MENURUNKAN IMMOBILITY TIME
DAN KADAR KORTISOL TIKUS JANTAN GALUR WISTAR YANG DEPRESI
LIA PUSPITASARI
PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA
DENPASAR
(Pandanus amaryllifolius R.) 10% DAPAT MENURUNKAN IMMOBILITY TIME DAN KADAR KORTISOL TIKUS JANTAN GALUR
WISTAR YANG DEPRESI
LIA PUSPITASARI 1490761043
PROGRAM MAGISTER
PROGRAM STUDI ILMU BIOMEDIK PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR
2016
KADAR KORTISOL TIKUS JANTAN GALUR WISTAR YANG DEPRESI
Tesis untuk Memperoleh Gelar Magister pada Program Magister, Program Studi Biomedik,
Program Pascasarjana Universitas Udayana
LIA PUSPITASARI 1490761043
PROGRAM MAGISTER
PROGRAM STUDI ILMU BIOMEDIK PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR
2016
TESIS INI TELAH DISETUJUI PADA TANGGAL 30 JUNI 2016
Pembimbing I Pembimbing II
Dr. dr. I Made Jawi, M. Kes Dr. dr. Wayan Putu Sutirta Yasa, M.Si NIP. 195812311986011006 NIP. 195705131986011001
Mengetahui
Ketua Program Studi Ilmu Biomedik Program Pascasarjana
Universitas Udayana
Dr. dr. Gde Ngurah Indraguna Pinatih, M.Sc, Sp.GK NIP. 195805211985031002
Direktur
Program Pascasarjana Universitas Udayana,
Prof. Dr. dr. A.A. Raka Sudewi, Sp.S(K) NIP. 195902151985102001
Tesis ini Telah Diuji pada Tanggal 30 Juni 2016
Panitia Penguji Tesis Berdasarkan SK Rektor Universitas Udayana, No: 2940/UN14/4/HK/2016, Tanggal 23 Juni 2016
Ketua : Dr. dr. I Made Jawi, M. Kes Anggota :
1. Dr. dr. Wayan Putu Sutirta Yasa, M.Si 2. Prof. Dr. I Gusti Made Aman, Sp.FK
3. Dr. dr. Bagus Komang Satriyasa, M. Repro 4. dr. I Gusti Ayu Artini, S.Ked., M.Sc
Yang Maha Esa, atas rahmat dan anugrah-Nya sehingga tesis yang berjudul
“Ekstrak Etanol Daun Pandan Wangi (Pandanus amaryllifolius R.) 10%
dapat Menurunkan Immobility Time dan Kadar Kortisol Tikus Jantan Galur Wistar yang Depresi” dapat diselesaikan dan diajukan sebagai syarat untuk memperoleh gelar Magister Biomedik (M.Biomed) di Program Studi Biomedik, Program Pascasarjana Universitas Udayana.
Penyusunan tesis ini tidaklah terlepas dari dukungan, saran, dan bimbingan dari berbagai pihak. Oleh karena itu pada kesempatan yang tersedia ini sudah sepantasnya penulis menyampaikan ucapan terimakasih kepada Prof. Dr. dr. Ketut Suastika, Sp. PD, KEMD, sebagai Rektor Universitas Udayana, Prof. Dr. dr. A.A.
Raka Sudewi, Sp. S (K) selaku Direktur Program Pascasarjana Universitas Udayana, dan Dr. dr. Gde Ngurah Indraguna Pinatih, M.Sc., Sp.GK selaku Ketua Program Studi Ilmu Biomedik atas kesempatan dan fasilitas yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti pendidikan Program Magister di Universitas Udayana.
Ucapan terimakasih juga penulis sampaikan kepada Dr. dr. I Made Jawi, M.Kes selaku dosen pembimbing I dan Dr. dr. Wayan Putu Sutirta Yasa, M.Si selaku pembimbing II yang telah memberikan penulis bimbingan, saran, serta dorongan dalam penyusunan tesis ini. Penulis juga menyampaikan terimakasih kepada para penguji diantaranya Prof. dr. IGM. Aman, Sp.FK, Dr.dr. Bagus
di Magister Biomedik yang telah memberikan bantuan selama penyusunan usulan penel itian ini; serta keluarga penulis, Ayah Dr. Ir. I Nyoman Arthanegara, Msi.
dan Ibu Ni Ketut Yasmari, kakak dan adik penulis Diah Ariyantini,S.S serta Alita Ayuningtyas yang dengan sabar memberikan ruang dan waktu dalam penulisan tesis ini; seluruh rekan-rekan farmakologi Legis, Rani, Citra, dan para sahabat Darpita, Widi, Dharmesti, Clarissa, Edy yang telah memberikan kritikan konstruktif terhadap penulis dalam penyusunan tesis ini; dan semua pihak yang telah membantu penulis baik secara langsung maupun tidak langsung yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.
Penulis menyadari bahwa penyusunan tesis ini masih jauh dari sempurna.
Oleh karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran dari semua pihak, sehingga dapat menjadi lebih baik lagi dimasa depan. Penulis berharap semoga tesis ini dapat bermanfaat bagi semua pihak yang memerlukan.
Denpasar, Juni 2016
Penulis
KADAR KORTISOL TIKUS JANTAN GALUR WISTAR YANG DEPRESI Depresi merupakan gangguan emosional dan jiwa yang terjadi akibat ketidaknormalan pada kadar serotonin, norepinefrin, dopamin, dan kortisol pada darah, urin, serta cairan serebrospinalis. Tanaman yang diduga memiliki aktivitas antidepresan dan mampu menormalkan abnormalitas yang terjadi yaitu daun pandan wangi yang mengandung berbagai metabolit sekunder. Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan efek pemberian ekstrak etanol daun pandan wangi (Pandanus amaryllifolius R.) 10% terhadap penurunan immobility time dan kadar kortisol tikus jantan galur wistar yang depresi.
Penelitian ini dilakukan dengan metode eksperimental laboratorik menggunakan pretest-postest control group design, dengan jumlah sampel sebanyak 24 ekor yang dibagi kedalam 4 kelompok perlakuan. Induksi depresi dilakukan dengan metode tail suspention test selama 3 menit setiap hari dalam 10 hari. Aktivitas antidepresan dinilai melalui pengukuran durasi immobility time dengan metode forced swimming test dan melalui pengukuran kadar kortisol dengan metode ELISA.
Berdasarkan hasil pengukuran immobility time pada hewan uji, ekstrak etanol daun pandan wangi 10% mampu menurunkan durasi immobility time sebesar 45,26% (p<0,05) dan menurunkan kadar kortisol sebesar 33,24% (p<0,05). Dapat dilihat juga pengaruh perlakuan dengan pemberian ekstrak etanol daun pandan wangi 10% pada pretest dan posttest pengukuran immobility time dan kadar kortisol dengan p<0.05 pada analisis t-paired test. Penurunan immobility time dan penurunan kadar kortisol pada pemberian ekstrak etanol daun pandan wangi 10%
belum mampu memberikan penurunan yang sama atau lebih baik dibandingkan dengan kontrol positif (pemberian amitriptilin) dengan nilai p<0,05.
Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa pemberian ekstrak daun pandan wangi 10% dapat menurunkan durasi immobility time dan kadar kortisol tikus jantan galur wistar yang depresi.
Kata Kunci: depresi, ekstrak pandan wangi, immobility time, kortisol
IN DEPRESSION MALE WISTAR RATS
Depression is an emotional and soul disorders that occurs due to abnormality of serotonine, norepinephrine, dopamine and cortisol levels in blood, urine and cerebrospinal fluid. Herb that assumed have antidepresant activity and able to normalise this abnormality condition is pandan leaf (Pandanus amaryllifolius R) with some secondary metabolites. The purpose of this reseach is to investigate the effect of pandan leaf extract in decreasing immobility time and cortisol levels in male wistar induced depression.
This research used experimental laboratory pretest and posttest control group design, with 24 sample that divided into four group. Depression was inducted with tail suspention test method for 3 minutes a day in 10 days. Antidepressant activity observed by measurement of immobility time in forced swimming test method and analysis of cortisol levels with ELISA method.
Based on the results of this research, ethanol extract of pandan leaves 10%
able decreased immobility time for 45,26% (p<0,05) and decreased cortisol level for 33,24% (p<0,05). In t-paired test analysis, extract ethanol of pandan leaves 10% showed that there was an influence with this treatment in immobility time and cortisol level pretest and posttest data (p<0,05). Another result from this research showed that ethanol extract of pandan leaves 10% did not decrease immobility time and cortisol levels more better than positive control (amitriptilin treatment) p<0,005.
It can be concluded that administration of extract ethanol pandan leaves 10%
decreased immobility time and cortisol levels in depression male wistar rats.
Key Words : depression, extract ethanol of pandan leaves, immobility time, cortisol
LEMBAR PERSETUJUAN ... iii
PENETAPAN PENGUJI... ... iv
SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT ... v
UCAPAN TERIMAKASIH ... vi
ABSTRAK ... viii
ABSTRACT ... ix
DAFTAR ISI ... x
DAFTAR TABEL ... xiii
DAFTAR GAMBAR ... xiv
DAFTAR ARTI, LAMBANG, SINGKATAN, DAN ISTILAH ... xv
DAFTAR LAMPIRAN ... xvi
BAB I PENDAHULUAN ... 1
1.1 Latar Belakang ... 1
1.2 Rumusan Masalah ... ... 3
1.3 Tujuan Penelitian ... 4
1.3.1 Tujuan umum ... 4
1.3.2 Tujuan khusus ... 4
1.4 Manfaat Penelitian ... 4
1.4.1 Manfaat ilmiah ... 4
1.4.2 Manfaat praktis ... 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 6
2.1 Depresi ... 6
2.1.1 Patofisiologi depresi... 6
2.1.2 Terapi depresi ... 8
2.1.3 Amitriptilin ... 12
2.2.3 Kandungan kimia dan aktivitas farmakologi... 15
2.2.4 Mekanisme zat aktif daun pandan wangi (Pandanus amaryllifolius L.) sebagai antidepresan ... 16
BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP, DAN HIPOTESIS PENELITIAN ... 18
3.1 Kerangka berpikir ... 18
3.2 Konsep penelitian ... 20
3.3 Hipotesis ... 20
BAB IV METODE PENELITIAN ... 21
4.1 Rancangan penelitian ... 21
4.2 Lokasi dan waktu penelitian ... 22
4.2.1 Tempat penelitian... 22
4.2.2 Waktu penelitian ... 22
4.3 Penentuan Sumber Data ... 23
4.3.1 Besar sampel ... 23
4.3.2 Kriteria sampel ... 23
4.4 Variabel Penelitian ... 24
4.4.1 Variabel bebas ... 24
4.4.2 Variabel terikat ... 24
4.4.3 Variabel terkendali ... 24
4.5 Definisi Operasional ... 24
4.6 Alat dan Bahan Penelitian ... 25
4.6.1 Alat penelitian ... 25
4.6.2 Bahan penelitian ... 25
4.7 Prosedur Penelitian ... 25
4.7.4 Skrining fitokimia ekstrak etanol daun pandan wangi ... 26
4.7.5 Uji aktivitas antidepresan ekstrak etanol daun pandan wangi ... 28
4.8 Analisis Data ... 33
4.9 Alur Penelitian... 35
BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN... 36
5.1 Hasil Penelitian ... 36
5.1.1 Hasil skrining fitokimia ... 36
5.1.2 Analisis deskriptif ... 36
5.1.3 Uji normalitas data ... 37
5.1.4 Uji homogenitas data antar kelompok ... 38
5.1.5 Hasil analisis one way anova ... 38
5.1.6 Uji komparabilitas ... 38
5.2 Pembahasan ... 43
5.2.1 Uji aktivitas antidepresan ... 43
5.2.1.1 Pengaruh ekstrak etanol daun pandan wangi terhadap immobility time ... 45
5.2.1.2 Pengaruh ekstrak etanol daun pandan wangi terhadap kadar kortisol serum ... 52
BAB VII SIMPULAN DAN SARAN ... 57
6.1 Simpulan ... 57
6.2 Saran ... 57
DAFTAR PUSTAKA ... 58
LAMPIRAN ... 62
Tabel 5.2 Tabel 5.3 Tabel 5.4 Tabel 5.5 Tabel 5.6
Tabel 5.7
Tabel 5.8
Tabel 5.9
Wangi ...
Data Immobility Time Pretest dan Posttest...
Data Kadar Kortisol Pretest dan Posttest...
Hasil Uji Normalitas Data Immobility Time...
Hasil Uji Normalitas Data Kadar Kortisol...
Hasil Uji Homogenitas Data Immobility Time dan Kadar Kortisol...
Hasil Uji One-way Anova Data Immobility Time dan Kadar Kortisol...
Hasil Uji Least Significant Difference (LSD) antar
Kelompok Pretest...
Hasil Uji Least Significant Difference (LSD) antar
Kelompok Posttest...
36 36 37 37 37
38
38
39
40
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1 Gambar 4.1 Gambar 4.2 Gambar 5.1
Gambar 5.2
Foto Tanaman Pandan Wangi...
Rancangan Penelitian...
Skema Kerja Penelitian...
Perbandingan Durasi Immobility Time Data Pretest dan Posttest...
Perbandingan Kadar Kortisol Pretest dan Posttest...
14 21 35
40 42
ACPY = 2-acetyl-1-pyrroline
ACTH = Adrenocorticotropic Hormone
ALU = Animal Laboratorium Unit
BDNF = Brain-Derived Neurotrophic Factor
CMC-Na = Carboxymethyle Cellulose-Natrium
CRH = Cortikotropin Releasing Hormon
DA = Dopamine
ELISA = Enzyme Linked Immunosorbent Assay ERK = Ekstraselular Signal Regulated Kinase
FST = Forced Swim Test
GABA = Gamma Amino Butiric Acid
HPA = Hipotalamus-Pituitari-Adrenal
IL- 6 = Interleukin-6
MAO = Monoamine Oksidase
MAOI = Monoamine Oksidase Inhibitor
NE = Norepinefrin
NET = Norepinefrin Transporter
PC12 = Pheochromocytoma Cell
SD = Standar Deviasi
SERT = Serotonine Reuptake Transpoter
SNRI = Serotonine Norepinephrine Reuptake Inhibitor
t ½ = Waktu paruh
TCA = Trycyclic Antidepressant
TNF-α = Tumor Nekrosis Factor-alfa
Lampiran 2
Lampiran 3 Lampiran 4 Lampiran 5
Surat Keterangan Determinasi Tanaman Pandan Wangi (Pandanus amaryllifolius R.)...
Hasil Statistik Data Immobility Time...
Hasil Statistik Data Kadar Kortisol Serum...
Dokumentasi Penelitian...
63 65 73 80
Depresi merupakan gangguan emosional dan jiwa yang terjadi akibat adanya gangguan keseimbangan neurotransmiter di otak, serta dapat disebabkan oleh faktor keturunan. Dampak yang ditimbulkan akibat depresi cukup besar, mulai dari menurunnya produktivitas kerja, ketergantungan narkotika dan psikotropika, gangguan dalam hubungan interpersonal seseorang, berbagai penyakit, serta yang paling berbahaya yaitu kasus bunuh diri yang terus bertambah dari tahun ke tahun.
Hal ini tentunya akan dapat dihindari jika penderita depresi memperoleh terapi yang tepat.
Terapi bagi penderita depresi adalah obat yang dapat meningkatkan mood atau yang dikenal sebagai obat antidepresan. Dalam terapi depresi, penggunaan antidepresan biasanya dilakukan dalam kurun waktu yang cukup lama terutama sebagai terapi pemeliharaan jangka panjang. Terlebih lagi hanya sebagian obat antidepresan yang bekerja selektif, sehingga tidak jarang pada penggunaannya menimbulkan berbagai efek samping seperti efek pada jantung, penglihatan kabur, obstipasi, mulut kering, retensi urin, sedasi, peningkatan nafsu makan, hipotensi ortostatis, serta kelainan darah (Gunawan, 2009; Syarif et al., 2011). Berdasarkan hal tersebut, sangat penting untuk menemukan obat alternatif yang tidak hanya efektif menurunkan prevalensi, morbiditas, mortalitas dari gangguan depresi namun sekaligus mampu memperbaiki kemampuan obat sebelumnya dengan efek
samping yang lebih kecil dari obat-obat antidepresan yang selama ini telah banyak digunakan.
Salah satu tanaman potensial yang memiliki beberapa aktivitas sebagai antidepresan yaitu tanaman pandan wangi (Pandanus amaryllifolius R). Secara empiris tanaman pandan wangi digunakan sebagai tonikum, penambah nafsu makan, pewangi dan penenang (Dalimartha, 2009). Di daerah Bali, pandan wangi merupakan salah satu tanaman yang mudah ditemui di pekarangan rumah, karena biasa digunakan sebagai salah satu sarana upakara. Tanaman ini juga belum banyak diketahui mengandung berbagai metabolit seperti alkaloid, flavonoid, saponin, tanin, polifenol, terpenoid, steroid, essensial oil, karotenoid, tokoferol, dan kuersetin (Lopez dan Nonato 2005; Prameswari dan Widjanarko, 2014).
Pada penelitian terhadap beberapa tanaman lain diketahui bahwa metabolit tanaman yang terkandung pada pandan wangi tersebut memiliki aktivitas sebagai antidepresan (Bahramsoltani et al., 2015). Alkaloid dari tanaman Piper longum memperlihatkan efek antidepresan dengan menurunkan hormon adrenokortikotropik, menghambat enzim monoamine oksidase (MAO), meningkatkan serotonin (5-HT) otak, dan kadar Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) (Bahramsoltani et al., 2015).
Flavonoid narigenin dari tanaman anggur bekerja melalui peningkatan serotonin (5-HT), norepinefrin (NE), dan kadar BDNF serta menurunkan aktivitas MAO. Tanin dari tanaman Terminalia chebula memberikan efek neuroprotektif serta meningkatkan ketersediaan monoamine di otak. Saponin dari tanaman ginseng menunjukkan efek antidepresan dengan mempengaruhi jalur signaling
BDNF, HPA axis, dan neurogenesis hipokampus, serta meningkatkan kadar monoamin. Terpenoid dari tanaman Origanum majorana memberikan efek antidepresan dengan melibatkan reseptor dopamine serta dengan meningkatkan kadar NE dan 5-HT di otak (Shekar et al. 2012; Bahramsoltani et al., 2015).
Kandungan alkaloid, flavonoid, saponin, tanin dan terpenoid yang terdapat dalam daun pandan wangi membuat ekstrak dari tanaman ini memiliki mekanisme kerja yang hampir sama dengan salah satu obat antidepresan golongan trisiklik yaitu amitriptilin. Saat ini amitriptilin menjadi salah satu pilihan terapi yang banyak digunakan dalam pengobatan depresi. Ekstrak etanol daun pandan wangi dalam penelitian ini diharapkan mampu membuktikan kebenaran khasiat yang dimiliki sebagai antidepresan. Berdasarkan uraian tersebut, maka akan dilakukan penelitian mengenai pengaruh pemberian ekstrak etanol daun pandan wangi pada hewan uji sebagai antidepresan.
1.2 Rumusan Masalah
1. Apakah pemberian ekstrak etanol daun pandan wangi (Pandanus amaryllifolius R.) 10% dapat menurunkan immobility time tikus jantan galur wistar yang depresi?
2. Apakah pemberian ekstrak etanol daun pandan wangi (Pandanus amaryllifolius R.) 10% dapat menurunkan kadar kortisol tikus jantan galur wistar yang depresi?
1.3 Tujuan Penelitian 1.3.1 Tujuan umum
Membuktikan aktivitas ekstrak etanol daun pandan wangi (Pandanus amaryllifolius R.) sebagai antidepresan melalui penurunan immobility time dan penurunan kadar kortisol.
1.3.2 Tujuan khusus
1. Membuktikan pemberian ekstrak etanol daun pandan wangi (Pandanus amaryllifolius R.) 10% dapat menurunkan immobility time tikus jantan galur wistar depresi.
2. Membuktikan pemberian ekstrak etanol daun pandan wangi (Pandanus amaryllifolius R.) 10% dapat menurunkan kadar kortisol tikus jantan galur wistar depresi.
1.4 Manfaat Penelitian 1.4.1 Manfaat ilmiah
Penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan terutama mengenai tanaman herbal yang dapat memberikan efek sama atau hampir sama sebagai antidepresan, serta memiliki efek samping yang lebih rendah dibandingkan obat antidepresan yang telah ada.
1.4.2 Manfaat praktis
Pada penelitian ini diharapkan dapat diketahui pengaruh dari pemberian ekstrak etanol daun pandan wangi sebagai antidepresan. Serta diharapkan juga dapat diketahui salah satu mekanisme kerja daun pandan wangi sebagai
antidepresan melalui pengaruhnya terhadap kadar kortisol tikus jantan galur Wistar yang depresi.
2.1 Depresi
Depresi merupakan gangguan yang heterogen akibat terganggunya satu masa fungsi manusia yang berkaitan dengan alam perasaan yang sedih dan gejala penyertanya, termasuk gangguan tidur dan nafsu makan, defisit dalam kognisi dan energi, psikomotor, konsentrasi, kelelahan, timbul rasa putus asa, rasa bersalah dan tidak berdaya, tidak berharga, serta bunuh diri (Katzung et al., 2014). Depresi diakibatkan karena terjadinya gangguan keseimbangan antara neurotransmiter di otak, karena berkurangnya serotonin (5-HT) atau adrenalin di saraf-saraf otak (Tjad dan Rahardja, 2010).
2.1.1 Patofisiologi depresi
Hingga saat ini, depresi masih dikaitkan dengan defisit dari fungsi atau jumlah monoamin (hipotesis monoamin). Faktor neurotropik (hipotesis neurotropik) dan endokrin (hipotesis endokrin) juga diketahui memiliki peranan penting dalam mencetuskan terjadinya depresi (Katzung et al., 2014).
A. Hipotesis neurotrofik
Faktor pertumbuhan saraf, Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) memiliki peran penting dalam regulasi plastisitas, ketahanan, dan pembentukan saraf (neurogenesis). Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) diperkirakan memberi pengaruh terhadap kelangsungan hidup dan pertumbuhan neuron melalui pengaktivan reseptor tirosin kinase B di neuron dan sel glia (Katzung et al., 2014).
Stres memiliki kaitan dengan penurunan kadar BDNF dan berkurangnya dukungan neurotrofik. Hal ini menyebabkan terjadinya perubahan struktural atrofik di hipokampus dan bagian lain seperti korteks frontalis medialis dan singulatus anterior. Hipokampus berperan penting dalam ingatan kontekstual dan regulasi sumbu hipotalamus-hipofisis-adrenal (PHA), sedangkan singulatus anterior berperan dalam integrasi rangsang emosi, sementara korteks frontalis orbital medialis juga diduga berperan dalam ingatan, belajar dan emosi.
Terjadinya depresi berkaitan dengan hilangnya aktivitas neurotrofik, dimana pada depresi mayor terjadi pengurangan 5-10% volume hipokampus dan pengurangan substansial volume di singulus anterior dan korteks frontalis orbital medialis.
Berkurangnya volume pada struktur hipokampus akan bertambah sesuai lama sakit dan jumlah waktu ketika depresi yang terjadi tidak diobati (Katzung et al., 2014).
B. Hipotesis monoamin dan neurotransmiter lain.
Pada hipotesis monoamin, dijelaskan bahwa depresi yang terjadi dikaitkan dengan dengan terjadinya defisiensi pada jumlah atau fungsi serotonin (5-HT), norepinefrin (NE), dan dopamin (DA) dalam korteks dan limbus (Katzung et al., 2014).
C. Hipotesis neuroendokrin
Hipotesis neuroendokrin menjelaskan keterkaitan kelainan hormon dengan terjadinya depresi. Terjadinya depresi dilaporkan berhubungan dengan peningkatan kadar kortisol. Pada hipotesis ini disebutkan bahwa glukokortikoid eksogen dan peningkatan kortisol endogen diketahui berkaitan dengan gejala-
gejala mood dan defisit kognitif serupa dengan peningkatan yang terjadi pada depresi (Katzung et al., 2014).
Peningkatan Kortisol Pada Depresi
Seluruh respon umum dari proses adaptasi tubuh seperti menerima stresor fisik dan psikologis dikendalikan oleh hipotalamus. Setelah menerima stresor, hipotalamus akan segera mengaktifkan saraf simpatis, dan mengeluarkan Cortikotropin Releasing Hormon (CRH). Cortikotropin Releasing Hormon (CRH) ini kemudian akan merangsang sekresi dari (Adrenocorticotropic Hormone) ACTH, dimana ACTH kemudian akan menimbulkan rangsangan terhadap sekresi kortisol serta merangsang pengeluaran vasopresin (Sherwood, 2001). Stresor yang bersifat konstan akan mengakibatkan kenaikan kadar kortisol dan berpengaruh secara signifikan pada sistem homeostasis tubuh. Tingginya kadar kortisol ini dapat digunakan sebagai salah satu indikator gangguan psikologis (Silverthorne, 2001).
2.1.2 Terapi depresi
Obat-obatan yang digunakan dalam pengobatan depresi dikenal sebagai obat antidepresan. Berdasarkan mekanisme kerjanya obat-obat antidepresan dapat dibedakan menjadi beberapa golongan besar seperti Selective Serotonin Reuptake Inhibitors (SSRI), Serotonine Norepinephrine Reuptake Inhibitor (SNRI), Inhibitor Monoamin Oksidase, Antagonis 5-HT2, Antidepresan Tetrasiklik dan Unisiklik.
A. Selective Serotonin Reuptake Inhibitors (SSRI)
Golongan obat SSRI bekerja secara spesifik menghambat ambilan serotonin oleh pengangkut serotonin. Pengangkut serotonin merupakan suatu glikoprotein transmembran yang terbenam di membran ujung akson dan badan sel neuron yang melakukan pelepasan serotonin di dalam sel (Syarif et al., 2011). Selektive Serotonin Reuptake Inhibitors (SSRI) secara alosteris menghambat pengangkutan dengan mengikat reseptor di luar tempat pengikatan aktif untuk serotonin.
Selektive Serotonin Reuptake Inhibitors (SSRI) memiliki efek paling ringan pada neurotransmiter lain (Syarif et al., 2011). Obat ini memiliki afinitas tinggi terhadap reseptor monoamin tetapi tidak memiliki afinitas terhadap adrenoreseptor α, histamin, muskarinik atau asetilkolin yang dijumpai pada antidepresan trisiklik (TCA) (Tjad dan Rahadja, 2010; Syarif et al., 2011;
Katzung et al., 2014).
Beberapa obat yang termasuk kedalam golongan SSRI adalah fluoksetin, paroksetin, sertralin, fluvoksamin, sitalopram dan esitalopram. SSRI memiliki masa kerja yang panjang antara 15-24 jam, karena memiliki waktu paruh eliminasi yang lebih panjang (Syarif et al., 2011). Efek samping yang sering ditimbulkan akibat penggunaan golongan obat ini yaitu mual, penurunan libido dan gangguan fungsi seksual lainnya (Syarif et al., 2011).
B. Serotonine Norepinephrine Reuptake Inhibitor (SNRI)
Serotonine Norepinephrine Reuptake Inhibitor (SNRI) bekerja dengan melakukan pengikatan pada pengangkut serotonin dan pengangkut norepinefrin (Tjad dan Rahadja, 2010). Pengangkut norepinefrine secara struktur sangat mirip
dengan pengangkut serotonin. Pengangkut norepinefrine adalah suatu kompleks transmembran yang secara alosteris mengikat norepinefrin. Pengangkut norepinefrin juga memiliki afinitas ringan terhadap dopamin. Afinitas sebagian besar SNRI cenderung lebih besar untuk pengangkut serotonine daripada untuk pengangkut norepinefrine. Serotonine Norepinephrine Reuptake Inhibitor (SNRI) tidak memiliki efek antihistamin, menghambat adrenergik-α, dan antikolinergik poten seperti yang dimiliki oleh obat antidepresan trisiklik (Tjad dan Rahadja, 2010).
C. Inhibitor monoamin oksidase.
Golongan obat inhibitor monoamin-oksidase (MAOI) telah digunakan sebagai antidepresan sejak 15 tahun lalu, akan tetapi kini jarang digunakan karena toksisitas dan besarnya kemungkinan interaksi obat dan makanan yang fatal.
Pemakaian utamanya saat ini adalah untuk mengobati depresi yang tidak responsif terhadap antidepresan lain (Katzung et al., 2014).
Obat golongan MAOI bekerja dengan mengurangi kerja monoamin oksidase di neuron dan meningkatkan kandungan monoamin. (Katzung et al., 2014).
Monoamin oksidase dalam tubuh berfungsi dalam proses deaminasi oksidatif katekolamin di mitokondria. Proses ini dihambat oleh MAOI karena terbentuk suatu kompleks antara MAOI dan MAO yang mengakibatkan terjadinya peningkatan kadar epinefrin, norepinefrin, dan serotonin (Syarif et al., 2011).
Inhibitor monoamine oksidase (MAOI) tidak hanya menghambat MAO, tetapi juga menghambat enzim-enzim lain yang mengakibatkan terganggunya metabolisme banyak obat di hati, dimana penghambatan enzim ini sifatnya
ireversibel. Penghambatan akan mencapai puncaknya dalam beberapa hari, tetapi efek antidepresinya baru terlihat setelah 2-3 minggu, sedangkan pemulihan metabolisme katekolamin baru terjadi setelah obat dihentikan 1-2 minggu (Syarif et al., 2011).
Penggunaan obat golongan MAOI sebagai antidrepresan kini sudah sangat terbatas karena diketahui memiliki efek toksik, dan banyak keadaan depresi yang tidak dapat diubah sama sekali. Efek samping yang sering terjadi pada penggunaan obat ini yaitu terjadinya hipotensi dan hipertensi. Hipertensi dapat disebabkan oleh tertimbunnya katekolamin di dekat reseptor. Hipotensi mungkin terjadi karena menghambat MAO mencegah pelepasan norepinefrin dari ujung saraf. Efek samping MAOI yang lain yaitu berupa gejala tremor, insomnia, dan konvulsi. Adapun beberapa contoh obat golongan ini yaitu moclobemida dan nialamid (Tjad dan Rahadja, 2010; Syarif et al., 2011).
D. Antagonis 5-HT2
Dua antidepresan yang diduga bekerja sebagai antagonis di reseptor 5-HT2
yaitu trazodon dan nefazodon. Struktur trazodon mencakup sebuah gugus triazolon yang diduga berperan menghasilkan efek antidepresan. Trazodon menimbulkan kantuk berat serta tidak menyebabkan toleransi atau ketergantungan. Nefazodon sendiri sudah jarang digunakan karena diketahui bersifat hepatotoksik. Trazodon dan nefazodon cepat diserap dan mengalami metabolisme ekstensif di hati. Kedua obat ini banyak terikat ke protein dan memiliki ketersediaan hayati terbatas karena metabolismenya yang ekstensif, serta memiliki waktu paruh yang singkat (Katzung et al., 2014).
E. Antidepresan tetrasiklik dan unisiklik
Beberapa antridepresan tidak benar-benar pas untuk dimasukkan ke dalam penggolongan obat-obat antidepresan lain, seperti bupropion, mirtazapin, amoksapin, dan maprotilin. Bupoprion memiliki sebuah struktur aminoketon unisiklik yang menyebabkan profil efek sampingnya berbeda dibandingkan kebanyakan obat antidepresan. Bupropion memiliki struktur kimiawi yang agak mirip dengan amfetamin dan bekerja sebagai stimulan karena berefek pada pengaktifkan susunan saraf pusat (SSP). Mirtazapin, amoksapin, dan maprotilin memiliki struktur tetrasiklik. Amoksapin dan maprotilin memiliki kemiripan struktur dan efek samping yang setara dengan antidepresan trisiklik (Katzung et al., 2014).
2.1.3 Amitriptilin
Amitriptilin derivat dibenzosikloheptadin merupakan antidepresan klasik yang karena struktur kimianya disebut sebagai antidepresan trisiklik. Obat ini termasuk salah satu obat yang paling banyak digunakan sebagai terapi depresi dan digunakan sebagai pengganti MAO-Inhibitor yang tidak banyak digunakan lagi (Syarif et al., 2011).
Obat ini berkerja dengan menghambat ambilan kembali neurotransmiter di otak, dimana terjadi hambatan re-uptake dari noradrenalin dan serotonin diotak..
Perbaikan berwujud sebagai perbaikan suasana perasaan (mood), bertambahnya aktivitas fisik, kewaspadaan mental, perbaikan nafsu makan, dan pola tidur yang lebih baik (Syarif et al., 2011). Amitriptilin memiliki efek antihistamin dan antikolinergis, juga sedatif kuat, sehingga baik diberikan pada pasien agresif. Pada
manusia normal amitriptilin menimbulkan rasa lelah, obat tidak meningkatkan alam perasaan (elevation of mood), dan meningkatnya rasa cemas disertai gejala yang menyerupai efek atropin. Pemberian berulang selama beberapa hari akan memperberat gejala ini dan menimbulkan kesukaran konsentrasi dan berpikir.
Sebaliknya bila obat diberikan untuk jangka lama pada pasien depresi, terjadi peningkatan alam perasaan. Amitriptilin mempengaruhi saraf otonom dimana memperlihatkan efek antimuskarinik, sehingga dapat mengakibatkan penglihatan kabur, mulut kering, obstipasi, dan retensi urin. Selain itu amitriptilin juga sering menimbulkan hipotensi ortostatik (Syarif et al., 2011).
Resorpsi amtriptilin dari usus cepat dengan bioavailabilitas 40% dan persentase pengikatan protein diatas 90%, plasma t1/2nya rata-rata 15 jam. Dalam hati sebagian besar zat didemetilasi menjadi metabolit aktif nortriptilin dengan daya sedatif lebih ringan, yang memiliki waktu paruh (t1/2) rata-rata 36 jam.
Ekskresinya berlangsung terutama lewat saluran kemih. Dosis yang biasa diberikan pada depresi yaitu 3 kali sehari 25 mg, bila perlu dinaikkan berangsur- angsur sampai 150-300 mg. Intramuscular/intravena 4 kali sehari 20-30 mg (Syarif et al., 2011).
2.2 Pandan Wangi (Pandanus amaryllifolius R.) 2.2.1 Taksonomi tanaman
Gambar 2.1
Foto Tanaman Pandan wangi (Dalimartha, 2009)
Taksonomi tanaman pandan wangi (Pandanus amaryllifolius R.) adalah sebagai berikut :
Divisi : Magnoliophyta Kelas : Liliopsida Ordo : Pandanales Familia : Pandanaceae Genus : Pandanus
Spesies : Pandanus amaryllifolius
(Rohmawati, 1995)
2.2.2 Morfologi tanaman
Pandan wangi merupakan tumbuhan berupa semak atau pohon yang tegak dengan tinggi 3-7 meter, kadang memiliki cabang, dengan batang berduri, dan
memiliki akar tunjang disekitar pangkal batang. Daun pandan wangi dewasa umumnya memiliki panjang 2-3 meter, lebar 8-12 cm; daun tunggal, duduk, dengan pangkal memeluk batang; helai daun berbentuk pita, bertulang sejajar, memiliki ujung daun berbentuk segitiga lancip, tepi daun dan ibu tulang daun bagian bawah berduri, berwarna hijau muda-hijau tua dengan tekstur daun berlilin. Bunga pandan wangi jantan dan betina terdapat pada tumbuhan yang berbeda, memiliki buah yang letaknya terminal atau lateral, soliter atau berbentuk bulir atau malai yang besar (Rahayu dan Handayani,2008).
2.2.3 Kandungan kimia dan aktivitas farmakologi
Daun pandan wangi memiliki berbagai kandungan kimia dengan aktivitas farmakologi yang beragam. Bagian daun dari tanaman pandan wangi memiliki aroma khas, yang diketahui berasal dari kandungan senyawa 2-acetyl-1-pyrroline (ACPY). Senyawa ini juga terdapat pada tanaman melati, hanya saja memiliki konsentrasi yang lebih rendah dibandingkan pada tanaman pandan wangi (Cheetangdee dan Sinee, 2006).
Daun pandan wangi mengandung senyawa kimia seperti alkaloid saponin, polifenol, flavonoid, kumarin, terpen dan terpenoid, essential oils, karotenoids, kuercetin (Lee et al., 2004;Lopez dan Nonato, 2005). Beberapa golongan alkaloid yang ditemukan pada ekstrak daun pandan wangi yaitu norpandamarilactonine- A,-B, pandamarilactam, pandamarilacton-1, pandamarine, pandanamine, pandamarilactonine, serta piperidin. Berdasarkan penelitian Agustiningsih et al., (2010) disebutkan bahwa daun pandan wangi memiliki kandungan flavonoid yang cukup tinggi dimana hasil maserasi daun pandan wangi dengan etanol 96%
mengandung kadar fenolik total sebesar 478,762 mg/g dan kadar flavonoid total 99,408 mg/g.
Daun pandan wangi sebelumnya telah banyak digunakan dalam pengobatan tradisional antara lain untuk menyegarkan tubuh, menurunkan demam, mengatasi kerontokan, dan sebagai penenang. Kandungan minyak atsiri dari daun pandan wangi diketahui memiliki aktivitas sebagai stimulan, serta efektif untuk mengurangi sakit kepala, dan epilepsi (Cheeptham dan Towers, 2002).
Berdasarkan beberapa penelitian yang telah dilakukan diketahui juga bahwa daun pandan wangi memiliki efek sedatif hipnotik. Efek sedatif hipnotik ditunjukkan pada pemberian ekstrak daun pandan wangi 6 mg/g BB yang terbukti memperpanjang lama waktu tidur mencit Balb/c. Efek ini diduga karena kandungan senyawa alkaloid pada ekstrak pandan wangi yang berpengaruh pada reseptor gamma-aminobutyric acid (GABA), dimana reseptor GABA merupakan target penting untuk komponen sedatif-hipnotik (Dewi, 2009).
2.2.4 Mekanisme zat aktif daun pandan wangi (Pandanus amaryllifolius L.) sebagai antidepresan.
Daun pandan wangi memiliki beberapa komponen zat aktif yang pada tanaman lain memiliki mekanisme tersendiri sebagai antidepresan. Beberapa komponen zat aktif tersebut antara lain yaitu alkaloid, flavonoid, glikosida, saponin, dan terpenoid (Lopez dan Nonato, 2005).
Senyawa aktif golongan alkaloid telah lama diketahui memiliki salah satu khasiat sebagai stimulansia, dapat meningkatkan kesadaran dengan menstimulasi neuron (khususnya kolinergik) yang bertanggung jawab meningkatkan kesadaran.
Alkaloid memperlihatkan efek antidepresan sebagai invers agonis dari reseptor benzodiazepine, menurunkan kadar hormon adrenokortikotropic, menghambat enzim MAO, berperan dalam peningkatan dari kadar serotonin dan BDNF level diotak (Lee et al., 2005; Fortunato et al., 2010; Mao et al., 2011).
Beberapa derivat flavon pada daun pandan wangi dapat bertindak sebagai ligan pada reseptor GABA dalam susunan saraf pusat dan berikatan dengan benzodiazepin binding site sehingga menghasilkan efek antidepresan pada hewan uji (Marder dan Paladini, 2002). Flavonoid sendiri telah diteliti secara luas memiliki efek antidepresan. Flavonoid berperan dalam peningkatan kadar serotonin, norepinefrin dengan menurunkan aktivitas monoamine oksidase dan meningkatkan kadar BDNF seperti reseptor glukokortikoid serta dapat meningkatkan diferensiasi neuronal dan plasticity.
Tanin memberikan aktivitas antidepresan dengan meningkatkan kadar monoamine diotak serta memberikan efek neuroprotektif. Saponin menunjukkan efek antidepresan dengan meningkatkan kadar monoamine dan mempengaruhi mekanisme melalui jalur signaling BDNF, HPA axis, dan neurogenesis hipokampus (Shekar et al. 2012; Bahramsoltani et al., 2015).
Terpenoid memberikan efek antidepresan dengan melibatkan reseptor DA, D1 dan D2, tetapi tidak memiliki interaksi dengan reseptor noradrenergik atau jalur sintesis 5-HT. Terpenoid juga bekerja dengan meningkatkan kadar NE dan 5-HT di otak (Bahramsoltani et al., 2015).
3.1 Kerangka Berpikir
Depresi merupakan gangguan heterogen yang berkaitan dengan alam perasaan, emosional dan jiwa. Pengobatan depresi hingga kini menggunakan obat- obatan antidepresan dengan berbagai efek samping yang cukup mengganggu pasien terutama dalam pemakaian jangka panjang.
Pada depresi terjadi ketidaknormalan pada kadar serotonin, norepinefrin, dan dopamin pada darah, urin, serta cairan serebrospinalis, dan perubahan hormon seperti peningkatan kadar kortisol. Tujuan utama dari terapi pada depresi yaitu untuk mengembalikan abnormalitas yang terjadi, dengan meningkatkan ketersediaan monoamine melalui inhibisi aktivitas serotonin transporter (SERT), norepinefrin transpoter (NET), atau kedua pengangkut monoamin, serta dengan inhibisi penguraian enzimatik monoamin oksidase.
Salah satu bahan alami yang diduga memiliki aktivitas antidepresan yaitu ekstrak etanol daun pandan wangi. Ekstrak daun pandan wangi diketahui mengandung berbagai metabolit sekunder yang pada tanaman lain telah dibuktikan memiliki aktivitas antidepresan. Berbagai metabolit sekunder tersebut antara lain yaitu alkaloid, flavonoid, glikosida, lignan, saponin dan terpenoid, dengan mekanisme kerja yang hampir menyerupai efek pada pemberian amitriptilin.
Alkaloid diketahui melakukan penghambatan terhadap enzim monoamine
axis. Flavonoid bekerja dengan mempengaruhi peningkatan serotonin, norepinefrin, dan kadar BDNF, serta menurunkan aktivitas monoamine oxidase.
Kuersetin bekerja dengan menurunkan biomarker dari inflamasi, seperti TNF-α dan IL-6, serta menunjukkan efek neuroprotektif. Tanin mampu meningkatkan kadar monoamine di otak dan memberikan efek neuroprotektif. Saponin diketahui mempengaruhi jalur signaling BDNF, HPA axis, serta meningkatkan kadar monoamin. Terpenoid bekerja dengan melibatkan reseptor dopamin, serta meningkatkan kadar norepinefrine otak dan kandungan serotonine.
Berdasarkan aktivitas farmakologi dari beberapa metabolit sekunder yang terdapat pada ekstrak daun pandan wangi tesebut, diduga ekstrak daun pandan wangi dapat memberikan aktivitas antidepresan yang cukup baik.
3.2 Konsep Penelitian
Keterangan:
: tidak diteliti : diteliti 3.3 Hipotesis
Hipotesis dalam penelitian ini antara lain:
1. Ekstrak etanol daun pandan wangi (Pandanus amaryllifolius R.) 10%
dapat menurunkan immobility time tikus jantan galur wistar yang depresi.
2. Ekstrak etanol daun pandan wangi (Pandanus amaryllifolius R.) 10%
dapat menurunkan kadar kortisol tikus jantan galur wistar yang depresi.
Ekstrak Etanol Daun Pandan Wangi (Pandanus amaryllifolius (R.)
Faktor Internal:
- Genetik - Biologi - Psikososial
Faktor Eksternal - Obat
- Herbal
Tikus Depresi - Immobility time - Kadar Kortisol
4.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan suatu penelitian eksperimental laboratorik dengan menggunakan pretest-postest control group design. Secara garis besar rancangan penelitian yang dilakukan adalah sebagai berikut:
Gambar 4.1 Rancangan Penelitian Keterangan:
P : Populasi R : Random S : Sampel
Ra : Ramdom alokasi
TST : Metode induksi depresi dengan Tail Suspention Test
O1 : Observasi pretest immobility time dan kadar kortisol kelompok P1 O3 : Observasi pretest immobility time dan kadar kortisol kelompok P2
O5 : Observasi pretest immobility time dan kadar kortisol kelompok P3
P S
O 1
O 3
O 5
O 7
O 2
O 4
O 6
O 8 TST
TST TST
P1
P2
P3
P4
R Ra
O7 : Observasi pretest immobility time dan kadar kortisol kelompok P4 O2 : Observasi posttest immobility time dan kadar kortisol kelompok P1 O4 : Observasi posttest immobility time dan kadar kortisol kelompok P2 O6 : Observasi posttest immobility time dan kadar kortisol kelompok P3 O8 : Observasi posttest immobility time dan kadar kortisol kelompok P4
4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian 4.2.1 Tempat penelitian
Penelitian dilaksanakan dibeberapa tempat seperti berikut :
1. Determinasi tanaman pandan wangi (Pandanus amaryllifolius R.): di UPT Balai Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Eka Karya Bali.
2. Pembuatan ekstrak etanol 96% daun pandan wangi (Pandanus amaryllifolius R.): di Laboratorium Farmakognosi dan Fitofarmasi Jurusan Farmasi Fakultas MIPA Universitas Udayana.
3. Uji aktivitas antidepresan ekstrak etanol 96% daun pandan wangi (Pandanus amaryllifolius R.): di Animal Laboratorium Unit Jurusan Farmasi Fakultas MIPA Universitas Udayana.
4. Analisis kadar kortisol: Di Bagian Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Udayana.
4.2.2 Waktu penelitian
Penelitian dilakukan pada Bulan September 2015-Mei 2016.
4.3 Penentuan Sumber Data 4.3.1 Besar sampel
Perhitungan besar sampel dihitung berdasarkan rumus Frederer (Hanafiah, 2004).
Rumus:
(n-1) (r-1) ≥ 15 (n-1) (4-1) ≥ 15 (n-1) ≥ 5 n ≥ 6 Keterangan :
n : jumlah ulangan (replikasi) r : jumlah perlakuan
Berdasarkan perhitungan diatas, besar sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah 6 per kelompok. Untuk menghindari drop out pada sampel ditambahkan 20% sehingga jumlah sampel menjadi 7. Jadi jumlah sampel seluruhnya adalah 28 ekor.
4.3.2 Kriteria sampel
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah tikus galur Wistar yang memenuhi kriteria sebagai berikut:
Kriteria Inklusi:
a. Tikus putih jantan depresi b. Memiliki umur 2-3 bulan
c. Berat badan tikus berkisar 150-250 gram
Kriteria drop out subjek penelitian a. Tikus mati/sakit saat penelitian 4.4 Variabel Penelitian
4.4.1 Variabel bebas
Pemberian ekstrak etanol daun pandan wangi (Pandanus amaryllifolius R.) 10%.
4.4.2 Variabel terikat
Immobility time, kadar kortisol.
4.4.3 Variabel terkendali
Tikus (galur, jenis kelamin, umur, berat badan, sehat), asal tanaman, bagian tanaman yang digunakan.
4.5 Definisi Operasional
1. Ekstrak etanol daun pandan wangi adalah ekstrak kental yang dibuat dari hasil maserasi daun pandan wangi menggunakan pelarut etanol 96%, pada suhu kamar, dengan konsentrasi ekstrak 10%.
2. Tikus depresi merupakan tikus jantan galur wistar sehat yang mengalami peningkatan immobility time dan kadar kortisol setelah diinduksi depresi dengan metode tail suspetion test, dimana ekor tikus digantung pada tiang dengan ketinggian 50 cm selama 3 menit setiap hari dalam 10 hari.
3. Immobility time merupakan waktu putus asa tikus yang diukur menggunakan metode force swimming test saat hewan tidak bergerak didalam air, dengan satuan detik diukur pada hari ke-10 (pretest) dan hari ke-25 (posttest).
4. Kadar kortisol adalah kadar kortisol darah tikus yang diukur pada pagi hari, pada hari ke-10 (pretest) dan hari ke-25 (posttest) dengan metode enzyme immune assay (ELISA) dalam satuan ng/ml.
4.6 Alat dan Bahan Penelitian 4.6.1 Alat penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu pipet tetes, batang pengaduk, sendok tanduk, cawan porselen, gelas ukur, gelas beker, termometer, timbangan elektrik (ADAM AFP-360L), vacum rotary evaporator, toples tanpa tutup, stopwatch, kandang plastik, ember, tiang penggantung, tabung transparan, ELISA reader.
4.6.2 Bahan penelitian
Bahan tanaman yang digunakan yaitu daun pandan wangi yang berasal dari wilayah Abiansemal, Bali. Pelarut yang digunakan dalam proses maserasi daun pandan wangi adalah etanol 96% (teknis, Brataco). Bahan yang digunakan dalam proses pengujian aktivitas antidepresan yaitu amitriptilin tablet 25 mg, ektrak etanol daun pandan wangi, aquadest, CMC-Na, ELISA Sigma Aldrich Kortisol Kitt.
4.7 Prosedur Penelitian 4.7.1 Determinasi tanaman
Determinasi daun pandan wangi dilakukan di Balai Konservasi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia Kebun Raya Eka Karya Bedugul, Bali.
4.7.2 Pengumpulan dan preparasi sampel
Sampel yang digunakan merupakan daun pandan wangi (Pandanus amaryllifolius R.) yang dipanen dari kawasan Abiansemal, Badung Bali. Daun pandan yang dipilih yaitu daun segar yang memiliki warna hijau tua dan ukuran yang relatif sama.
4.7.3 Pembuatan ekstrak etanol daun pandan wangi
Daun pandan wangi segar yang telah dikumpulkan, dibersihkan terlebih dahulu dan dipilih daun yang memenuhi persyaratan sebagai simplisia. Daun pandan wangi selanjutnya diiris tipis, dan dirajang hingga menyerupai serbuk.
Serbuk simplisia segar dari daun pandan wangi kemudian ditimbang sebanyak 100 gram untuk dilakukan proses maserasi dengan 300 mL etanol 96%. Ekstrak yang diperoleh kemudian diuapkan menggunakan vacum rotary evaporator pada suhu 40°C hingga diperoleh ekstrak kental (Agustiningsih, 2010).
4.7.4 Skrining fitokimia ekstrak etanol daun pandan wangi
Uji fitokimia pada ekstrak etanol daun pandan wangi (Pandanus amaryllifolius R.) meliputi pemeriksaan alkaloid, flavonoid, saponin, tanin, polifenol, steroid dan triterpenoid.
A. Pembuatan larutan uji fitokimia
Pembuatan larutan uji untuk skrining fitokimia dilakukan dengan melarutkan 500 mg ekstrak etanol daun pandan wangi (Pandanus amaryllifolius R.) dalam 50 mL etanol 96%.
B. Pemeriksaan alkaloid
Sebanyak 2 mL larutan ekstrak uji diuapkan diatas cawan porselin hingga diperoleh residu. Residu kemudian dilarutkan dengan 5 mL HCL 2N. Larutan yang didapat kemudian di bagi ke dalam 3 tabung reaksi. Tabung pertama ditambahkan dengan asam encer yang berfungsi sebagai blanko. Tabung kedua ditambahkan pereaksi Dragendroff sebanyak 3 tetes dan tabung ketiga ditambahkan pereaksi Mayer sebanyak 3 tetes. Terbentuknya endapan jingga pada tabung kedua dan endapan kuning pada tabung ketiga menunjukkan adanya alkaloid (Tiwari et al., 2011).
C. Pemeriksaan flavonoid
Sebanyak 1 mL larutan ekstrak uji, basahkan sisanya dengan aseton P, tambahkan sedikit serbuk halus asam borat P dan serbuk halus asam oksalat P, panaskan hati-hati diatas tangas air dan hindari pemanasan berlebihan. Campur sisa yang diperoleh dengan 10 mL eter P. Amati dengan sinar UV 366 nm; larutan berfluoresensi kuning intensif, menunjukkan adanya flavonoid (Tiwari et al., 2011).
D. Pemeriksaan saponin
Sebanyak 10 mL larutan ekstrak uji dalam tabung reaksi dikocok vertikal selama 10 detik kemudian dibiarkan selama 10 detik. Pembentukan busa setinggi 1-10 cm yang stabil selama tidak kurang dari 10 menit, menunjukkan adanya saponin. Pada penambahan 1 tetes HCL 2N, busa tidak hilang (Tiwari et al., 2011).
E. Pemeriksaan tanin dan polifenol
Sebanyak 3 mL larutan ekstrak uji dibagi kedalam 3 bagian yaitu tabung A, tabung B, tabung C. Tabung A digunakan sebagai blanko, tabung B direaksikan dengan larutan besi (III) klorida 10%, warna biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan adanya tanin dan polifenol, sedangkan pada tabung C hanya ditambahkan garam gelatin. Apabila terbentuk endapan pada tabung C maka larutan ekstrak positif mengandung tanin (Marliana et al., 2005; Tiwari et al., 2011).
F. Pemeriksaan steroid dan triterpenoid
Pemeriksaan steroid dan triterpenoid dilakukan dengan reaksi Lieberman-Burchard. Sebanyak 2 mL larutan uji diuapkan dalam cawan penguap.
Residu dilarutkan dengan 0,5 mL kloroform, tambahkan 0,5 mL asam asetat anhidrat. Selanjutnya ditambahkan 2 mL asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Terbentuknya cincin kecoklatan atau violet pada perbatasan larutan menunjukkan adanya triterpenoid, sedangkan bila muncul cincin biru kehijauan menunjukkan adanya steroid (Tiwari et al., 2011).
4.7.5 Uji aktivitas antidepresan ekstrak etanol daun pandan wangi
Uji aktivitas antidepresan dilakukan dengan menggunakan metode tail suspension test dan force swimming test. Hewan yang telah diadaptasi selama 1 minggu dibuat stress dengan cara menggantung ekor tikus (tail suspension test) selama 3 menit dalam 10 hari, kemudian ekstrak etanol daun pandan wangi diberikan selama 14 hari pada hari ke 11 sampai hari ke 25 dan selanjutnya diukur immobility time seluruh kelompok dengan metode force swimming test.
Pemeriksaan juga dilakukan terhadap kadar kortisol dari hewan uji dengan metode Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA).
A. Pengelompokan subjek uji
Pada penelitian ini digunakan 28 ekor hewan uji yang dibagi menjadi 4 kelompok masing-masing kelompok terdiri atas 7 ekor tikus.
a. Kelompok perlakuan 1 (P1) : kelompok tikus normal yang tidak memperoleh induksi depresi dan tidak memperoleh perlakuan.
b. Kelompok perlakuan 2 (P2) : kelompok tikus depresi yang memperoleh pemberian placebo CMC-Na 1%.
c. Kelompok perlakuan 3 (P3) : kelompok tikus depresi yang memperoleh pemberian amitriptilin dalam pelarut CMC-Na 1%.
d. Kelompok perlakuan 4 (P4) : kelompok tikus depresi yang memperoleh pemberian ekstrak etanol daun pandan wangi (Pandanus amaryllifolius R.) 10% dalam pelarut CMC-Na 1%.
B. Perlakuan hewan uji
Tikus putih jantan galur Wistar yang digunakan diadaptasi terlebih dahulu selama satu minggu dalam kandang plastik dengan ukuran ±1200 cm2 dengan alas berupa sekam yang bagian atasnya diberi kawat sebagai penutup. Hewan uji diberi pakan berupa pellet dengan memperhatikan kadar protein 20-25%, lemak 5%, pati 40-45%, serat kasar 5%, vitamin serta mineral. Setiap harinya tikus yang digunakan dalam penelitian diberi makan antara 12-20 gram serta diberikan air ad libitum (Smith dan Mangkoewidjojo, 2000). Adapun metode euthanasia yang digunakan pada penelitian ini yaitu dengan metode kimia, dimana hewan uji
diberikan ketamine dengan dosis tiga kali dosis untuk mencapai efek anestesi atau dua kali dosis LD50.
C. Penentuan dosis
a. Penentuan dosis ekstrak etanol daun pandan wangi
Ekstrak daun pandan wangi diberikan secara peroral satu kali sehari pada hewan uji. Ekstrak daun pandan wangi yang diberikan yaitu dengan konsentrasi 10% dalam pensuspensi CMC-Na 1%
Perhitungan pembuatan ekstrak daun pandan wangi:
Pembuatan larutan CMC Na 1% sebagai pelarut: 1 𝑔 𝐶𝑀𝐶 𝑁𝑎 100 𝑚𝐿 𝑎𝑖𝑟
Pembuatan larutan stok ekstrak konsentrasi 10% : 10 𝑔 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘
100 𝑚𝐿 𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡𝑎𝑛 𝐶𝑀𝐶 𝑁𝑎 1%
Volume cairan maksimal yang dapat diberikan pada tikus putih yaitu 5mL/200 g BB (Ngatidjan, 2006).
b. Penentuan dosis amitriptilin
Pada penelitian ini obat antidepresan yang digunakan yaitu amitriprilin sebagai kontrol positif. Dosis lazim yang digunakan untuk manusia dewasa yaitu 25 mg. Faktor konversi dari manusia (70 kg) ke tikus (200 g) adalah 0,018, maka dosis yang diberikan kepada tikus yaitu :
70
50× 25 mg × 0,018 = 0,63 mg/200 gBB
Berdasarkan perhitungan tersebut maka dosis amitriptilin yang diberikan pada tikus uji yaitu 0,63 mg/ 200 gBB.
D. Tail suspention test
Uji penggantungan ekor (tail suspension test) dilakukan pada hewan uji yang digunakan dengan cara menggantung ekor tikus pada tiang setinggi 50 cm selama 3 menit setiap hari, dimana perlakuan ini dilakukan selama 10 hari (Swati et al., 2013).
E. Uji berenang paksa (Force Swimming Test)
Force swimming test merupakan salah satu metode yang biasa digunakan untuk mengukur efek suatu obat antidepresan pada hewan uji. Khasiat dari suatu obat antidepresan diukur melalui lama immobility time yang lebih singkat dibandingkan dengan kelompok uji yang tidak diberikan obat antidepresan atau ekstrak yang berfungsi sebagai antidepresan (Swati et al., 2013).
Hewan coba yang telah diinduksi depresi dimasukkan ke dalam tabung terbuka (diameter 10 cm, tinggi 25 cm) yang berisi air dengan ketinggian 15 cm.
Tes ini berdurasi selama 8 menit dan dilakukan pengukuran immobility time pada 6 menit terakhir (Swati et al., 2013).
Pengukuran immobility time dinilai pada saat hewan uji tidak bergerak di dalam air. Setiap hewan uji itu dinilai tidak bergerak ketika berhenti berjuang dan tetap mengambang bergerak di dalam air, hanya membuat gerakan-gerakan diperlukan untuk menjaga kepala diatas air. Penurunan durasi immobility time selama forced swimming test (FST) dapat diambil sebagai tanda ukuran antidepresan (Zomkowski et al., 2004).
F. Pengukuran kadar kortisol
Konsentrasi kortisol dari serum darah hewan uji diukur dengan metode Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA). Hewan uji dianestesi terlebih dahulu menggunakan ketamine dengan dosis 50 mg/kg BB secara intramuscular (Santoso, 2011). Pengambilan darah dilakukan melalui jantung pada pagi hari sebanyak ± 1 mL, pada hari ke 10 setelah induksi depresi dilakukan dan hari ke 25 setelah perlakuan uji selesai.
a. Preparasi sampel
Darah yang telah diambil dari hewan uji dimasukkan kedalam tabung eppendorf dan dilakukan pemusingan (sentrifugasi) selama 15 menit dengan kecepatan 6000 rpm. Dilakukan pemisahan, dan diambil bagian yang berada di lapisan atas (serum) untuk analisis pemeriksaan kortisol. Serum disimpan sebelum dianalisis pada suhu -20˚ dalam lemari pendingin.
b. Pengukuran kuantitatif dengan metode ELISA
Serum yang telah diperoleh dilakukan pengukuran dengan metode ELISA.
Persiapan awal dalam pengukuran ini yaitu memastikan semua reagen berada pada temperatur 2-8˚C sebelum digunakan. Didalam mikroplate yang digunakan telah dilakukan coated antibodi monoklonal yang spesifik terhadap kortisol.
Sampel, kortisol standar, dan kontrol sebanyak 25 µL kemudian dimasukkan kedalam well, dilakukan penambahan kortisol enzim konjugat 100µL ke dalam masing-masing well, dan dilakukan inkubasi selama 60 menit pada suhu ruangan (18-26˚C). Proses selanjutnya yaitu pencucian sebanyak 3 kali, dengan larutan pencuci buffer sebanyak 300 µL untuk tiap 1 kali proses pencucian. Ditambahkan
100 µL antibody biotinylated (TMB) pada seluruh well dan diinkubasi kembali selama 15 menit pada suhu ruangan (18-26˚C) pada temperatur ruangan. Tahapan selanjutnya yaitu dilakukan pengeringan dengan kertas pengering khusus, dan ditambahkan larutan stop solution pada seluruh well sebanyak 50 µL, dilakukan pengocokan perlahan pada plate agar larutan tercampur, dan didiamkan selama 20 menit. Pada tahapan akhir dilakukan pembacaan dengan ELISA reader pada panjang gelombang 450 nm.
4.8 Analisis Data
Pada penelitian ini dilakukan analisis data secara statistik menggunakan aplikasi SPSS 16 for Windows. Data yang diperoleh seperti immobility time dan kadar kortisol dianalisis dengan langkah sebagai berikut:
1. Analisis deskriptif
Berdasarkan analisis deskriptif diperoleh nilai rerata dan standar deviasi (SD) tiap variabel dari masing-masing kelompok perlakuan.
2. Uji Normalitas
Uji normalitas dilakukan dengan uji Shapiro Wilk karena sampel yang digunakan < 30. Uji ini dilakukan untuk mengetahui apakah data terdistribusi normal atau tidak. Data ini berdistribusi normal dengan nilai p > 0,05.
3. Uji Homogenitas
Pengujian homogenitas dilakukan dengan Levene’s test yang bertujuan untuk mengetahui homogenitas atau varian data yang diperoleh. Varian data ini homogen dengan nilai p > 0,05.
4. Uji Komparasi
a. One-way analysis of variance
Analisis Anova dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya perbedaan antar kelompok uji, dimana α=0,05. Pada penelitian ini dilakukan analisis Anova karena data yang diperoleh memenuhi syarat terdistribusi normal dan homogen.
b. Uji Least Significant Difference (LSD).
Uji ini dilakukan untuk mengetahui pada kelompok mana yang memiliki perbedaan rerata durasi immobility time dan kadar kortisol.
c. T-paired test
Pada data pretest dan posttest yang diperoleh selanjutnya dilakukan uji komparasi pada tiap kelompok perlakuan, untuk mengetahui ada tidaknya perbedaan sebelum dan sesudah perlakuan dilakukan.
4.9 Alur Penelitian
Gambar 4.2.
Skema Kerja Penelitian 28 Ekor Tikus Jantan Galur Wistar
Tumbuhaapoteken Tikus diadaptasi selama 7 hari
P1 (Kontrol Normal)
P2 (Kontrol Negatif)
P3 (Kontrol
Positif)
P4 (Kelompok
Pandan Wangi)
Induksi Depresi dengan Tail Suspention Test
Pretest Immobility Time dan Kadar Kortisol
Analisis data Perlakuan selama 14 hari:
P1 : tidak diberi perlakuan P2 : CMC-Na
P3 : amitriprilin
P4 : ekstrak etanol daun pandan wangi 10%
Posttest Immobility Time dan Kadar Kortisol
5.1.1 Hasil skrining fitokimia
Tabel 5.1
Hasil Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol 96% Daun Pandan Wangi
(aTiwari et al., 2011)
Keterangan: (+) = mengandung senyawa yang dimaksud; (-) = tidak mengandung senyawa yang dimaksud
5.1.2 Analisis desktiptif
Tabel 5.2
Data Immobility Time Pretest dan Posttest
Pretest Kontrol normal Kontrol negatif Kontrol positif
n Rerata (detik) Standar Deviasi
6 88,17 0,47
6 130,67 0,61
6 131,67 0,67
6 130,33 0,71
Posttest Kontrol normal 6 82,67 0,42
Kontrol negatif 6 128,16 0,60
Kontrol positif 6 48,67 0,33
Kelompok pandan wangi 6 71,33 0,49
No Uji Fitokimia Pustaka Hasil Kesimpulan
1. Alkaloid aTerbentuk endapan jingga (pereaksi Dragendroff)
Terbentuk endapan jingga
(+)
aTerbentuk endapan kuning (pereaksi Mayer)
Terbentuk endapan kuning
(-) 2 Flavonoid aFluoresensi kuning intensif pada UV 366
nm
fluoresensi kuning intensif
(+) 3 Saponin aAdanya busa yang bertahan <10 menin
setinggi 1-10 cm dan busa tidak hilang setelah penambahan 1 tetes HCL 2N
Terbentuk busa setinggi 3 cm
(+)
4. Tanin dan Polifenol
Tanin aBiru tua/ hitam kehijauan
Hitam kehijauan (+) Polifenol aBiru tua/hitam
kehijauan
Hitam Kehijauan (+) 5. Steroid dan
triterpenoid
Steroid aTerbentuk cincin biru kehijauan
Terbentuk cincin biu kehijauan
(+) Triterpenoid aTerbentuk cincin
kecoklatan atau violet
Terbentuk cincin kecoklatan/violet
(+)
Data Kadar Kortisol Pretest dan Posttest
Pretest Kontrol normal
n Rerata (ng/mL) Standar Deviasi
6 15,36 0,16
Kontrol negatif 6 20,44 0,15
Kontrol positif 6 20,49 0,22
Kelompok pandan wangi 6 21,00 0,24
Posttest Kontrol normal 6 15,00 0,27
Kontrol negatif 6 20,60 0,11
Kontrol positif 6 12,64 0,27
Kelompok pandan wangi 6 13,74 0,25
5.1.3 Uji normalitas data
Pada penelitian ini uji normalitas dilakukan dengan uji Shapiro Wilk karena sampel yang digunakan kurang dari 30. Data immobility time dan kadar kortisol sebelum perlakuan (pretest) dan sesudah perlakuan (posttest) diuji normalitasnya, dan diperoleh data berdistribusi normal dengan p>0,05. Hasil uji normalitas data immobility time dapat dilihat pada Tabel 5.4 dan hasil uji normalitas data kadar kortisol dapat dihat pada Tabel 5.5
Tabel 5.4
Hasil Uji Normalitas Data Immobility Time
Parameter n p Keterangan
Immobility Time Kelompok normal (pretest) 6 0,421 Normal Immobility Time Kelompok normal (posttest) 6 0,473 Normal Immobility Time Kontrol negatif (pretest) 6 0,212 Normal Immobility Time Kontrol negatif (posttest) 6 0,804 Normal Immobility Time Kontrol positif (pretest) 6 0,505 Normal Immobility Time Kontrol positif (posttest) 6 0,091 Normal Immobility Time Perlakuan pandan wangi (pretest) 6 0,918 Normal Immobility Time Perlakuan pandan wangi (posttest) 6 0,415 Normal
Tabel 5.5
Hasil Uji Normalitas Data Kadar Kortisol
Parameter n p Keterangan
Kadar Kortisol Kelompok normal (pretest) 6 0,186 Normal Kadar Kortisol Kelompok normal (posttest) 6 0,942 Normal Kadar Kortisol Kontrol negatif (pretest) 6 0,411 Normal Kadar Kortisol Kontrol negatif (posttest) 6 0,200 Normal Kadar Kortisol Kontrol positif (pretest) 6 0,069 Normal Kadar Kortisol Kontrol positif (posttest) 6 0,066 Normal Kadar Kortisol Perlakuan pandan wangi (pretest) 6 0,958 Normal Kadar Kortisol Perlakuan pandan wangi (posttest) 6 0,213 Normal
