth, tabung
yang diduga mengandung Koliform (termasuk E. coli) akan berubah warna menjadi hijau kebiruan. Konfirmasi E.coli dilakukan dengan UV lamp 366 nm untuk melihat fluoresensi dan penambahan KOVAC’s untuk melihat cincin merah dari reaksinya dengan indol yang ada.
Gambar 8 Skema penelitian.
Metode ketiga adalah metode Presence Absence menggunakan media kromogenik fluorogenik siap pakai, Readycult® Coliforms 100 (RC) dengan sampel sebesar 100 ml. Botol yang diduga mengandung Koliform (termasuk E. coli) akan berubah warna menjadi hijau kebiruan. Konfirmasi E.coli dilakukan dengan UV lamp 366 nm untuk melihat fluoresensi dan penambahan pereaksi KOVAC’s untuk melihat cincin merah dari reaksinya dengan indol yang ada.
Sampel air + suspensi bakteri E. coli konsentrasi
0, 4, 40, 80 cfu/ml metode cepat Angka Paling Mungkin Fluorocult LMX Broth metode cepat Presence Absence *) Readycult Coliform 100
Warna media hijau kebiruan, fluoresensi (+), indol (+) Warna koloni purple/ungu Indol (+) *)
hanya untuk sampel ber E.coli rendah dan sampel air proses saja.
metode cepat Angka Lempeng Total Chromocult® Coliform Agar Uji IMVIC’s Nutrient Agar miring
Sampel air tanpa penambahan bakteri E. coli metode konvensional Angka Paling Mungkin Lauryl Sulphate Tryptose Broth (gas +)
EC Broth (gas +)
Levine EMBA (kilap logam pada koloni
merah muda)
Suspensi bakteri E. coli dalam Phosphat Buffer steril konsentrasi
yang tidak dicemari dan sampel yang dicemari E. coli dengan kadar bakteri rendah (4 cfu/ml).
Metode keempat adalah metode Angka Lempeng Total menggunakan teknik cawan tuang dengan sampel 1 ml. Media yang digunakan adalah media cepat kromogenik Chromocult® Coliform Agar (CCA). Koloni E. coli pada media CCA akan berwarna ungu. Konfirmasi dilakukan dengan meneteskan pereaksi KOVAC’s pada koloni terduga hingga terbentuk warna merah disekitar koloni