STUDI KEKERABATAN FENETIK BEBERAPA JENIS TANAMAN SAWO Pouteria (SAPOTACEAE) MENGGUNAKAN METODE RAPD.

(1)

Febriyantie, Vania. 2014

STUDI KEKERABATAN FENETIK BEBERAPA JENIS TANAMAN SAWO Pouteria (SAPOTACEAE) MENGGUNAKAN METODE RAPD

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

STUDI KEKERABATAN FENETIK BEBERAPA JENIS TANAMAN SAWO Pouteria (SAPOTACEAE) MENGGUNAKAN METODE RAPD

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Sebagian dari Syarat

untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains Program Studi Biologi

Oleh:

Vania Febriyantie

1005103

PROGRAM STUDI BIOLOGI JURUSAN PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA

(2)

STUDI KEKERABATAN FENETIK BEBERAPA JENIS

TANAMAN SAWO

Pouteria

_(SAPOTACEAE)

MENGGUNAKAN METODE RAPD

Oleh Vania Febriyantie

Sebuah skripsi yang diajukan untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana pada Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Penetahuan Alam

Oktober 2014

Hak Cipta dilindungi undang-undang.

(3)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu LEMBAR PENGESAHAN

STUDI KEKERABATAN FENETIK BEBERAPA JENIS TANAMAN SAWO Pouteria (SAPOTACEAE) MENGGUNAKAN METODE RAPD

Oleh

Vania Febriyantie

1005103

DISETUJUI DAN DISAHKAN OLEH: Pembimbing I

Dr. Topik Hidayat, M.Si NIP. 197004101997021001

Pembimbing II

Nuryani Y Rustaman, Prof.Dr.M.Pd NIP. 195012311979032029

Pembimbing III

Teguh Triono,Ph.D Tanri Abeng University

(4)

Ketua Jurusan Pendidikan Biologi FPMIPA UPI

Dr. Riandi, M.Si NIP. 196305011988031002

PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi dengan judul “STUDI KEKERABATAN FENETIK BEBERAPA JENIS TANAMAN SAWO Pouteria (SAPOTACEAE) MENGGUNAKAN METODE RAPD” ini beserta seluruh isinya adalah benar-benar karya sendiri, dan saya tidak melakukan penjiplakan atau pengutipan dengan cara-cara yang tidak sesuai dengan etika keilmuan yang berlaku dalam masyarakat keilmuan. Atas pernyataan ini, saya siap menanggung sanksi yang dijatuhkan kepada saya apabila kemudian ditemukan adanya pelanggaran terhadap etika keilmuan dalam karya saya ini atau klaim dari pihak lain terhadap keaslian karya saya ini.

Bandung, September 2014

Yang membuat pernyataan

Vania Febriyantie

(5)

STUDI KEKERABATAN FENETIK BEBERAPA JENIS TANAMAN SAWO Pouteria (SAPOTACEAE) MENGGUNAKAN METODE RAPD

STUDI KEKERABATAN FENETIK BEBERAPA JENIS TANAMAN SAWO Pouteria (SAPOTACEAE) MENGGUNAKAN METODE (RAPD)

ABSTRAK

Pouteria duclitan merupakan tanaman yang termasuk keluarga sawo-sawoan

(famili Sapotaceae). Tanaman ini terdistribusi hampir di seluruh negara tropis termasuk Indonesia, salah satunya dapat ditemukan di Kebun Raya Bogor. Namun, beberapa tanaman yang tumbuh di area dan kondisi lingkungan yang sama yaitu Kebun Raya Bogor memiliki karakter morfologi buah yang berbeda di bandingkan dengan Pouteria duclitan lainnya. Tujuan penelitian ini yaitu untuk menganalisis kekerabatan fenetik beberapa jenis tanaman sawo Pouteria (Sapotaceae) menggunakan metode RAPD (Random Amplified Polymorphic

DNA). Hasil penelitian menunjukkan bahwa primer acak OPB-09 memiliki

persentase tingkat polimorfik yang tinggi sebesar 72,42%, dan berhasil memperoleh 52 larik DNA diantaranya 13 larik monomorfik dan 39 larik polimorfik dari ukuran basa 408 - 3500 pb. Analisis fenetik dengan menggunakan

software MEGA 4 berhasil mengklasifikasi keenam sampel tanaman sawo Pouteria dengan ditandai adanya dua kelompok besar yang terbentuk. P. obovata

dan P. campechiana berada dalam satu kelompok besar, sedangkan beberapa tanaman P. duclitan berada dalam satu kelompok yang berbeda. Hal ini mengindikasikan bahwa P. obovata dan P. campechiana berkerabat jauh dengan

P. duclitan. Data Fenogram juga menunjukkan bahwa P. duclitan 112 A yang

memiliki karakter morfologi buah yang berbeda termasuk ke dalam varietas baru, tetapi pada P. duclitan XXV.B.120 status kekerabatannya belum jelas.

(6)

STUDY PHENETIC OF SEVERAL PLANTS Pouteria (Sapotaceae) USING

RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC (RAPD) METHOD

ABSTRACT

Pouteria duclitan is a member of Sapotaceae family and distributed almost in

tropical country, including Indonesia. In Indonesia, P.duclitan trees could be found in Bogor Botanical Garden, West Java. Some of P. duclitan trees which grow in the same area and environmental conditions has different morphological of fruits compared with another P.duciltan trees. The purpose of this research is to analyse phenetic relationship between several plants Pouteria (Sapotaceae) using RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) method. The result showed that arbitrary primer OPB-09 has high percentage of polymorphic rate was 72,42% and successfully amplified 52 locci, including 13 locci monomorphic and 39 locci polymorphic of base size 408 – 3500 bp. Phenetic analyse using MEGA 4 software successfully classified several sampels of Pouteria into two major groups formed. P. obovata and P campechiana are in the same group, whereas all of P. duclitan samples are in a different group. This indicates that P. obovata and

P. campechiana distantly related to P duclitan. Furthermore, the phenogram also

demonstrated that P. duclitan 112 A is likely to be a new cultivar, but P. duclitan XXV.B.120 remains unclear.

(7)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu DAFTAR ISI

C. Pertanyaan Penelitian ... 4

D. Tujuan Penelitian ... 4

E. Manfaat Penelitian ... 5

F. Batasan Penelitian ... 5

BAB II BIOSISTEMATIKA SAPOTACEAE MENGGUNAKAN PENANDA MOLEKULAR RAPD ... 7

A. Biositematika………..7

1. Analisis Fenetik………7

2. Analisis Filogenetik ... 8

B. Dasar-dasar Teknik Biologi Molekuler ... 10

1. Esktraksi DNA Tanaman……….10

2. Uji Kuantitatif DNA……….11

3. Uji Kualitatif DNA………...13

4. Teknik Dasar Amplifikasi PCR (Polymerase Chain Reaction)…...16

C. Penanda Molekuler………20

1. Penanda Kodominan (co-dominant markers)………..20

a. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)…………20

(8)

2. Penanda Dominan (dominant markers)………...24

a. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)………..…24

b. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)….………26

D. Sapotaceae ... 31

1. Pouteria campechiana ... 33

2. Pouteria duclitan ... 35

3. Pouteria obovata ... 37

E. Penelitian Terkait dengan Pouteria………..38

F. Penelitian Terkait dengan Metode RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)………39

BAB III METODE PENELITIAN ... 42

A. Jenis Penelitian ... 42

B. Populasi dan Sampel ... 42

C. Waktu dan Tempat Penelitian ... 42

D. Alat dan Bahan ... 42

E. Prosedur Penelitian ... 42

1. Tahap Persiapan ... 42

2. Tahap Penelitian ... 43

a. Pengambilan Sampel... 43

b. Isolasi DNA Genom Tanaman ... 43

c. Uji Kuantitatif DNA ... 46

d. Uji Kualitatif DNA (Elektroforesis) ... 46

e. Amplifikasi DNA dengan Metode PCR-RAPD ... 46

f. Uji Kualitatif Hasil PCR………..46

3. Analisis Data………..…48

F. Alur Penelitian ... 50

BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN ... 51

A. Isolasi DNA Genom Tanaman Sawo Pouteria ... ₅₁

(9)

1. Optimasi Kondisi PCR ... ₅₅

2. Seleksi Primer Acak ... ₅₆

3. Amplfikasi DNA dengan Primer Acak OPB-09 ... ₅₇

4. Data Matriks Hasil Interpretasi Larik dan Analisis Data Polimorfisme DNA...58

5. Nilai Polymorphic Information Content (PIC) Primer OPB-09….61 6. Klaster UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Average) ... ₆₂

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 68

A.Kesimpulan ... ₆₈

B. Saran ... 68

DAFTAR PUSTAKA ... 69

(10)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

2. 1 Urutan Pengenalan untuk Beberapa Enzim Restriksi Endonuklease ... 22

2.2 Perbandingan Beberapa Jenis Penanda Genetik ... 30

3.1 Komposisi Reaksi PCR berdasarkan Williams, et al. (1990) ... 47

4.1 Konsentrasi dan Kemurnian Isolasi DNA Tanaman Sawo Pouteria ... 53

4.2 Jumlah Larik Monomorfik dan Polimorfik keenam Sampel Tanaman Sawo Pouteria ... 59

4.3 Data Matriks Hasil Amplifikasi DNA Tanaman Sawo Pouteria...60

4.5 Perhitungan Nilai PIC dari primer OPB-09………...61

(11)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

2.1 (A). Pohon Fenetik dan (B). Pohon Kladistik...9

2.2 Contoh Alat Spektrofotometer UV ... 12

2.3 Prinsip Kerja Alat Spektrofotometer UV ... 12

2.4 Berbagai Macam Alat Elektroforesis ... 13

2.5 Prinsip Kerja Elektroforesis ... 14

2.6 Prinsip Kerja PCR (Polymerase Chain Reaction) ... 16

2.7 Thermocycler ... 19

2.8 Langkah Kerja Penanda Molekuler AFLP ... 25

2.9 Skema Prinsip Kerja RAPD ... 28

2.10 Pouteria campechiana, (a) pohon ketika berbuah, (b) daging buah, (c) daun ... 33

2.11 Pouteria duclitan,(a) Habitus, (b) Perbungaan, (c) Pertulangan daun, dan (d) Buah ... 35

2.12 Anatomi Serat Batang Pouteria duclitan (Blanco) ... 36

2.13 Pouteria obovata,(a) kecambah, (b) daun anakan, (c) buah, (d) biji ... 37

3.1 Skema Langkah Kerja Esktraksi DNA Tanaman... 45

3.2 Program Amplifikasi Fragmen DNA menggunakan Thermocylcer ... 48

3.3 Diagram Alur Penelitian ... 50

4.1 Elektroforegram DNA enam sampel tanaman sawo Pouteria dari jaringan daun muda ... 51

4.2 Elektroforegram Hasil Amplifikasi DNA Tanaman Sawo PouteriaMenggunakan Primer Acak OPB-09 ... 58

4.3 Ilustrasi Interpretasi Elektroferogram Hasil Ampilifikasi keenam sampel Tanaman Sawo Pouteria menggunakan primer OPB-09 ... 59

(12)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1 Daftar Alat dan Bahan………. 77

2 Protokol Pembuatan Larutan Stok……….. 80

3 Cara Menghitung Panjang Molekul DNA Hasil

Amplifikasi……….. 82

4 Surat Perizinan Pengambilan Sampel 84

5 Foto Kegiatan……….. 88

(13)

1 BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Indonesia merupakan negeri khatulistiwa yang terdiri dari bentangan luas

lautan dan sekitar 13.000 pulau-pulau yang berjajar dari ujung Sabang sampai

Merauke. Iklim tropis menjadikan tanah Indonesia subur dan berpotensi

ditumbuhi berbagai macam jenis tumbuhan. Indonesia memiliki hutan tropis

terbesar ke-3 setelah Brazil dan Republik Demokrasi Kongo (Zaire). Hutan

tropis ini sangat kaya akan kenekaragaman hayati yang unik (Forest Watch

Indonesia, tanpa tahun) khususnya pada keanekaragaman floranya.

Sebagai negara tropis, Indonesia memiliki banyak jenis buah-buahan, baik

yang asli dari Indonesia maupun jenis-jenis introduksi. Kelompok sawo-sawoan

atau famili Sapotaceae merupakan salah satu kelompok buah-buahan yang

tumbuh dan berkembang dengan baik di Indonesia. Keanekaragaman jenis

sawo-sawoan di Indonesia merupakan gabungan antara jenis-jenis asli Indonesia dan

jenis-jenis introduksi dari Asia dan Amerika yang dibawa masuk ke Indonesia

berabad-abad lampau (Triono, 2000).

Buah sawo sering dijadikan bahan pangan, diantaranya adalah sawo Belanda

(Pouteria campechiana) dan sawo Manila (Manilkara zapota). Buah ini sangat

digemari oleh banyak kalangan karena buahnya yang matang memiliki aroma

dan rasa yang manis, tekstur buahnya pun halus. Selain itu buah sawo juga

bermanfaat untuk kesehatan karena memiliki zat antioksidan yang tinggi (Kong

(14)

2

Tanaman-tanaman yang termasuk ke dalam Famili Sapotaceae sangat

memberi manfaat bagi kebutuhan hidup manusia. Buahnya yang bermanfaat

untuk sumber pangan, kayunya juga dapat dijadikan sebagai bahan bangunan dan

alat-alat furniture. Masyarakat Jawa sering memanfaatkan kayu Palaquium

javanensis (sinonim dari Palaqium amboinense) untuk membuat alat musik

gamelan dan kerajinan tangan khas daerah mereka (Moon et al., 2011). Manfaat

lainnya adalah produksi getah perca yang sangat melimpah pada ekstraksi daun

dan getah batang pohon genus Palaquium terutama Palaquium gutta Burck dan

Palaquium oblongifolium Burck (Karliati et al., 2011). Getah perca yang

dihasilkan berguna untuk perekat pelapis kayu (Karliati et al., 2011), bahan baku

permen karet dan membungkus kabel di bawah laut (Moon et al., 2011).

P.duclitan merupakan salah satu jenis tanaman sawo yang termasuk ke

dalam famili Sapotaceae, terdistribusi luas di Sumatra, Kalimantan, Bali,

Lombok, Jawa dan sekitarnya (Moon et al., 2011). Kayunya seringkali

dimanfaatkan untuk membuat pahatan kayu dan figura. Namun, menurut

penelitian Krisdianto (2000) kualitas kayu P. duclitan kurang kuat dan tidak

tahan lama, sehingga jarang sekali digunakan untuk bahan bangunan (Moon et

al., 2011)

P.duclitan juga turut menghiasi area Kebun Raya Bogor. Telah dilakukan

pengamatan pendahuluan mengenai karakterisik morfologi beberapa individu

P.duclitan yang tumbuh satu area dan kondisi yang sama yaitu di Kebun Raya

Bogor. Hasilnya salah satu individu P.diclitan cenderung memiliki perbedaan

pada karakter morfologi buah. Namun, dari segi morfologi daun, bunga, tipe

percabangan batang secara keseluruhnya sama. Perbedaan sifat yang teramati

(fenotipe) seperti bentuk morfologi buah, warna buah dan rasa buah dapat

dipengaruhi oleh banyak faktor (multifactorial) baik genetik maupun lingkungan

(Campbell et al., 2010). Dalam pandangan yang terintegrasi tentang pewarisan

sifat dan variasi gen, fenotipe suatu organisme mencerminkan keseluruhan

(15)

3

tersebut diduga individu P.duclitan tersebut memiliki keanekaragaman genetik

yang berbeda dan kemungkinan dapat dikategorikan ke dalam varietas yang

berbeda. Sesuai dengan Undang-undang No.29 Tahun 2000 Pasal 1 ayat 3

tentang perlindungan varietas tanaman yaitu sekelompok tanaman dari suatu

jenis atau spesies ditandai oleh bentuk tanaman, pertumbuhan tanaman, daun

bunga, biji dan ekpresi genotipe/kombinasi genotipe yang dapat membedakan

dari jenis atau spesies yang sama oleh sekurang-kurangnya satu sifat yang

menentukan dan apabila diperbanyak tidak mengalami perubahan.

Diperlukan klasifikasi secara molekuler sebagai penunjang atau alternatif

untuk mengetahui tingkat keragaman dan perbedaan genetik pada tanaman sawo

ini, sehingga dapat ditemukan seberapa besar tingkat kekerabatan tanaman sawo

P. duclitan yang memiliki karakter morfologi yang berbeda dengan P. duclitan

lainnya. Untuk menganalisis keanekragaman genetik dan kekerabatan genetik

suatu organism e dibutuhkan penanda molekuler. Penanda molekuler beberapa

diantaranya adalah penanda tingkat protein dan penanda tingkat DNA. Penanda

tingkat protein memiliki keterbatasan dalam jumlahnya karena penanda ini masih

dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti lingkungan, apabila kondisi

lingkungannya berbeda gen akan mengekspresikan protein yang berbeda pula

sesuai dengan kondisi lingkungannya, sehingga pendanda ini tidak cukup

informatif untuk penelitian yang mencakup seluruh genom (Semagn et al., 2006;

Asins et al., 1995 dalam Karsinah et al., 2002). Penanda molekuler yang

digunakan dalam penelitian ini adalah penanda tingkat DNA. Penanda tingkat

DNA sifatnya lebih stabil, dapat dideteksi di dalam semua jaringan tubuh dan

tidak dipengaruhi oleh lingkungan (Semagn et al., 2006; Zulfahmi, 2013).

Penanda tingkat DNA yang digunakan untuk tanaman khususnya untuk

mendeteksi polimorfisme terdiri dari banyak tipe di antaranya Restriction

Fragment Length Polymorphism (RFLP), Random Amplified Polymorphic DNA

(RAPD), Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP), Inter-Simple

(16)

4

Tag Sites (STSs), Cleaved Amplified Polymorphic Sequences (CAPS),

Microsatellites atau Simple Sequence Repeats (SSRs), Expressed Sequence

Tags (ESTs), Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs), dan Diversity Arrays

Technology (DArT).

Pada penelitian ini digunakan penanda RAPD (Random Amplified

Polymorphic DNA). Penanda ini pertama kali diperkenalkan oleh Williams et al

(1990). Namun seiring berjalannya waktu, penanda RAPD menjadi semakin

populer. Penanda ini sering dipakai untuk meneliti dan menganalisis genom

khususnya pada tanaman. Penanda molekular RAPD dipilih karena memiliki

keunggulan diantaranya pada proses pengerjaannya dapat memakai DNA sampel

yang tidak terlalu murni (Bakkapa et al., 2011; Semagn, 2006), membutuhkan

estimasi biaya yang relatif rendah (Bakkapa et al., 2011), langkah pengerjaannya

mudah dan sederhana sehingga tidak membutuhkan waktu yang lama untuk

mendapatkan hasil (Kumar et al., 2009), dan primer dapat digunakan untuk

analisis genom pada berbagai spesies (Semagn et al.¸2006).

Beberapa penelitian yang terkait dengan RAPD dan pemakaian tanaman

sebagai objek penelitiannya adalah genetic mapping berbasis RAPD pada

Passiflora edulis (Carneiro, 2002). Penelitian Zhang et al. (2013) tentang

analisis keanekaragaman genetik Larix gmelinii (Pinaceae), mengkaji genotoksik

efek Boron pada Triticum aestivum L. dan Phaseolus vulgaris L. (Kekec et al.,

2010), analisis keragaman genetik kultivar Citrus sinensis L. Osbeck

menggunakan karakteristik morfologi dan penand RAPD (Malik et al., 2012).

Seperti pada penelitian Majourhat et al. (2009) yang menggunakan Argania

spinosa (Sapotaceae) sebagai objek penelitiannya. Salah satu tujuan

penelitiannya adalah untuk mengetahui tingkat kekerabatan dan keanekaragaman

genetik Argania spinosa yang sebelumnya sudah diidentifikasi beberapa individu

memiliki bentuk morfologi buah yang berbeda yaitu bulat, gelondong dan oval

menggunakan penanda RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) dan SSR

(17)

5

Penelitian mengenai karakter molekular pada tanaman sawo Pouteria sudah

dilakukan sebelumnya oleh Rojas et al. (2012) dengan mengambil Pouteria

sapota sebagai objek penelitiannya dan menggunakan data RAPD untuk

menganalisis keragaman genetiknya. Pada jenis Pouteria duclitan masih belum

ditemukan penelitian mengenai karakter molekulernya, sehingga memang

diperlukan penelitian yang berkaitan untuk menambahkan data biologi molekuler

khususnya pada tanaman genus Pouteria.

B. Rumusan Masalah

Rumusan masalah dalam penelitian ini adalah: “Bagaimana hubungan kekerabatan fenetik beberapa jenis tanaman sawo Pouteria (Sapotaceae)

menggunakan metode RAPD?”

C. Batasan Masalah

Agar penelitian ini tidak meluas maka ada beberapa batasan masalah sebagai

berikut.

a. Beberapa spesimen merupakan jenis P. duclitan yang diambil di Kebun

Raya Bogor.

b. Penelitian ini menggunakan beberapa spesies Pouteria lain yang dijadikan

sebagai individu pembanding, yaitu P. obovata dan P. campechiana.

c. Primer acak yang digunakan untuk mengamplifikasi adalah OPB-09 dan

OPB-10.

D. Tujuan

Adapun tujuan yang ingin dicapai dalam penelitian ini adalah menganalisis

hubungan kekerabatan beberapa jenis tanaman sawo Pouteria (Sapotaceae)

menggunakan metode RAPD berdasarkan studi fenetik.

(18)

6

Hasil penelitian ini memiliki beberapa manfaat, diantaranya adalah sebagai

berikut.

a. Menemukan hubungan kekerabatan antara beberapa jenis tanaman sawo

Pouteria yang informasinya berguna untuk dilakukanya perkawinan silang

untuk menghasilkan varietas-varietas yang unggul.

b. Menghasilkan data molekuler yang bermanfaat bagi pengembangan

sumber plasma nutfah yang ada di Indonesia khususnya pada tanaman

sawo jenis Pouteria.

c. Sebagai tambahan ilmu dalam bidang biologi khususnya mengenai studi

(19)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis Penelitian

Jenis penelitian ini adalah penelitian deskriptif yang mengangkat

fenomena alam sebagai salah satu masalah dalam penelitian. Penelitian ini

dapat menerangkan arti dan kejelasan terhadap fenomena tersebut.

B. Populasi dan Sampel

Populasi dalam penelitian ini adalah beberapa tanaman P.duclitan,

P.obovata dan P.campechiana di Kebun Raya Bogor sedangkan sampelnya

adalah DNA beberapa tanaman P.duclitan, P.obovatadan P.campechiana

yang telah diisolasi. Sumber DNA berasal dari jaringan daun muda beberapa

tanamanP.duclitandan tanaman pembanding yaitu P.obovatadan

P.campechiana.

C. Waktu dan Lokasi Penelitian

Penelitian dilaksanakan dari bulan Februari sampai dengan bulan

September 2014. Lokasi penelitian terbagi menjadi dua, yaitu: pengambilan

sampel di Kebun Raya Bogor dan analisis genetik di laboratorium

Mikrobiologi FPMIPA UPI.

D. Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian terdapat di

Laboratorium Mikrobiologi Universitas Pendidikan Indonesia. Daftar alat

dan bahan yang digunakan tercantum dalam Lampiran 1.

(20)

43

Alat-alat yang digunakan dicuci terlebih dahulu dan dikeringkan

kemudian dibungkus dengan plastik tahan panas yang selanjutnya

disterilisasi panas lembab. Begitu juga bahan yang digunakan disterilisasi

menggunakanautoclave dengan suhu 121°C tekanan 1,5 atm selama 10-15

menit. Pembuatan larutan yang digunakan tercantum pada Lampiran 2.

2. Tahap Penelitian a. Pengambilan Sampel

Sampel yang digunakan adalah daun muda dari beberapa tanaman

P.duclitan, P.obovatadan P.campechiana. Daun tersebut disimpan pada

plastic bagdan dimasukkan ke dalam coolbox yang sudah diisi dengan

es batu sebelumnya agar daun tetap segar. Kemudian di dalam

laboratorium, daun tersebut dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan

menggunakan tissue. Selanjutnya sampel daun ditimbang seberat

0,1-0,5gram dari setiap tanaman P.duclitan, P.obovata dan P.campechiana

yang tercuplik dan selanjutnya disimpan pada suhu -20°C hingga proses

ekstraksi DNA.

b. Isolasi DNA Genom

Isolasi DNA yang dilakukan berdasarkan metode Clark (1997, dalam

Hidayat, 2001)dengan beberapa modifikasi. Mortar dan alu yang

digunakan disimpan di dalamfrezeer selama 24 jam untuk memudahkan

menggerus daun. CTAB (1 M Tris-HCl pH 8,0; 6 M NaCl; 0,5 M EDTA

pH 8,0; 2% CTAB; 2% SDS; ddH2O steril) yang digunakan terdiri dari

CTAB dingin 4°C dan CTAB hangat 65°C. Sebanyak 0,1-0,5 gram daun

muda masing-masing sampeldirendam dalam alkohol absolut selama 5

menit. Sementara itu, tabung mikro 1,5 mL steril diberi label sesuai

dengan kode masing-masing sampel dan dimasukkan ke dalamnya

500µL CTAB hangat (sebelumnya dilarutkan dulu menggunakan

magnetic stirrer dalam suhu 65°C), buffer lisis 1 (20% SDS)50µL dan β-mercaptoetanol sebanyak 1% dari CTAB hangat yang digunakan.

Penggerusan daun dimulai dengan memasukkan daun muda yang

(21)

benar-44

benar halus, dimasukkan 400µL CTAB dingin dan penggerusan

dilanjutkan hingga daun benar-benar halus. Setelah halus, daun tersebut

dimasukkan ke dalam tabung mikro 1,5 ml yang telah diberi label dan

diisi dengan larutan CTAB, buffer lisis 1 serta β-mercaptoetanol. Sampel dihomogenkan dengan menggunakan vortex. Setelah itu sampel

diinkubasi dalam penangas air pada suhu 65°C selama 60 menit.

Selanjutnya ditambahkan buffer lisis 2 (5 M Potassium asetat) ke

dalam tabung mikro yang berisi sampel sebanyak 100µL dan

dihomogenkan dengan cara membolak-balik tabung sebanyak 50 kali.

Simpan tabung mikro tersebut dalam wadah yang berisi es selama 10

menit, lalu disentrifugasi sampel dengan kecepatan 14.000 rpm selama 5

menit. Pindahkan fasa atas (supernatan) ke dalam tabung mikro yang

baru. Ditambahkan larutan kloroform isoamil alkohol sebanyak 0,5 kali

dari volume total sampel dan dihomogenkan dengan cara membolak

balik tabung sebanyak 50 kali. Selanjutnya sampel disentrifugasi lagi

dengan kecepatan 14.000 rpm selama 5 menit. Fasa paling atas

(supernatan) dimasukkan ke dalam tabung mikro yang baru dan

ditambahkan alkohol 100% (-20°C) sebanyak minimal 2 kali volume

total sampel atau hingga 1,5 ml dan dihomogenkan larutan tersebut

dengan cara membolak-balik tabung sebanyak 50 kali. Sampel tersebut

disimpan dalam freezer(-20°C) selama 24 jam.

Setelah 24 jam, dilakukan proses presipitasi DNA. Sampel

disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 5 menit dan dibuang

alkoholnya. Ditambahkan 1 ml alkohol 70% dan dibolak-balik tabung

tersebut. Sampel disentrifugasi lagiselama 5 menit dengan kecepatan

14.000 rpm,alkoholnya dibuang dan tabung dibalikkan di atas tisu

hingga tidak ada lagi alkohol di dalam tabung. Selanjutnya sampel

ditambahkan pelarut DNA TE sebanyak 30µL dansampel diinkubasi

dalam penangas air dengan suhu 50°C selama 5 menit agar DNA dapat

larut. Terakhir, sampel siap digunakanuntuk masuk ke tahap pengukuran

(22)

(-45

20°C) apabila sampel belum digunakan. Secara singkat langkah kerja

isolasi DNA genom dideskripsikan dalam Gambar 3.1.

(23)

46

c. Mengukur Kemurnian dan Konsentrasi DNA

Uji kuantitatif DNA dilakukan menggunakan spektrofotometer.

Komposisi larutannya yaitu 5 µL DNA dan 495 µL ddH2O steril.

Larutan tersebut dihomogenkan terlebih dahulu menggunakan alat

vortex baru kemudian dimasukkan ke dalam kuvet spektrofotometer.

Kemurnian DNA diukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm

dibagi dengan nilai absorbansi 280 nm. Nilai kemurnian DNA biasanya

berkisar antara 1,8-2,0. Jika kemurnian DNA kurang dari 1,8 maka

indikasi adanya kontaminan dari protein dan UV sedangkan jika

kemurnian DNA lebih dari 2,0 maka indikasi adanya kontaminan

kloroform dan fenol.Konsentrasi DNA dihitung menggunakan rumus :

[DNA] = Å260 x 50 x faktor pengenceran

Keterangan :

Å260 : Nilai absorbansi pada 260 nm

50 : larutan dengan nilai absorbansi 1,0 sebanding dengan 50μg untai ganda DNA per ml

d. Elektroforesis Sampel Hasil Isolasi DNA

Uji kualitatif DNA dilakukan dengan menggunakan elektroforosesis.

DNA sampel yang akan diamplifikasi terlebih dahulu dielektroforesis

agar diketahui ketebalan fragmen DNA tersebut. Proses elektroforesis

dilakukan dengan cara membuat gel agarose terlebih dahulu. Gel

agarose yang digunakan konsentrasinya 1,4% dalam 25 ml TBE.

Sebanyak 2 µL DNA dicampurkan dengan 1 µL Loading dye dan

kemudian dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel. Proses elektroforesis

ini menggunakan larutan TBE dan di-runningdengan 100 volt selama 30

menit. DNA hasil elektroforesis diamati pada UV transluminator lalu

didokumentasikan menggunakan kamera yang ditutupi kertas mika.

e. Amplifikasi DNA dengan Metode PCR

Amplifikasi ini dilakukan dengan menggunakan mesin thermocycler

dengan program Gene Amplified PCR system 9700. Primer yang

(24)

47

3’dan OPB-10 dengan sikuen data 5’ CTGCTGGGAC 3’, primer ini diadaptasi dari Rojas et al. (2012).

Pencampuran komponen reaksi PCR dilakukan secara cepat dan

teliti. Semua proses pencampuran dilakukan di dalam coolbox untuk

menjaga agar komponen reaksi PCR tidak rusak. Setiap tabung PCR

berisi 25 μLkomposisi PCR yang tercantum pada Tabel 3.1.

Amplifikasi DNA dilakukan dengan tahap denaturasi awal pada suhu

94°C selama 3 menit dan 60 siklus dengan suhu denaturasi 94°C selama

6 detik, annealingpada suhu 40°C selama 18 detik, stabilisasi primer

pada suhu 60°C selama 2 menit 18 detikdan ekstensi pada suhu 74°C

selama 2 menit 18 detik. Ekstensi akhir dilakukan pada suhu 74°C

selama 8 menit.

Tabel 3.1 Komposisi Reaksi PCR berdasarkan Williams, et al. (1990) yang

mengalami modifikasi

Komposisi PCR Konsentrasi Awal

Volume (μL) Konsentrasi Akhir

Buffer PCR 10x 2,5 1x

MgCl2 25 mM 3 3 mM

dNTPs mix 10 mM 0,5 0,2 mM

Primer 200 μM 1,5 12 μM

Taq DNA

Polimerase

5 U/μL 0,25 0,05 U/μL

DNA 50ng/ μL 2 4 ng/μL

ddH2O - 15,25 -

(25)

48

Gambar 3.2 Program Amplifikasi Fragmen DNA menggunakan Thermocylcer

f. Elektroforesis Hasil PCR

Amplikon yang didapat, diuji secara kualitatifdengan melakukan

elektroforesis pada gel agarose 1,4% dalam 40 ml TBE. Sebanyak 10 μL

amplikon dicampurkan dengan 3 uL loading dye dan dimasukkan ke

sumur-sumur gel. Elektroforesis dilakukan dengan tegangan 50 volt selama 2 jam.

Marker DNA yang digunakan adalah DNA Lambda yang dipotong oleh

enzim restriksi EcoRI dan HindIII.

Gel agarose yang telah melalui proses elektroforesis diwarnai dengan

Etidium Bromida (EtBr) selama 10 menit. Kemudian gel agarose yang

sudah diwarnai dengan EtBr dibilas dengan aquades selama 5 menit. Hasil

pewarnaan dilihat dengan sinar ultraviolet dari alat UV transluminator dan

didokumentasikan dengan kamera yang lensanya ditutupi kertas mika

berwarna merah.

3. Analisis Data

Analisis data molekuler dilakukan dengan melihat hasil pita-pita

DNA yang dihasilkan. Hasil pita-pita DNA menjadi dua kategori yaitu pita

dna yang monomorfik dan polimorfik. Kemudian data-data ini dibuat

dalam bentuk matriks dan buat skema interpretasinya, dengan melihat

kehadiran dan ketidakhadiran pita DNA. Jika pita DNA ada maka diberi

nilai 1 sedangkan jika pita DNA tidak ada diberi nilai 0. Selanjutnya data

dalam bentuk matriks tersebut diolah dalam software MEGA 4 dengan

program UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Aritmatic

(26)

49

Pita polimorfik yang dihasilkan dari amplifikasi RAPD-PCR

selanjutnya dihitung nilai PIC untuk mengetahui tingkat keinformatifan

pada primernya Nilai PIC dapat dihitung dengan rumus:

PIC = 1-∑

Keterangan:

(27)

50

F. Alur Penelitian

Gambar 3.3 Diagram Alur Penelitian

Penyusunan

(28)

(29)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Data fenogram yang dibentuk oleh klaster UPGMA membagi keenam

sampel yang menjadi dua kelompok besar. Kelompok I terdiri atas P.duclitan

IV.C.83, P.duclitan 112A, P.duclitan XXV/B111. P.duclitan 112 A yang

memiliki bentuk morfologi buah yang bulat terpisah dengan P.duclitan IV.C.83

dan P.duclitan XXV/B111 membentuk satu kelompok kecil di dalam kelompok 1,

diindikasikan bahwa P.duclitan 112 A termasuk ke dalam varietas atau kultivar

yang berbeda, tetapi masih berkerabat dekat dengan individu-individu P.duclitan

lainnya, sedangkan kelompok II terdiri atas P.obovata IV.170, P.duclitan

XXV.B.120 dan P.campechiana IV.D.182A.

P.duclitan XXV.B.120 memiliki larik yang lebih bervariasi dibandingkan

dengan P.duclitan lainnya, menyebabkan individu ini berada di kelompok besar

yang berbeda. P.campechiana dan P.obovata masih berkerabat dekat karena

masih termasuk ke dalam satu kelompok besar, sedangkan P.campechiana dan

P.obovata dengan P.duclitan IV.C.83, P.duclitan XXV/B111, P.duclitan 112A

berkerabat jauh hal ini dibuktikan bahwa masing-masing individu termasuk

kedalam kelompok besar yang berbeda dan karakter morfologinya berbeda.

B. Saran

Untuk penelitian selanjutnya, diperlukan analisis yang lebih mendalam

terhadap tanaman sawo Pouteria dengan melibatkan lebih banyak primer dan

lebih banyak sampel yang diuji, karena semakin banyak primer dan sampel yang

digunakan akan semakin besar peluang untuk mendeteksi polimorfisme DNA dan

(30)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu DAFTAR PUSTAKA

Bakkappa, S., Talebi, E. & Subramanya, G. (2011). “Role Of Molecular Marker Conservation”. Internaional Journal of Advanced Biology Research 1(1),

hlm. 1 – 7.[Online]. Tersedia di: V., & Jackson, R. B. (2010). Biology Jilid 1 8thEdition . Jakarta: Erlangga.

Carneiro, M. S., Camargo, L. E. A., Coelho, A. S., Vencovosky, R., Junior, L. P. L., Stenzel, M. C. L. & Veiera, M. L. C. (2002). “RAPD-based genetic linkage maps of yellow passion fruit (Passiflora edulis)”. Genome 45, hlm. 670 –

678.[Online]. Tersedia di:

http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/g02-035 (Diakses 15 September 2014)

Cornquist, A. (1981). An Integrated System of Classification of Flowering Plants. New York: Columbia University Press.

Das, S., Misra, R. C., Rout, G. R., Pattanaik, M. C. & Aparajita, S. (2009).

“Relationship of Status of Polymorphic RAPD Bands with GenotypicAdaptation In Early Finger Millet Genotypes”. African Crop Science Journal 17 (2), hlm. 61 – 69. [Online]. Tersedia di: http://www.bioline.org.br/pdf?cs09006(Diakses 15 September 2014)

Department of Primary Indusrty and Fisheries.(1991). A Botanical and Agronomic

Review.Australia: Northern Teritory of Australia. [Online]. Tersedia di:

www.nt.gov.au/d/Content/File/p/Tech.../TB169.pdf(Diakses 18Agustus 2014)

Ditjen Kehutanan .(1972). Daftar Nama Pohon-Pohonan Bali dan Lombok. Bogor: Lembaga Penelitian Hutan.

Fatchiya., Arumingtyas, E. L., Widyati, S., & Rahayu, S. (2011). Biologi Molekuler:

Prinsip Dasar Analisis. Jakarta : Erlangga

Fitrisari, A. (2004). Studi Keragaman Genetik Pada Osphronemus gouramy Dengan

(31)

70

(RAPD).Skripsi.Program Biologi.Universitas Pendidikan Indonesia. Bandung:

tidak diterbitkan.

Fisher, M., Husi, R., Prati, D., Peintinger, M., Kleuneun, M. V. & Schmid, B. (2000).

“RAPD Variation Among and within Small and Large Populations of The Rare

Clonal PlantRanunculus Reptans (Ranunculaceae)”. American Journal of

Botany 87 (8), hlm. 1128-1137. [Online]. Tersedia di: www.ncbi.nlm.nih.gov/ (Diakses 30 September2014)

Forest Watch Indonesia. (Tanpa Tahun). Hutan-hutan Indonesia: Apa yang

dipertaruhkan?.[Online]. Tersedia di:

http://www.wri.org/sites/default/files/pdf/indoforest_chap1_id.pdf (Diakses 15 September 2014)

Gupta, P.K., Balyan, H. S., Sharma, P. C. & Ramesh, B.(1996). “Microsatellite in

plant: A new class of molecular marker”. CURRENT SCIENCE 70(1), hlm. 45

– 54.[Online]. Tersedia di: www.currentscience.ac.in.pdf (Diakses 9 Oktober 2014)

Heyne, K. (1987). Tumbuhan Berguna Indonesia Jilid III. Jakarta: Badan Litbang Kehutanan

Hidayat, T dan Pancoro, A. (2006).“Sistematika dan Filogenetika Molekuler”.Kursus Simgkat Aplikasi Peramgkat Lunak PAUP dan MrBayes untuk Penelitian Filogenetika Molekuler SITH-ITB 2006. Bandung: tidak diterbitkan.[Online].

Tersedia di: www.pdfio.net/k-6187732.htm (Diakses 20 September 2014)

Hidayat, T. (2001).Studi Filogenetik Molekulel pada Anacardiaceae berdasarkan Variasi Urutan Daerah “Internal Transcribed Spicer” (ITS). Tesis, Sekolah Pascasarjana, Institut Teknologi Bandung.

Ian, S. (Tanpa tahun).Planchonella obovata (R. Brown) Pierre.[Online]. Tersedia di:http://www.efloras.org/florataxon.aspx?flora_id=2&taxon_id=200017543 (Diakses 12 September 2014)

International Center for Underutilised Crops. (2004). “Pouteria Fruits for TheFuture”. Factsheet 11, hlm. 1 – 2.[Online]. Tersedia di:

www.cropsforthefuture.org/publication/Factsheets/Factsheet-pouteria.pdf(Diakses 29 September 2014)

(32)

71

Karliati, T., Febriyato, F., Syafii, W.& Wahyudi, I.(2011).“Karakterisasi Getah Perca

dan Pemanfaatannya sebagai Perekat Kayu Lapis”.Jurnal Ilmu dan Teknologi Kayu Tropis 10 (1), hlm.12-22.[Online]. Tersedia di: www.mapeki.org/.../JITKT%20Vol.10%20No.1%202..(Diakses 29 September 2014)

Kekec, G., Sakcali, M. S. & Uzonur, I. (2010).“Assessment of Genotoxic Effects of

Boron on Wheat (Triticum aestivum L.)and Bean (Phaseolus vulgaris L.) by

Using RAPD Analysis”. Bull Environ Contam Toxicol 84, hlm. 759 –

764.[Online]. Tersedia di: www.ncbi.nlm.nih.gov/.../2...(Diakses 29 September 2014)

Kong, K. W., Khoo, H. E., Prasad, N. K., Chew, L. Y. & Amin, I.(2013). “Total Phenolics and Antioxidant Activities of Pouteria campechiana Fruit

Parts”.Sains Malaysiana, 42 (2), hlm. 123 – 127. [Online]. Tersedia di:

journalarticle.ukm.my/5893/(Diakses 29 September 2014)

Krisdianto.(2000). “Anatomi dan Kualitas Serat Tujuh Jenis Kayu kurang Dikenal dari Jawa Barat”.Pusat Penelitian dan Pengembangan Hasil Hutan, hlmn. 1 –

www.forda-mof.org/index.php/content/.../jurnal/29(Diakses 1 Oktober 2014)

Kumar, P., Gupta, V. K., Misra, A. K., Modi, D. R., & Pandey, B. K.(2009).

“Potential of Molecular Markers in Plant Biotechnology”.Plant Omics Journal

2(4), hlm. 141 – 162.[Online]. Tersedia di:

www.pomics.com/Pradeep_2_4_2009_141_162.pdf(Diakses 10 Oktober 2014)

Kukachka, B. F. (1982). Wood Anatomy of The Neurotropical Sapotaceae.Forest

Product Laboratory Forest Service.Departement of Agriculture

Madison.[Online]. Tersedia

di:www.dtic.mil/cgi-bin/GetTRDoc?AD=ADA108863(Diakses 29 September 2014)

Kusumadewi, Y. (2005). Analisis Variasi Genetik pada Tebu (Saccahrum sp.)Asli

Indonesia Dengan Menggunakan Penanda RAPD.Skripsi., Program Biologi.

Universitas Pendidikan Indonesia.Bandung: tidak diterbitkan.

Langga, I. F.., Restu, M & Kuswinanti, T. (2012). “Optimalisasi Suhu dan Lama

Inkubasi Dalam Ekstraksi DNA Tanaman Bitti (Vitex cofassus Reinw) Serta

Analisis Keragaman Genetik dengan Teknik RAPD-PCR”. J. Sains & Teknologi 12(3), hlm. 265 – 276.[Online]. Tersedia di: pasca.unhas.ac.id/.../0b939e0181da0eccc16cd29267c(Diakses 10 September 2014)

(33)

hlm.731-72

738. [Online]. Tersedia di:www.ajebs.com/vol8/26.pdf (Diakses 29 September

2014)

Majourhat, K., Jabbar, Y., Hafidi, A. & Martinez-Gomez, P. (2008). “Molecular Characterization And Genetic Relationships Among Most Common Identified Morphotypes of Critically Endangered RareMoroccan Species Argania spinosa (Sapotaceae) Using RAPD and SSR Markers”. Ann. For. Sci. 65, hlm. 1 –

6.[Online]. Tersedia di:http://hal.inria.fr/docs/00/88/34/63/PDF/hal-00883463.pdf(Diakses 29 September 2014)

Malik, S.K., Rohini, M. R., Kumar, S., Choudary, R., Pal, D. & Chaudhury, R.(2012).

“Assessment of Genetic Diversity in Sweet Orange [Citrus sinensis (L.)Osbeck] Cultivars of India Using Morphological and RAPD Markers”.Agric Res 1(4), hlm. 317 – 324.[Online]. Tersedia di: www.sciencedomain.org/download.php?f=Al...pdf&aid=415(Diakses 18 September 2014)

Marantina, S. S. (2008). Deteksi Fragmen Gen NA Pengkode Neuraminidase Virus

Avian Influenza A Subtipe H5N1 dengan Teknik Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Skripsi. Departemen Biologi.

Universitas Indonesia.[Online]. Tersedia

di:lib.ui.ac.id/file?file=digital/...Deteksi%20Fragmen...(Diakses 29 Agustus 2014)

Master, J. (2012). Campoleh (Pouteria campechiana).[Online]. Tersedia di: http://staff.unila.ac.id/janter/2012/01/16/campoleh-pouteria-campechiana/ [Diakses 11 September 2014]

McPherson, Michael J. et al. (1992). Molecular Plant Pathology. New York: Oxford University Press.

Moon, H. K., Ujang, S. I., Park, S. Y., Park, C. H. & Yi, J. S.(2007). Tropical Trees of Indonesia. Korea: Korea Forest Research Institute. [Online]. Tersedia di: 152.99.88.238/KFRICAB/IMG/006/003/155916.pdf(Diakses 13 September 2014)

Moreira, P.A. & Oliveira, D.A. (2011). “Leaf age affects the quality of DNA extracted from Dimorphandra mollis (Fabaceae), a tropical tree species from

the Cerrado region of Brazil”. Genetics and Molecular Research 10 (1), hlm.

353 – 358. [Online]. Tersedia di:

www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21365551(Diakses 29 September 2014)

Mueller, U.G. &Wolfenberger, L.L. (1999).“AFLP genotyping and

(34)

73

di:https://www.ufpe.br/biolmol/Artigos_Doutorado_2003_Jan/AFLPgenotypin g-review.pdf.(Diakses 29 September 2014)

Nagy, S., Poczai, P., Cernak, I., Gorji, A. M., Hegedus, G. & Taller, J. (2012).

“PICcalc: An Online Program to Calculate Polymorphic Information

Content for Molecular Genetic Studies”. Biochem Genet 50, hlm

670-672. [Online]. Tersedia di:

www.researchgate.net/publication/224933086_PICcalc_An_Online_Program_t o_Calculate_Polymorphic_Information_Content_for_Molecular_Genetic_Stud ies/links/0fcfd50fd9a85c5635000000 (Diakses 1November 2014)

Nurtikasari, R. (2009). Analisis Keragaman Genetik Burung Famili Columbidae

Dengan Penanda Random Amplified Polymrphic DNA (RAPD).Skripsi.Program Biologi.Universitas Pendidikan Indonesia.Bandung:

tidak diterbitkan.

Opperdoes, F. (1997). Phenetics versus Cladistics and the pro's and con's of the various phylogeny inference methods. [Online]. Tersedia di: http://www.icp.ucl.ac.be/~opperd/private/phenetics.html[Diakses 11 September 2014]

Opperdoes, F. (1997b).Construction of a distance tree using clustering with the

Unweighted Pair Group Method with Arithmatic Mean (UPGMA).[Online].

Tersedia di: http://www.icp.ucl.ac.be/~opperd/private/upgma.html[Diakses 11 September 2014]

Pathak, B. C. & Serajuddin, M. (2012). “Genetic Diversity in Barred Spiny Eel

Macrognathuspancalus (Hamilton 1822) Sampled in Ganges River Basin, India”. International Journal of Genetics 2 (1), hlm. 1 – 5.[Online]. Tersedia di: idosi.org/ijg/ijg2(1)12.htm(Diakses 12 Oktober 2014)

Pennington, T.D. (2004). “Sapotaceae. InKubitzki, K. (ed.), The Families and Genera of Vascular Plants”. Springer-Verlag: Berlin. 6, 390–421.[Online]. Tersedia di:www.lrm.nt.gov.au/__data/.../SAPOTACEAE.pdf(Diakses 28 Agustus 2014)

Plowden, C. Chicheley. (1972) A Manual of Plant Names Third Edition. London: George Allen & Unwid Ltd.

(35)

74

Pradnyaniti, D.G., Wirajana, I.N. & Yowani, S.C. (2013). “Desain Primer Secara In Silico Untuk Amplifikasi Fragmen Gen RpobMycobacterium tuberculosis Dengan Polymerase Chain Reaction (PCR)”. Jurnal Farmasi Udayana hlm.

124-129.[Online]. Tersedia di:

ojs.unud.ac.id/index.php/jfu/article/download/.../5641(Diakses 10 Oktober 2014)

Raunsay, S. S. (2010). Isolasi Plasmid, Elektroforesis, Spektrofotometri. [Online]. Tersedia di: http://susanai07.student.ipb.ac.id/2010/06/18/isolasi-plasmid-elektroforesis-spektrofotometri/ (diakses 27 September 2013)

Rasnovi, S. (2004). “Konsep Spesies: Mengapa Fenetik atau

Filogenetik?”.Floribunda 2 (5), hlm.138-143. [Online]. Tersedia

di:www.ptti.or.id/floribunda2.html(Diakses 29 September 2014)

Richardson, B. J, Baverstock &Adams.(1986). Allozyme Electro-phoresis.A

Handbook for Animal Sys-tematics and Population Studies. Aca-demic Press,

Inc. San Diego : 410 pp.

Rocas, A Niembro. (Tanpa tahun).“ Pouteria campechiana (Kunth) Baehni”. Part II

Species Description.[Online]. Tersedia

di:www.rngr.net/publications/ttsm/species/PDF.2004-03-16.4509/at.../file(Diakses 29 September 2014)

Rojas, T. J., Andrade-Rodriguez, M., Alia-Tejacal, I., Lopez-Martinez, V., Espinosa-Zaragosa, S., & Esquinca-Aviles, H. (2012). “Molecular Characterization of

Zapote Mamey (Pouteriasapota (Jacq.) Moore & Stearn)”.Rec. Fac. Agron 29,

hlm.339-354.[Online]. Tersedia di:

revfacagronluz.org.ve/PDF/.../v29n3a2012339354.pd..(Diakses 16 April 2014)

Sahoo, L. (tt). Plant Biotechnology Lab Manual.Department of Biotechnology.Indian

Instiute of Technology Guwahati.[Online]. Tersedia

di:www.iitg.ernet.in/scifac/.../Plant%20Biotech%20Lab%20Manual.pdf(Diaks es 29 September 2014)

Sargent, J. R. dan George, S. G. (1975).Methods in Zone Electrophoresis BDH

Chemical LTD. Poole England: 219 pp.

Semagn, K., Bjornstard, A., & Ndjiondjop, M. N. (2006).“An Overview of Molecular Marker Methods for Plants”.African Journal of Biotechnology 5(25), hlm.

2540 – 2568.[Online]. Tersedia di:

(36)

75

Silvertown, J. W. & Charlesworth, D. (2001).Introduction to plant population

biology. UK: Blackwell Publisihing.

Sprent, J. I., Chalmers, K. J., Waugh, R., Simons, A. J. & Powell, W.

(1992).“Detection of genetic variation between andwithin populations of

Gliricidia sepium andG. maculata using RAPD markers”.Heredity 69,

hlm.465-472. [Online]. Tersedia di: www.ncbi.nlm.nih.gov/ (Diakses 2 Januari 2014)

Steven, P. (2013). Ericales.[Online]. Tersedia di: http://global.britannica.com/EBchecked/topic/191380/Ericales/276494/Sapotac eae (Diakses 2 Januari 2014)

Stuessy, T. F. (2009). “Paradigms in biological classification (1707–2007): Has anything reallychanged?”. Taxon58 (1), hlm. 68 – 76.[Online]. Tersedia di: www.jstor.org/stable/27756825(Diakses 29 September 2014)

Suaidah, L. (2010). Analisis Variasi Genetik Osphronemus gouramyLac

Menggunakan Penanda Genetik Random Amplified Polymorphic DNA.Skripsi.

Program Studi Biologi. Universitas Pendidikan Indonesia.Bandung: tidak diterbitkan.

Suyono, I. J. (2000).Analisis Struktur Genetik Populasi Nyamuk (Aedes aegypti) dari

Tiga Lokasi di Jawa Barat Menggunakan Metode “Random Amplified

Polymorphic DNA” (RAPD).Tesis. Program Pasca Sarjana. Institut Teknologi Bandung: tidak diterbitkan.

Titrawani.(1996). Biodiversiti Kodok Genus Rana Ditinjau dari Morfologi, Kariotip

dan Pola Protein di Kodya Sawahlunto.Tesis.Program Pasca Sarjana. Institut

Pertanian Bogor.[Online]. Tersedia di:

www.oseanografi.lipi.go.id/.../oseana_xxvi(1)25-31.p...(Diakses 6 September 2014)

Triono, T. (2000). “SAWO-SAWOAN: Suatu Potensi yang Terkesampingkan”.

Prosiding Seminar Hari Cinta Puspa dan Satwa Nasional.hlm. 96 –

elib.pdii.lipi.go.id/katalog/index.php/.../byId/104457 (Diakses 1 Januari 2014).

Vos, P., Hogers, R., Blekeer, M., Reijans, M., Hornes, M., Frijters, A,. Pot, J. Peleman, J. & Kuiper, M. (1995). “AFLP: a new technique for DNA

(37)

76

Williams, J. G. K., Kubelik, A. R., Livak, K. J., Rafalski, J. A., & Tingey, S.V.(1990). “DNA Polymorphisms amplified by arbitrary primes are useful as

genetic markers”. Nucleic Acids Research 18(22), hlm. 6531 – 6535.[Online]. Tersedia di: www.ncbi.nlm.nih.gov/(Diakses 19 Agustus 2014)

Yunita, O. & Kresnamurti, A. (2005). “Identifikasi Simplisia yang Dijual sebagai

Strychnos ligustrina Bl. Di Pasar Tradisional Surabaya dengan Metode Random AmplifiedPolymorphic DNA (RAPD)”.Berk.Penel. Hayati 11, hlm.19

– 24.[Online]. Tersedia

di:www.berkalahayati.org/index.php/bph/article/.../404(Diakses 29 September 2014)

Zhang, L., Zhang, H. G. & Li, X. F.( 2013). “Analysis of genetic diversity in Larix

gmelinii (Pinaceae)with RAPD and ISSR markers”.Genetics and Molecular Research 12 (1), hlm.196-207.[Online]. Tersedia di:dx.doi.org/10.4238/2013.January.24.12(Diakses 29 September 2014)

Zulfahmi.(2013). “Penanda DNA untuk Analisis Genetik Tanaman”.Jurnal