Validasi Keturunan Kelapa Sawit Material Genetik PT. Socfindo Berdasarkan Marka SSR (Simple Sequence Repeats)

(1)

TINJAUAN PUSTAKA

Botani tanaman

Kelapa sawit berasal dari daerah yang terletak di antara Guinea dan

Angola di Afrika Barat. Tanaman kelapa sawit diintroduksi di Indonesia pada

Tahun 1848. Sebanyak empat bibit kelapa sawit ditanam di Kebun Raya Bogor.

Dari keempat bibit tersebut, dua bibit ditanam oleh Bourbon atau Mauritius pada

Februari 1848 dan dua bibit yang lain diperoleh dari Amsterdam pada Maret 1848

(Pamin, 1998). Saat ini, kelapa sawit sudah berkembang pesat, khususnya di

Indonesia dan Malaysia. Secara bersamaan, saat ini Indonesia dan Malaysia

menguasai lebih dari 95% produksi kelapa sawit di dunia (Bakar, 2003).

Tanaman kelapa sawit termasuk dalam famili Arecaceae, subfamili

Cocoideae, tribe Cocoineae, dan genus Elaeis. Genus Elaeis terdiri dari dua sepesies yaitu E. guineensis Jacq. yang dikenal sebagai kelapa sawit dari Afrika dan E. oleifera Cortez yang dikenal juga dengan kelapa sawit asal Amerika Latin. (Rival, et al. 1997). Nama Elaeis guineensis diberikan oleh Jacquin pada tahun 1763 berdasarkan pengamatan pohon–pohon kelapa sawit yang tumbuh di

Martinique, kawasan Hindia Barat, Amerika Tengah. Kata Elaeis (Yunani) berarti minyak, sedangkan kata Guineensis dipilih berdasarkan keyakinan Jacquin bahwa kelapa sawit berasal dari Guinea (Pahan, 2008).

Tanaman kelapa sawit tumbuh tegak lurus dan dapat mencapai ketinggian

pohon sampai 20 m. Akar yang pertama muncul dari biji yang telah berkecambah

adalah radikula yang panjangnya 15 cm. Batang kelapa sawit tumbuh tegak

(2)

mempunyai diamter 45 cm - 60 cm pada tanaman dewasa. Daun kelapa sawit

terdiri atas rachis (pelepah daun), pinnae (anak daun) dan spines (lidi). Panjang pelepah daun bervariasi dengan rataan pada tanaman dewasa bisa mencapai 9 m.

Pelepah daun pada batang menurut spiral, ada yang ke arah kiri (bagian atas kiri

ke kanan bawah) dan umumnya ke arah kanan (bagian atas kanan ke kiri bawah).

Letak susunan daun ini disebut phyllotaxis. Tanaman kelapa sawit setelah ditanam di lapangan mulai berbunga pada umur 12-14 bulan tergantung dari varietas dan

tipe umur bibit yang ditanam serta kondisi lingkungan. Pada satu pohon kelapa

sawit dari setiap ketiak pelepah daun akan keluar tandan bunga jantan atau bunga

betina (Soehardjo, 1999).

Tandan bunga jantan dibungkus oleh seludang bunga dan akan pecah jika

akan anthesis. Tandan bunga yang sedang anthesis akan berbau khas. Setiap

tandan bunga jantan, sesuai dengan umurnya dapat menghasilkan tepung sari

sebanyak 25-60 gram dan jumlah ini dihasilkan dalam waktu 2-3 hari. Setelah

anthesis selesai seluruh tandan bunga akan berwarna agak abu-abu dan ditumbuhi

cendawan. Tandan bunga betina dibungkus oleh seludang bunga yang akan pecah

15-30 hari sebelum anthesis. Satu tandan bunga betina akan anthesis secara

bertahap dan umumnya memerlukan waktu 3-5 hari. Bunga betina yang siap

diserbuki pada waktu mekar berwarna putih dan hari kedua akan menjadi kuning

gading, hari ketiga berwarna jingga dan hari keempat berwarna merah kehitaman.

Selama bunga anthesis, bunga berbau harum dan mengeluarkan lendir untuk

menarik serangga (Soehardjo, 1999).

Buah akan matang 5-6 bulan setelah penyerbukan. Buah tersusun pada

(3)

lebih kecil dan kurang sempurna bentuknya dibandingkan buah yang terletak di

bagian luar (Soehardjo, 1999).

Pemuliaan Kelapa Sawit

Pemuliaan dan seleksi kelapa sawit berkaitan erat dengan pengembangan

dura Deli berdasarkan empat pohon kelapa sawit yang diintroduksikan di Bogor

tahun 1848. Kelapa sawit memiliki siklus pemuliaan yang panjang, sekitar 10

tahun, seperti : satu tahun untuk polinasi, dua hingga tiga bulan untuk persiapan

dan germinasi benih, tiga tahun di lapangan sebelum panen dan empat hingga

enam tahun untuk evaluasi panen. Jika ditambahkan dengan uji progeni, waktu

yang dibutuhkan mendekati 20 tahun untuk mengembangkan progeni yang telah

teruji. Pemuliaan kelapa sawit memiliki beberapa tujuan utama: (1) meningkatkan

hasil minyak, (2) tanaman yang pendek, (3) peningkatan kualitas minyak, (4)

ketahanan terhadap penyakit, (5) sifat-sifat fisiologis (indeks tandan, jumlah bobot

kering dan bunch dry matter), (6) eksploitasi interaksi genotipe dan lingkungan (Rajanaidu et al. 2000).

Secara umum, ada beberapa pendekatan yang diadopsi untuk pemuliaan

kelapa sawit. Pendekatan yang umum digunakan adalah Reciprocal Recurrent

Selection (RRS) dan Family and Individual Selection (FIS). RRS bertujuan untuk mengembangkan kelompok pisifera dan dura secara terpisah dan saling

melengkapi untuk sifat tertentu dimana vigor hibrida dieksploitasi ketika

disilangkan. Uji lanjut dilakukan pada progeni sebelum pengembangan

selanjutnya untuk memperoleh nilai pemuliaan. FIS digunakan untuk

mengidentifikasi famili terbaik dan kemudian tetua terbaik dari generasi

(4)

Untuk membantu memotong siklus pemuliaan yang panjang, metode

seleksi berbasis DNA digunakan untuk meningkatkan efisiensi dan presisi dalam

studi gen (Collard dan Mackill 2008). Seleksi berbasis DNA lebih dapat

diandalkan daripada seleksi konvensional yang berbasis fenotipe, karena fenotipe

dipengaruhi oleh lingkungan dan genotipe. Penggunaan marka berbasis DNA

dalam pemuliaan disebut Marker-Assisted Selection (MAS). MAS dapat

dilakukan pada tahap awal tanaman (plantlet) sehingga berpotensi mengurangi

jumlah individu yang diuji dan juga mereduksi biaya. Persyaratan untuk prosedur

klasik MAS adalah marka DNA dan analisis pautan yang akan mengidentifikasi

marka yang terpaut dengan gen-gen yang mengendalikan karakter-karakter yang

diamati. Kualitas dan jumlah marka menentukan kesuksesan MAS. Kualitas

marka berhubungan dengan karakteristik markanya, biaya dan efisiensi proses

genotyping. Jumlah marka mempengaruhi reliabilitas keterpautan antara marka dan gen. Dengan kata lain, seleksi marka dalam jumlah besar memiliki potensi

untuk identifikasi pautan yang dekat dan dapat dipercaya antara marka dan gen

yang diinginkan (Ben-Ari dan Luvi 2012).

Marka Simple Sequence Repeats (SSR)

SSR atau mikrosatelit tersebar merata di genom eukariot. Polimorfisme

SSR menggambarkan variasi jumlah unit berulang di daerah tertentu dalam

genom. Frekuensi pengulangan yang lebih dari 20 bp diperkirakan muncul setiap

33 kb di tanaman. Sekuen nukleotida yang mengapit pengulangan tersebut

digunakan untuk mendesain primer untuk amplifikasi berbagai unit pengulangan

di berbagai varietas. Primer-primer ini sangat berguna untuk deteksi cepat dan

(5)

membangun peta fisik berdasarkan sekuen tag tersebut. Tipe polimorfisme ini sangat reprodusibel (Varshney et al. 2004).

Seleksi menggunakan marka molekuler merupakan alternatif yang menarik

karena memiliki potensial untuk mengurangi waktu yang diperlukan untuk

menghasilkan varietas baru dan melepasnya ke pasar. Hal ini dikarenakan

kemampuan untuk menyeleksi di tahap awal (terutama pada tahap pembibitan)

akan memberikan efek yang besar dalam mengurangi waktu dan sumber lain yang

dibutuhkan untuk perbaikan varietas (Singh et al. 2007).

Marka SSR pada kelapa sawit pertama kali dikembangkan oleh Billote et

al. (2001) dengan menskrining pustaka SSR yang kaya (GA)n, (GT)n dan (CCG)n hingga karakterisasi akhir 21 lokus SSR. Estimasi kisaran ukuran alel dan

heterozigositas yang diharapkan di E. guineensis dan spesies yang berkerabat dekat E. oleifera juga dipublikasikan sekuen primer, dimana penggunaan optimal dari marka SSR dilakukan. Analisis data multivariat menunjukkan kemampuan

marka SSR secara efisien mengungkapkan struktur keragaman genetik genus

Elaeis sesuai dengan asal geografis dan hubungan genetiknya berdasarkan studi molekuler sebelumnya. Tingginya tingkat variabilitas alelik mengindikasikan

bahwa SSR E. guineensis merupakan alat yang kuat untuk studi genetik genus

Elaeis, termasuk identifikasi varietas dan pemetaan genetik intra atau inter spesifik.

Selain hal tersebut penggunaan SSR telah secara luas digunakan untk

meneliti tanaman kelapa sawit. Tasma dan Arumsari (2013) menunjukkan bahwa

SSR dapat digunakan untuk melihat tingkat diversitas genetik aksesi kelapa sawit

(6)

plasma nutfah kelapa sawit pada tiga jenis kelapa sawit komersial. Hasil

penelitian tersebut menyimpulkan bahwa marka SSR dapat digunakan untuk

mengklasifikasikan hasil persilangan pada empat kelas dan marka SSR dapat

melihat keragaman genetik.

Penelitian yang dilakukan oleh Billotte et al.(2005) menunjukkan bahwa marka SSR merupakan marka yang dapat digunakan untuk melihat adanya

linkage-groups pada tanaman kelapa sawit. Hasil penelitian yang dilakukan oleh

Zaki et al. (2010) menunjukkan hasil bahwa marka SSR merupakan marka

molekuler yang dapat dimanfaatkan untuk mempelajari struktur populasi dan

konsevasi pada populasi E. oleifera. Ajambang et al. (2012) menunjukkan penggunaan marka SSR sangat tepat untuk mengungkap keragaman genetik dan

distribusi genetik tanaman kelapa sawit asal Kamerun. Varietas liar tanaman

kelapa sawit asal Kamerun dapat sangat bermanfaat sebagai sumber gen baru dan

dapat digunakan untuk mempelajari keberadaan gen-gen baru. Kesimpulan

selanjutnya menyarankan bahwa untuk tujuan pemuliaan dan konsevasi Ajambang

et al. (2012) menyarankan untuk menyeleksi pada tingkat famili. Putri (2010) telah menggunakan marka SSR untuk menganalis keragaman alel pada kelapa

(7)

BAHAN DAN METODE

Tempat Penelitian dan Waktu

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium DNA, Socfindo Seed

Production Laboratory (SSPL), Bangun Bandar dengan ketinggian ± 25 m dpl. Penelitian ini dimulai pada bulan Maret - Mei 2016.

Bahan dan Alat Penelitian

Sampel yang digunakan objek penelitian berasal dari turunan kelapa sawit

material genetik PT Socfindo terdiri atas :

1. SL 4642, turunan dari (BB 6295 D (SL 834) x BB 15325 T (PO 6144).

2. SL 4556, turunan dari (BB 5235 D (SL 725) x BB 8978 P (PO 5918).

3. SL 4543, turunan dari (BB 6776 D (SL 726) x BB 9164 P (SL 956).

4. SL 4544, turunan dari (BB 6920 D (SL 710) x BB 9164 P (SL 956).

5. SL 5332, turunan dari (BB 8619 T (LM 12108) x BB 6912 D (SL 710).

Bahan lain yang digunakan, nitrogen cair 0.1 g, buffer CTAB, buffer

TAE, buffer TE, chloroform isoamilakohol (KIAA) dengan perbandingan 24 : 1, NaCl, NaOH, Na-EDTA, HCl, dan 70% isopropanol dingin, β-mercaptoetanol

dingin 2%, primer oligonukleotida, Master Mix (Promega M7122), PCR

Bioladder III ukuran 100 bp, acrylamide, APS 10% dan temed., 6Mgel

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain kertas tisu,

timbangan digital, hot plate (biosan), mortar, centrifus (Eppendorf 5415), vortex, freezer, microtube 2.0 ml dan 1.5 ml, mikropipet ukuran 1-50 µl, 100-500 µl,

(8)

kamera, water bath, pH meter elektrik, perangkat elektroforesis, pengaduk

magnetik, alat-alat gelas (gelas ukur, gelas beker, erlemeyer), elektroforesis

(Power PAC 3000, biorad), PCR (Thermal cycler) Applied Biosystem, Gel

Documentation System-UVP-DigiDoc-It 130 (Ultra-Violet Product Ltd.) masker dan alat tulis, serta alat lain yang mendukung penelitian ini.

Metode Penelitian

Penelitian ini dengan metode marka SSR dengan prinsip PCR yang

menggunakan 4 primer SSR.

Prosedur Penelitian

Pengambilan Sampel Daun

Penelitian diawali dengan pengambilan sampel turunan kelapa sebanyak

10 sampel untuk 5 famili (total 50 sampel) (SL 4662, SL 4556, SL 4543, SL 4544

dan SL 5532) serta 1 sampel dari masing-masing tetua betina dan tetua jantan

(total 10 sampel) ke-5 famili dimaksud. Selain itu juga ditambah 2 genotipe

pembanding yaitu genotipe X dan Y. Maka jumlah seluruh sampel sebanyak 62

tanaman.

Analisis Molekuler

Isolasi DNA

Isolasi DNA dilakukan terhadap daun kelapa sawit kesatu. Daun yang

digunakan adalah daun ke satu dari turunan kelapa sawit di lapang. Prosedur

isolasi DNA diadaptasi dari metode CTAB oleh Orozco-Castilo (1994) dengan

(9)

dilakukan dengan cara membuang tulang daun lalu dicuci dan dikeringkan dengan

tisu. Sebanyak ± 0.5 g daun digerus menggunkan mortar sambil ditambahkan

nitrogen cair PVPP. Setelah halus, sampel dimasukkan ke dalam sentrifus yang

berisi 1 ml buffer ekstraksi CTAB dan 2-mercaptoethanol10 µl kemudian diaduk menggunakan vortex dan diinkubasi dalam waterbath selama 30 menit pada suhu

65ºC. Setiap 10 menit sekali dibolak balik dengan perlahan-lahan. Setelah itu,

diinkubasi pada suhu ruang 4-5 menit, kemudian ditambahkan 1 ml kloroform :

isoamilalkohol (24:1).

Sampel disentrifius dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang selama

10 menit. Supernatan yang diperoleh dipindahkan pada tabung sentrifius lain, lalu

ditambahkan 1 ml kloroform : isoamilalkohol (24:1) dikocok dengan vortex dan

disentrifius lagi dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu 4ºC selama 10 menit.

Supernatan yang telah diperoleh kemudian dipindahkan lalu ditambahkan 1 ml

isopropanol dingin. Supernatan dihomogenkan dengan membolak-balik tabung,

lalu disimpan dalam lemari es (4ºC) selama 30 menit, kemudian disentrifius lagi

dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu 4ºC selama 10 menit. Supernatan yang

diperoleh dibuang kemudian pelet dikering-anginkan. Pelet yang sudah kering

dilarutkan dengan buffer TE sebanyak 100 µl, kemudian dispin manual hingga

homogen.

Selanjutnya, ditambahkan dengan etanol absolut dingin, lalu dibolak –

balik hingga homogen. Lalu, dinkubasi dalam freezer (-20ºC) selama 30 menit

kemudian disentrifius lagi dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu 4ºC selama 10

(10)

dikeringkan. Pelet DNA yang sudah kering dilarutkan dengan 100 µl buffer TE,

kemudian simpan DNA dalam freezer (-20ºC).

Uji Kualitas DNA

Gel agarose 0.8 % dibuat dari 0.28 g agaros dan 35 ml larutan TAE 1x,

kemudian dipanaskan hingga larut dengan menggunakan hot plate dan

didinginkan pada suhu kamar hingga hangat. Selanjutnya, ditambahkan 0.5 µl

EtBr dan dituang ke dalam cetakan gel elektroforesis yang telah dipasang sisir

(cetakan sumur) hingga gel memadat. Gel yang sudah padat dipindahkan ke dalam

bak elektroforesis. Sampel yang akan dielekstroforesis dicampur dengan loading

dye dengan perbandingan 5:1 (DNA: loading dye). Setelah dicampur maka diinjeksi kedalam sumur gel agaros dengan menggunakan pipet mikro. Setelah

semua sampel selesai diinjeksi maka alat elektroforesis dihubungkan ke power

supply 50 watt yang dialiri tegangan listrik 80 volt dengan amperemeter sebesar 400 mA selama 45 menit. Hasil elektroforesis diamati dengan bantuan lampu UV

dalam transilluminator dan didokumentasikan dengan menggunakan gel

documentation.

Uji Kuantitas DNA

Pengujian kuantitas DNA dilakukan dengan metode spektrometer pada

panjang gelombang (λ) 260 dan 280 nm dengan menggunakan stok DNA hasil

isolasi dan pemurnian. DNA mempunyai kemurnian tinggi jika ratio nilai

absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm berkisar antara 1,8 – 2,0

(11)

Amplifikasi PCR-Pemilihan Marka Mikrosatelit (SSR)

Primer SSR yang digunakan sebanyak 4 primer yang telah terpilih

mengacu pada Billotte et al.(2005). Primer yang digunakan adalah mCnCIR0038,

mEgCIR0894, mEgCIR3292 dan mEgCIR3663. Volume untuk setiap reaksi produk PCR sebesar 25 ul yang terditi atas _{Go Taq PCR 12.5 μl,}nuclease free

water 8.5 μl, forward primer 1 μl, referse primer 1 μl d an DNA sampel 2 μl. Amplifikasi PCR dilakukan pada Eppendorf Mastercycler ep 384 (Eppendorf, Wertbuy, New York, USA). Program running PCR didasarkan pada penelitian

Putri (2010) yang terdiri atas siklus denaturasi awal 4 menit pada suhu 94ºC,

diikuti 35 siklus denaturasi 94ºC, selama 30 detik, tahapan penempelan 52ºC

selama 1 menit 15 detik, perpanjangan 72ºC selama 1 menit 30 detik, dan elongasi

akhir pada 72ºC selama 8 menit.

Visualisai hasil amplifikasi DNA dengan marka SSR

Hasil amplifikasi DNA dilakukan dengan Elektroforesis Vertikal

(Elektroforesis PAGE) dengan gel poliacrylamide 8% (29 : 1). Tahap pengujian dilakukan dengan cara disiapkan gel plate, spacer dan comb dicuci dengan air dan etanol teknis, kemudian dirangkai. Sebelum membuat gel, terlebih dahulu dibuat

larutan acrylamide-bisacrylamide (29 : 1) yang dibuat dari 29 g acrylamide, 1 g

bisacrylamide dilarutkan dalam aquadest hingga 100 ml. Pembuatan gel acrylamide 8% dengan volume 30 ml, terdiri dari larutan acrylamide -bisacrylamide (29 : 1) sebanyak 8 ml, TAE 10X sebanyak 3 ml, aquadest steril

sebanyak 19 ml, Amonium persulfat 10% (APS) sebanyak 150 µl dan TEMED

sebanyak 20 µl. Dicampurkan semua bahan pembuatan gel tersebut, lalu

(12)

Gel didiamkan memadat selama ± 60 menit. Gel polyacrylamide yang telah memadat dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis vertikal dan dimasukkan

buffer TAE 1X. Setelah siap, produk PCR sebanyak 4 µl dicampurkan dengan

loading dye sebanyak 1 µl, campuran tersebut dimasukkan ke dalam sumur gel

dan disertakan DNA marker 50 bp Ladder sebanyak 2 µl sebagai pembanding

pada sumur pertama dan terakhir, untuk melihat panjang DNA. Elektroforesis

vertikal dijalankan dengan 100 volt, 25mA selama 120 menit. Gel divisualisasi

dengan pewarnaan etidium bromida. Gel diletakkan dan digoyang dalam baki

berisi larutan etidium bromida selama 5 menit dan dicuci dengan ddH2O selama

10 menit. Hasil elektroforesis diamati dan didokumentasi dengan

UV-transilluminator (UV Doc-its) dan Gel-Doc (U Doc-its).

Analisis Data

Analisis data berdasarkan hasil skoring pita DNA pada gel acrylamide. Pita diskor secara manual sebagai data biner dengan ada pita (1) atau tidak ada (0)

pita. Analisis data untuk mengetahui kisaran panjang alel dilakukan dengan

menggunakan UV-Tec Cambridge. Nilai polymorphic information content (PIC) untuk marka SSR dihitung dengan menggunakan software Power Marker 3.25 (Liu, 2005). Botsein et al. (1980) mengklasifikasikan nilai PIC menjadi 3 kelas yaitu: PIC > 0.5: sangat informatif; 0.25 > PIC < 0.5: sedang dan PIC < 0.25:

rendah.

Berdasarkan pola pita yang muncul untuk memvalidasi turunan dengan

tetua, dihitung persentase turunan yang sesuai dengan tetua. Untuk menghitung

jumlah alel (Na), jumlah alel efektif (Ne), frekuensi alel, heterozigositas

(13)

Gen Alex ver.6.501 (Peakall dan Smouse, 2012). Serta untuk membuat filogenetik

UPGMA dan menghitung jarak genetik antar individu digunakan software

(14)

HASIL DAN PEMBAHASAN

Uji Kualitas Keturunan Kelapa Sawit Material Genetik PT Socfindo

Uji kualitas merupakan salah satu tahapan dari proses isolasi DNA.

Tahapan ini dilakukan untuk mengetahui bagaimana tingkat kemurnian hasil

isolasi DNA yang telah dilakukan. Pada tahapan ini juga akan diperoleh gambaran

visualisasi hasil isolasi dengan menggunakan metode elektroforesis yang

divisualisasikan dengan menggunakan gel dokumentasi. Gel dokumentasi akan

memperlihatkan bagaimana visualisasi DNA dan senyawa kimia lain yang

terbawa selama proses isolasi DNA .

Ketika proses isolasi DNA berlangsung stok DNA yang dihasilkan

biasanya tidak 100% murni. Artinya bahwa ada senyawa kimia lain yang terbawa,

senyawa tersebut dapat berupa senyawa metabolit sekunder, polisakarida, lipid,

protein, karbohidrat dan senyawa-senyawa lain yang masih melekat pada DNA.

Jika senyawa-senyawa ini berada dalam konsentrasi yang tinggi pada DNA stok

maka akan dapat mengganggu proses amplifikasi saat proses PCR.

Berdasarkan Gambar 1 dapat diketahui bahwa dari 13 sampel DNA yang

telah diuji (hasil uji visualisasi 49 sampel lainnya dapat dilihat pada Lampiran 2),

seluruhnya memperlihatkan adanya pita DNA. Keberadaan pita DNA tersebut

diduga tercampur dengan senyawa lain selain DNA. Hal ini ditunjukkan oleh

adanya smear yang mengikuti DNA hasil ekstraksi, keberadaan smear tersebut dapat mempengaruhi tingkat keberhasilan penempelan primer pada saat proses

(15)

INB INJ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 INB1 INJ1 11 12 13

Gambar 1. Visualisasi uji kualitas DNA kelapa sawit dari material genetik PT Socfindo

Keterangan : (1) Pita DNA hasil ekstraksi ; (2) Smear yang mengikuti hasil ekstraksi DNA, INB : Induk Betina, INJ : Induk Jantan

Berdasarkan Gambar 1 menunjukkan hasil uji kualitas DNA material

genetik PT. Socfindo yang memperlihatkan bahwa DNA telah berhasil diisolasi

dari tanaman sampel yang ditunjukkan oleh lingkaran No.1. Keberhasilan hasil uji

kualitas ini dapat dipengaruhi oleh berbagai faktor seperti umur tanaman sampel,

bahan yang digunakan selama proses isolasi dan metode yang digunakan pada saat

isolasi. Pada umumnya DNA tanaman dapat diisolasi pada jaringan yang masih

muda yang ditandai oleh warna daun. Warna daun mengindikasikan senyawa yang

terkandung didalam jaringan yang diisolasi, semakin berwarna hijau tua maka

kandungan polisakarida, karbohidrat, dan lipid yang dikandung oleh individu

tersebut semakin tinggi sehingga proses isolasi yang dilakukan akan semakin

sulit.

Faktor lain yang dapat mempengaruhi kemurniaan DNA hasil ekstraksi

adalah metode yang digunakan pada saat proses isolasi. Sejauh ini metode yang

paling umum digunakan adalah metode Doyle dan Doyle (1990) atau metode

Orosco-Castilo, et al. (1994). Kedua metode ini lebih mudah dalam

pelaksanaannya dan sangat sesuai digunakan untuk pemula. Penelitian ini sendiri

mengggunakan metode Orosco-Castilo, et al. (1994) dengan beberapa modifikasi

1

(16)

CTAB. CTAB berperan untuk melisis organel sel namun tidak merusak struktur

DNA tanaman sedangkan nitrogen cair berfungsi untuk menjaga mencegah

kerusakan pada DNA ketika dilakukan penggerusan.

Uji Kuantitas Keturunan Kelapa Sawit Material Genetik PT Socfindo

Setelah dilakukan pengujian secara visual, maka langkah selanjutnya

adalah uji kuantitas. Sama halnya dengan uji kualitas, uji kuntitas juga dilakukan

untuk melihat tingkat kemurnian dan konsentrasi DNA hasil isolasi. Perbedaannya

dengan uji kualitas yaitu uji kualitas dengan menggunakan metode elektroforesis

maka uji kuantitas dengan menggunakan metode spektrometer.

Pengujian dengan menggunakan metode spektrometer adalah metode yang

digunakan dengan melihat hasil perbandingan absorbansi pada panjang

gelombang 260 Å dan 280 Å. Hasil uji kuantitas yang baik ditunjukkan oleh nilai

absorbansi antara 1.80 sampai dengan 2.00. Hal ini terdapat pada Sambrook et.

al. (1980) yang menyatakan bahwa nilai absorbansi DNA terletak pada rasio perbandingan panjang gelombang 260 Å dan 280 Å yaitu antara 1.80 hingga

2.00. Hasil uji kuantitas dari material genetik PT Socfindo pada penelitian ini

dapat dilihat pada Lampiran 36. Pengujian yang dilakukan pada penelitian ini

menunjukkan nilai absorbansi 260 Å dan 280 Å terletak diantara 1.36 sampai

dengan 2.11.

Kemurnian DNA yang sesuai dengan Sambrook et al. (2001) ditunjukkan oleh sampel Y (1.87), No.38 (1.94), No. 34 (1.82), dan sampel No.13 (1.89).

Kelima sampel tersebut merupakan sampel yang memiliki nilai absorbansi yang

paling baik jika dibandingkan dengan nilai absorbansi pada sampel lainnya. Nilai

(17)

banyak mengandung RNA sedangkan nilai absorbansi dibawah 1.80 menunjukkan

bahwa DNA yang telah diisolasi mengadung protein, lipid dan karbohidrat.

Konsentrasi DNA stok hasil ekstraksi menunjukkan hasil yang beragam,

konsentrasi DNA tertinggi terdapat pada DNA pembanding yaitu pada genotipe X

dengan konsentrasi 290 ng/uL sedangkan konsentrasi DNA terendah adalah

sebesar 15 ng/uL. Nilai absorbansi dan konsentrasi DNA juga akan mempengaruhi

hasil gel dokumentasi dimana jika pita yang terdokumentasikan kelihatan tipis

atau redup dapat disebabkan oleh konsentrasi DNA yang terlalu sedikit dan jika

nilai absorbansi tidak berada pada kisaran 1.80 hingga 2.00 dapat menyebabkan

terjadinya smear akibat tingginya kandungan polisakarida dan senyawa-senyawa

fenolik. Weeden et al. (1992) menjelaskan bahwa cetakan DNA yang

mengandung senyawa polisakarida dan senyawa fenolik serta konsentrasi DNA

yang terlalu rendah akan memperlihatkan DNA amplifikasi yang kurang jelas.

Selanjutnya Mulyani et al. (2011) menyebutkan bahwa smear merupakan sisa dari senyawa pada larutan yang secara tidak sengaja terbawa setelah proses isolasi

DNA dilakukan.

Profil Elektroforesis Pita Hasil Keturunan Kelapa Sawit Material Genetik

PT Socfindo

Hasil identifikasi genetik tanaman kelapa sawit dianalisis dengan

menggunakan metode elektroforesis yang akan menunjukkan adanya pola pita.

Pola pita tersebut merupakan DNA yang akan menunjukkan bagaimana keadaan

genom berdasarkan primer yang telah diamplifikasi pada saat proses PCR. Pada

penelitian ini telah diuji empat primer SSR. Hasil dari pengujian dari keempat

(18)

50bp 200bp 1200bp

100bp

Primer SSR merupakan primer yang bersifat heterozigot, dimana primer

ini mampu menunjukkan sepasang alel yang berasal dari induk yang berbeda,

sehingga dengan menggunakan primer SSR dapat menunjukkan keberadaan alel

dari induk betina dan induk jantan. Visualisasi hasil dari primer mCnCIR0038 pada sampel 1 sampai 6 dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2. Elektroforegram amplifikasi DNA kelapa sawit Sampel 1-6 (Persilangan SL-4642) Socfindo berdasarkan primer mCnCIR0038

Keterangan : L= PCRBIO Ladder III, IND : Induk betina BB 6925 D (SL-834), INJ : Induk Jantan BB 15325 T (PO 6144).

Berdasarkan Gambar 2 dapat diketahui bahwa sampel 1-6 adalah

persilangan SL-4642 yang merupakan hasil persilangan antara BB 6295 D

(SL-834) dan BB 15325 T (PO-6144). Berdasarkan hasil elektroforesis dapat

diketahui bahwa ukuran pita induk betina BB 6925 D (SL-834) terletak pada 105

bp sedangkan ukuran induk jantan BB 15325 T (PO-6144) terletak pada 94 bp.

Ukuran pita pada sampel 1-6 terletak pada ukuran 105 bp dan 94 bp. Visualisasi

selanjutnya dapat dilihat pada Gambar 3.

(19)

50bp 200bp 1200bp

100bp

Gambar 3. Elektroforegram amplifikasi DNA kelapa sawit Sampel 7-10 (Persilangan SL-4642), 11-12 (Persilangan SL-4556), Socfindo berdasarkan primermCnCIR0038

Keterangan : L= PCRBIO Ladder III, IND : Induk betina BB 5235 D (SL-725), INJ : Induk Jantan BB 8978 P (PO 5918).

diketahui bahwa ukuran pita pada sampel 7-10 terletak pada 105 bp dan 94 bp.

Profil elektroforegram selanjutnya diamati pada sampel 11 dan 12 adalah

(SL-725) dan BB 8978 P (PO-5918). Berdasarkan hasil pengukuran sampel 11 dan 12

terletak pada 102 bp dan 94 bp. Pengukuran pada induk betina BB 5235 D

(SL-725) yang terletak pada 102 bp dan induk jantan BB 8978 P (PO-5918) yang

terletak pada 94 bp. Visualisasi pengamatan hasil elektroforesis selanjutnya dapat

dilihat pada Gambar 4.

(20)

50bp 200bp 1200bp

100bp

50bp 200bp 1200bp

100bp

Gambar 4. Elektroforegram amplifikasi DNA kelapa sawit sampel 13-20 (Persilangan SL-4556), Socfindo berdasarkan primer mCnCIR0038

Keterangan : L= PCRBIO Ladder III, IND : Induk betina BB 5235 D (SL-725), INJ : Induk Jantan BB 8978 P (PO 5918).

(SL-725) dan BB 8978 P (PO-5918). Berdasarkan hasil elektroforesis dapat diketahui

bahwa ukuran pita pada sampel 13-20 terletak pada 102 bp dan 94 bp. Visualisasi

Gambar 5. Elektroforegram amplifikasi DNA kelapa sawit sampel 21-26 (Persilangan SL-4543) Socfindo berdasarkan primermCnCIR0038

Keterangan : L= PCRBIO Ladder III, IND : Induk betina BB 6776 D (SL-726), INJ : Induk Jantan BB 9164 P (SL-956)

L 13 14 15 16 17 18 19 20 L

(21)

50bp 200bp 1200bp

100bp

726) dan BB 6776 D (SL-956). Berdasarkan hasil elektroforesis dapat diketahui

bahwa ukuran pita induk betina BB 6776 D (SL-726) terletak pada 106 bp

sedangkan ukuran induk jantan terletak BB 6776 D (PO-6144) terletak pada 96

bp. Ukuran pita pada sampel 21-26 terletak pada ukuran 106 bp dan 94 bp

Visualisasi selanjutnya dapat dilihat pada Gambar 6.

Gambar 6. Elektroforegram amplifikasi DNA kelapa sawit sampel 27-30 (Persilangan SL-4543), 31-32 (Persilangan SL-4544) Socfindo berdasarkan primermCnCIR0038

(SL-726) dan BB 9164 P (SL-956). Berdasarkan hasil elektroforesis dapat diketahui

bahwa ukuran pita pada sampel 27 – 30 terletak pada 106 bp dan 96 bp . Profil

elektroforegram selanjutunya diamati pada sampel 31 dan 32 adalah persilangan

SL-4544 yang merupakan hasil persilangan antara BB 6920 D (SL-710) dan BB

9164 P (SL-956). Berdasarkan hasil pengukuran sampel 31 terletak pada 105

sedangkan sampel 32 terletak pada 109 bp dan 105 bp. Pengukuran pada induk

betina BB 6920 D (SL-710) yang terletak pada 105 bp dan induk jantan BB 9164

(22)

50bp 200bp 1200bp

100bp

P (SL-956) yang terletak pada 109 bp. Visualisasi pengamatan hasil elektroforesis

Gambar 7. Elektroforegram amplifikasi DNA kelapa sawit sampel 33-40 (Persilangan SL-4544), Socfindo berdasarkan primer mCnCIR0038

bahwa ukuran pita pada sampel 33-40 terletak pada 105 bp dan 109 bp.

(23)

50bp 200bp 1200bp

100bp

Gambar 8. Elektroforegram amplifikasi DNA kelapa sawit sampel 41-46 (Persilangan SL-5332) Socfindo berdasarkan primer mCnCIR0038

Keterangan : L= PCRBIO Ladder III, IND : Induk betina BB 8619 T (LM-12108), INJ : Induk Jantan BB 6912 D (SL-710)

persilangan SL-5332 yang merupakan hasil persilangan antara BB 8619 T

(LM-12108) dan SL-710. Berdasarkan hasil elektroforesis dapat diketahui bahwa

ukuran pita induk betina BB 8619 T (LM-12108) terletak pada 121 bp dan 112 bp

sedangkan ukuran induk jantan BB 6912 D (SL-710) terletak pada 108 bp.

Ukuran pita pada sampel 41, 43, dan 45 terletak pada ukuran 112 bp dan 108 bp

sedangkan sampel 42, 44 dan terletak pada ukuran 121 bp dan 108 bp. Visualisasi

(24)

50bp 200bp 1200bp

100bp

Gambar 9. Elektroforegram amplifikasi DNA kelapa sawit sampel 47-50 (Persilangan SL-5332) Socfindo berdasarkan primer mCnCIR0038

Keterangan: L= PCRBIO Ladder III, IND : Induk betina BB 8619 T (LM-12108), INJ : Induk Jantan BB 6912 D (SL-710), X : pembanding-I dan Y : Pembanding-II

persilangan (SL-5332) yang merupakan hasil persilangan antara BB 8619 T

(LM-12108) dan BB 6912 D (SL-710). Berdasarkan hasil elektroforesis dapat diketahui

bahwa ukuran pita induk betina BB 8619 T (LM-12108) terletak pada 121 bp dan

112 bp sedangkan ukuran induk jantan terletak BB 6912 D (SL-710) terletak pada

108 bp. Ukuran pita pada sampel 47 dan 50 terletak pada ukuran 121 bp dan 108

bp sedangkan sampel 48 dan 49 terletak pada ukuran 112 bp dan 108 bp. Sampel

I (X) terletak pada 110 bp dan 96 bp sedangkan sampel

pembanding-II (Y) terletak pada 111 bp dan 97 bp. Visualisasi selanjutnya dapat dilihat pada

Gambar 10.

(25)

50bp 200bp 1200bp

100bp

50bp 100bp 200bp 1200bp

Gambar 10. Elektroforegram amplifikasi DNA kelapa sawit sampel 1-6 (Persilangan SL-4642) Socfindo berdasarkan primer mEgCIR0257

Keterangan: L= PCRBIO Ladder III, IND: Induk betina BB 6925 D (SL-834), INJ : Induk Jantan BB 15325 T (PO 6144)

persilangan SL 4642 yang merupakan hasil persilangan antara BB 6925 D

(SL-834) dan BB 15325 T (PO-6144). Berdasarkan hasil elektroforesis dapat diketahui

bahwa ukuran pita induk betina BB 6925 D (SL-834) terletak pada 293 bp dan

268 bp sedangkan ukuran induk jantan BB 15325 T (PO-6144) terletak pada 268

bp dan 255 bp. Ukuran pita pada sampel 1-6 terletak pada ukuran 268 bp dan 255

bp. Visualisasi selanjutnya dapat dilihat pada Gambar 11.

Gambar 11. Elektroforegram amplifikasi DNA kelapa sawit sampel 7-10 (Persilangan SL-4642), 11-12 (Persilangan SL-4556), Socfindo berdasarkan primer mEgCIR0257

Keterangan: L= PCRBIO Ladder III, IND : Induk betina BB 5235 D (SL-725), INJ : Induk Jantan BB 8978 P (PO 5918)

L IND INJ 1 2 3 4 5 6 L

(26)

50bp 100bp 200bp 1200bp

834) dan BB 15325 T (PO-614). Berdasarkan hasil elektroforesis dapat diketahui

bahwa ukuran pita pada sampel 7-10 terletak pada 268 bp dan 255 bp. Profil

elektroforegram selanjutunya diamati pada sampel 11 dan 12 adalah persilangan

8978 P (PO-918). Berdasarkan hasil pengukuran sampel 11 dan 12 terletak pada

220 bp dan 207 bp. Pengukuran pada induk betina BB 5235 D (SL-725) yang

terletak pada 102 bp dan 207 bp sedangkan induk jantan BB 8978 P (PO-5918)

yang terletak pada 227 bp dan 220 bp. Visualisasi pengamatan hasil elektroforesis

Gambar 12. Elektroforegram amplifikasi DNA kelapa sawit sampel 13-20 (Persilangan SL-4556), Socfindo berdasarkan primermEgCIR0257

Keterangan: L= PCRBIO Ladder III

bahwa ukuran pita pada sampel 13-20 terletak pada 220 bp dan 207 bp.

(27)

50bp 100bp 200bp 1200bp

Gambar 13. Elektroforegram amplifikasi DNA kelapa sawit sampel 21-26 (Persilangan SL-4543) Socfindo berdasarkan primer mEgCIR0257 0257

Keterangan: L= PCRBIO Ladder III, IND: Induk betina BB 6776 D (SL-726), INJ : Induk Jantan BB 9164 P (SL-956)

219 bp sedangkan ukuran induk jantan terletak BB 9164 P (SL-956) terletak pada

234 bp dan 219 bp. Ukuran pita pada sampel 21, 25 dan 26 terletak pada ukuran

241 bp dan 234 bp, sampel 22 terletak pada ukuran 234 bp dan 219 bp sedangkan

sampel 22 dan 23 terletak pada ukuran 227 bp dan 219 bp. Visualisasi selanjutnya

dapat dilihat pada Gambar 14.

(28)

50bp 100bp

200bp 1200bp

Gambar 14. Elektroforegram amplifikasi DNA kelapa sawit sampel 27-30 (Persilangan SL-4543), 31-32 (Persilangan SL-4544) Socfindo berdasarkan primer mEgCIR0257 Keterangan: L= PCRBIO Ladder III, IND : Induk betina BB 6920 D (SL-710), INJ : Induk Jantan BB 9164 P (SL-956)

bahwa ukuran pita pada sampel 27 dan 28 terletak pada 234 bp dan 219 bp,

sampel 29 terletak pada 241 bp dan 234 bp sedangkan sampel 30 terletak pada

227 bp dan 219 bp. Profil elektroforegram selanjutunya diamati pada sampel 31

dan 32 adalah persilangan 4544 yang merupakan hasil persilangan antara

SL-710 dan SL-956. Berdasarkan hasil pengukuran sampel 31 terletak pada 220 bp

dan 205 bp sedangkan sampel 32 terletak pada 234 bp dan 220 bp. Pengukuran

pada induk betina BB 6920 D (SL-710) yang terletak pada 234 bp dan 216 bp

sedangkan induk jantan BB 9164 P (SL-956) yang terletak pada 220 bp dan 205

bp. Visualisasi pengamatan hasil elektroforesis selanjutnya dapat dilihat pada

Gambar 15.

(29)

50bp 100bp 200bp 1200bp

Gambar 15. Elektroforegram amplifikasi DNA kelapa sawit sampel 33-40 (Persilangan SL-4544), Socfindo berdasarkan primer mEgCIR0257

Keterangan: L= PCRBIO Ladder III

bahwa ukuran pita pada sampel 33 dan 36 terletak pada 234 bp dan 205 bp,

sampel 35 terletak pada 220 bp dan 205 bp, sampel 36-39 terletak pada 234 bp

dan 220 bp sedangkan sampel 40 terletak pada 216 bp dan 205 bp. Visualisasi

Keterangan: L= PCRBIO Ladder III, IND : Induk betina BB 8619 T (LM-12108), INJ : Induk Jantan BB 6912 D (SL-710)

L 33 34 35 36 37 38 39 40 L

(30)

50bp 100bp 200bp 1200bp

214 bp sedangkan ukuran induk jantan BB 6912 D (SL-710) terletak pada 229 bp

dan 224 bp. Ukuran pita pada sampel 41-46 terletak pada ukuran 224 bp dan 214

Keterangan: L= PCRBIO Ladder III, IND : Induk betina BB 8619 T (LM-12108), INJ : Induk Jantan BB 6912 D (SL-710), X : pembanding-I dan Y : Pembanding-II

persilangan 5332 yang merupakan hasil persilangan antara LM-12108 dan

SL-710. Berdasarkan hasil elektroforesis dapat diketahui bahwa ukuran pita induk

betina (LM-12108) terletak pada 235 bp dan 214 bp sedangkan ukuran induk

jantan terletak (SL-710) terletak pada 229 dan 224 bp. Ukuran pita pada sampel

47-50 terletak pada ukuran 229 bp dan 214 bp. Sampel pembanding-I (X) terletak

pada 227 bp dan 187 bp sedangkan sampel pembanding-II (Y) terletak pada 203

bp dan 183 bp. Visualisasi selanjutnya dapat dilihat pada Gambar 18.

(31)

50bp 100bp 200bp 1200bp

Keterangan: L= PCRBIO Ladder III, IND: Induk betina BB 6295 D (SL-834), INJ: Induk Jantan BB 15325 T (PO 6144)

diketahui bahwa ukuran pita induk betina BB 6295 D (SL-834) terletak pada 225

bp dan 215 bp sedangkan ukuran induk jantan BB 15325 T (PO-6144) terletak

pada 234 bp dan 211 bp. Ukuran pita pada sampel 1-6 terletak pada ukuran 225 bp

dan 211 bp. Visualisasi selanjutnya dapat dilihat pada Gambar 19.

Gambar 19. Elektroforegram amplifikasi DNA kelapa sawit sampel 7-10 (persilangan SL-4642), 11-12 (persilangan SL-4556), Socfindo berdasarkan primer mEgCIR3663 Keterangan : L= PCRBIO Ladder III, IND : Induk betina BB 5235 D (SL-725), INJ : Induk Jantan BB 8978 P (PO 5918)

L IND INJ 1 2 3 4 5 6 L

(32)

100bp 200bp 1200bp

200bp

834) dan BB 15325 T (PO-614). Berdasarkan hasil elektroforesis dapat diketahui

bahwa ukuran pita pada sampel 7 dan 9 terletak pada 225 bp dan 211 bp

sedangkan sampel 234 dan 225 terletak pada 234 bp dan 225 bp. Profil

elektroforegram selanjutnya diamati pada sampel 11 dan 12 adalah persilangan

8978 P (PO-918). Berdasarkan hasil pengukuran sampel 11 dan 12 terletak pada

212 bp dan 204 bp. Pengukuran pada induk betina BB 5235 D (SL-725) yang

terletak pada 217 bp dan 212 bp sedangkan induk jantan BB 8978 P (PO-5918)

terletak pada 204 bp. Visualisasi pengamatan hasil elektroforesis selanjutnya

Keterangan : L= PCRBIO Ladder III

persilangan SL-4556 yang merupakan hasil persilangan antara SL-725 dan

PO-5918. Berdasarkan hasil elektroforesis dapat diketahui bahwa ukuran pita pada

sampel 13-20 terletak pada 212 bp dan 204 bp. Visualisasi selanjutnya dapat

dilihat pada Gambar 21.

(33)

100bp 200bp 1200bp

200bp

Gambar 21. Elektroforegram amplifikasi DNA kelapa sawit sampel 21-26 (persilangan SL-4543) Socfindo berdasarkan primermEgCIR3663

190 bp sedangkan ukuran induk jantan BB 9164 P (SL-956) terletak pada 205 bp

dan 198 bp. Ukuran pita pada sampel 21 terletak pada ukuran 212 bp dan 205 bp,

sampel 22 terletak pada ukuran 198 bp dan 190 bp, sampel 23 terletak pada

ukuran 198 bp dan 194 bp sedangkan sampel 24-26 terletak pada 198 bp dan 212

(34)

L 27 28 29 30 INJ IND 31 32 L

100bp 200bp 1200bp

50 bp

Gambar 22. Elektroforegram amplifikasi DNA kelapa sawit sampel 27-30 (Persilangan SL-4543), 31-32 (Persilangan SL-4544) Socfindo berdasarkan primer mEgCIR3663 Keterangan : L= PCRBIO Ladder III, IND : Induk betina BB 6920 D (SL-710), INJ : Induk Jantan BB 9164 P (SL-956)

persilangan SL-4543 yang merupakan hasil persilangan antara BB 6776 (SL-726)

dan BB 8978 P (SL-956). Berdasarkan hasil elektroforesis dapat diketahui bahwa

ukuran pita pada sampel 27 dan 30 terletak pada 198 bp dan 209 bp, sampel 28

terletak pada 198 bp dan 214 bp sedangkan sampel 29 terletak pada 212 bp dan

205 bp. Profil elektroforegram selanjutnya diamati pada sampel 31 dan 32 adalah

persilangan 4544 yang merupakan hasil persilangan antara 710 dan

SL-956. Berdasarkan hasil pengukuran sampel 31 dan 32 terletak pada 217 bp dan

213 bp. Pengukuran pada induk betina BB 6920 D (SL-710) yang terletak pada

241 bp dan 213 bp sedangkan induk jantan BB 9164 P (SL-956) terletak pada

225 bp dan 217 bp. Visualisasi pengamatan hasil elektroforesis selanjutnya dapat

(35)

100bp 200bp 1200bp

50 bp

100bp 200bp 1200bp

50 bp

bahwa ukuran pita pada sampel 33 terletak pada 217 bp dan 213 bp, sampel 34

terletak pada 241 bp dan 213 bp, sampel 35 terletak pada 241 bp dan 225 bp,

sampel 36, 37 dan 40 terletak pada 217 bp dan 213 bp, sampel 39 terletak pada

225 bp dan 213 bp sedangkan sampel 40 terletak pada 217 bp dan 213 bp.

Keterangan : L= PCRBIO Ladder III, IND : Induk betina BB 8619 T (LM-12108), INJ : Induk Jantan BB 6912 (SL-710)

(36)

100bp 200bp 1200bp

50 bp

persilangan SL-5332 yang merupakan hasil persilangan antara BB 8619 T (

LM-12108) dan BB 6912 D (SL-710). Berdasarkan hasil elektroforesis dapat diketahui

sampel 42-43 terletak pada 232 bp dan 209 bp, sedangkan sampel 44-46 terletak

pada 220 bp dan 209 bp. Visualisasi selanjutnya dapat dilihat pada Gambar 25.

Keterangan : L= PCRBIO Ladder III, IND : Induk betina BB 8619 T (LM-12108), INJ : Induk Jantan BB 6912 D (SL-710), X : pembanding-I dan Y : Pembanding-II

209 bp sedangkan ukuran induk jantan BB 6912 D (SL-710) terletak pada 226 dan

220 bp. Ukuran pita pada sampel 47-48 terletak pada ukuran 226 bp dan 209 bp,

sampel 49 terletak pada 209 bp, sedangkan sampel 50 terletak pada 220 bp dan

(37)

100bp 200bp 1200bp

50 bp

209 bp. Sampel pembanding-I (X) terletak pada 122 bp dan 193 bp sedangkan

sampel pembanding-II (Y) terletak pada 206 bp dan 193 bp. Visualisasi

Keterangan : L= PCRBIO Ladder III, IND : Induk betina BB 6295 D (SL-834), INJ : Induk Jantan BB 15325 T (PO 6144)

persilangan SL-4642 yang merupakan hasil persilangan antara SL-834 dan

PO-6144. Berdasarkan hasil elektroforesis dapat diketahui bahwa ukuran pita induk

betina BB 6295 D (SL-834) terletak pada 279 bp dan 270 bp sedangkan ukuran

induk jantan terletak BB 15325 T (PO-6144) terletak pada 270 bp dan 260 bp.

Ukuran pita pada sampel 1, 2, 4, 5 dan 6 terletak pada ukuran 279 bp dan 260 bp

sedangkan sampel 3 terletak pada 270 bp dan 260 bp. Visualisasi selanjutnya

(38)

100bp 200bp 1200bp

50 bp

Gambar 27. Elektroforegram amplifikasi DNA kelapa sawit sampel 7-10 (Persilangan SL-4642), 11-12 (Persilangan SL-4556), Socfindo berdasarkan primer mEgCIR3785 Keterangan : L= PCRBIO Ladder III, IND : Induk betina BB 5235 D (SL-725), INJ : Induk Jantan BB 8978 P (PO 5918)

Berdasarkan Gambar 27. dapat diketahui bahwa sampel 7-10 adalah

(SL-834) dan BB 15325 T (PO-614). Berdasarkan hasil elektroforesis dapat diketahui

bahwa ukuran pita pada sampel 7 dan 8 terletak pada 279 bp dan 260 bp

sedangkan sampel 9 dan 10 terletak pada 270 bp dan 260 bp. Profil

elektroforegram selanjutnya diamati pada sampel 11 dan 12 adalah persilangan

8978 P (PO-918). Berdasarkan hasil pengukuran sampel 11 terletak pada 269 bp

dan 259 bp sedangkan sampel 12 terletak pada 282 bp dan 259 bp. Pengukuran

pada induk betina BB 5235 D (SL-725) yang terletak pada 282 bp dan 269 bp

sedangkan induk jantan BB 8978 P (PO-5918) terletak pada 269 bp dan 259 bp.

Visualisasi pengamatan hasil elektroforesis selanjutnya dapat dilihat pada

Gambar 28.

(39)

100bp 200bp 1200bp

50 bp

100bp 200bp 1200bp

50 bp

bahwa ukuran pita pada sampel 13, 15 dan 17 terletak pada 282 bp dan 269 bp

sedangkan sampel 14, 16, 18, 19 dsn 20 terletak pada 269 bp dan 259 bp.

Gambar 29. Elektroforegram amplifikasi DNA kelapa sawit sampel 21-26 (Persilangan SL-4543) Socfindo berdasarkan primer 3785

L 13 14 15 16 17 18 19 20 L

(40)

L 27 28 29 30 INJ IND 31 32 L

100bp 200bp 1200bp

50 bp

267 bp sedangkan ukuran induk jantan BB 9164 P (SL-956) terletak pada 267 bp

sampel 22 terletak pada ukuran 277 bp dan 267 bp, sedangkan sampel 23-26

terletak pada 267 bp dan 259 bp. Visualisasi selanjutnya dapat dilihat pada

Gambar 30.

Gambar 30. Elektroforegram amplifikasi DNA kelapa sawit sampel 27-30 (Persilangan SL-4543), 31-32 (Persilangan SL-4544) Socfindo berdasarkan primer mEgCIR3785 Keterangan : L= PCRBIO Ladder III, IND : Induk betina BB 6920 D (SL-710), INJ : Induk Jantan BB 9164 P (SL-956)

bahwa ukuran pita pada sampel 27, 28 dan 30 terletak pada 267 bp dan 259 bp,

sedangkan sampel 29 terletak pada 277 bp dan 259 bp. Profil elektroforegram

(41)

100bp 200bp 1200bp

50 bp

merupakan hasil persilangan antara BB 6920 D 710) dan BB 9164 P

(SL-956). Berdasarkan hasil pengukuran sampel 31 terletak pada 280 bp dan 250 bp

sedangkan sampel 32 terletak pada 269 bp dan 250 bp. Pengukuran pada induk

betina BB 6920 D (SL-710) yang terletak pada 280 bp dan 269 bp sedangkan

induk jantan BB 9164 P (SL-956) terletak pada 250 bp. Visualisasi pengamatan

hasil elektroforesis selanjutnya dapat dilihat pada Gambar 31.

bahwa ukuran pita pada sampel 33, 36, 38 dan sampel 40 terletak pada 280 bp dan

250 bp sedangkan sampel 34, 35, 37 dan 39 terletak pada 269 bp dan250 bp.

(42)

200bp 1200bp

50 bp 100bp

200bp 1200bp

50 bp 100bp

Gambar 32. Elektroforegram amplifikasi DNA kelapa sawit sampel 41-46 (Persilangan SL-5332) Socfindo berdasarkan primer mEgCIR3785 Keterangan : L= PCRBIO Ladder III, IND : Induk betina BB 8619 T (LM-12108), INJ : Induk Jantan BB 6912 D (SL-710)

dan 259 bp. Ukuran pita pada sampel 41-43 terletak pada ukuran 279 bp dan 259

bp, sampel 44 terletak pada 269 bp dan 259 bp, sedangkan sampel 45- 46 terletak

pada 270 bp dan 259 bp. Visualisasi selanjutnya dapat dilihat pada Gambar 33.

Gambar 33. Elektroforegram amplifikasi DNA kelapa sawit sampel 47-50 (Persilangan SL-5332) Socfindo berdasarkan primer mEgCIR3785 Keterangan : L= PCRBIO Ladder III, IND : Induk betina BB 8619 T (LM-12108), INJ : Induk Jantan BB 6912 D (SL-710), X : pembanding-I dan Y : Pembanding-II

persilangan 5332 yang merupakan hasil persilangan antara LM-12108 dan

SL-710. Berdasarkan hasil elektroforesis dapat diketahui bahwa ukuran pita induk

L INJ IND 41 42 43 44 45 46 L

(43)

betina (LM-12108) terletak pada 232 bp dan 209 bp sedangkan ukuran induk

jantan terletak (SL-710) terletak pada 226 dan 220 bp. Ukuran pita pada sampel

47-49 terletak pada terletak pada 270 bp dan 259 bp sedangkan sampel 50 terletak

pada 279 bp dan 259 bp. Sampel pembanding-I (X) terletak pada 268 bp

sedangkan sampel pembanding-II (Y) terletak pada 277 bp dan 268 bp.

Berdasarkan profil pita dari analisis elektroforesis dapat diketahui bahwa

pola pita yang dibentuk oleh marka SSR menunjukkan pola pita homozigot dan

heterozigot. Selain itu juga dapat diketahui bahwa pola pita yang telah dibentuk

mampu untuk menjelaskan bagaimana kemurnian genetik antara hasil persilangan

dengan tetua. Genotipe hasil persilangan akan menunjukkan pita yang berasal dari

kedua induknya, pita SSR yang ditunjukkan akan membentuk pola pita

kodominan. Inilah kelebihan dari marka SSR yang dapat menunjukkan sifat

kodominan atau alel yang berisfat diploid. Hal ini sesuai dengan pernyataan

Zulhermana (2009) yang menyatakan bahwa marka SSR menunjukkan sifat

kodominan dengan jumlah alel yang diperlihatkan pada tiap individu hanya 2 pita

(sesuai genom kelapa sawit diploid 2n=32). Putri et al. (2010) juga menjelaskan bahwa marka SSR bersifat polimorfis sehingga dapat dijadikan sebagai alat untuk

menganalisis pola pita pada keragaman genetik kelapa sawit Pisifera.

Analisis berbasis marka dengan menggunakan SSR akan dapat

menjelaskan bagaimana kemurnian genetik pada tanaman hasil persilangan. Jika

alel yang terlihat pada elektroforegram masih menunjukkan pola alel yang mirip

dengan tetuanya maka dapat dipastikan bahwa genotipe hasil persilangan tidak

(44)

selanjutnya. Asmono (1998) menjelaskan bahwa informasi molekuler yang telah

didapatkan dapat dijadikan sebagai petunjuk untuk kegiatan pemuliaan

selanjutnya.

Melalui penanda SSR yang ditunjukkan oleh pola pita hasil

elektroforegram akan diketahui bagaimana pola keragaman yang dihasilkan

sehingga akan dperoleh informasi tingkat keragaman ditingkat genetik sehingga

akan diperoleh kejelasan suatu individu yang sama secara penotip tetapi berbeda

secara genetik yang merupakan manifestasi dari keragaman genetik. Indrawan et

al. (2007) menjelaskan bahwa keragaman antar spesies sebagai manifestasi dari keragaman genetik. Analisis SSR di paragraph selanjutnya akan dilihat melihat

bagaimana pola pita kuantitatif hasil keturunan kelapa sawit berdasarkan marka

SSR.

Profil Kuantitatif Pola Pita Hasil Keturunan Kelapa Sawit Material Genetik

PT Socfindo

Setelah dilakukan uji kuantitas dan kualitas DNA hasil isolasi, maka

selanjutnya adalah melakukan proses PCR pada DNA tanaman yang telah berhasil

diisolasi dari genom tanaman. Proses PCR merupakan salah satu upaya yang

dilakukan untuk menggandakan sekuen tertentu sesuai dengan dengan primer

yang digunakan. Keberhasilan penggandaan sekuen tertentu untuk menempel pada

DNA target dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya adalah kesesuaian

primer dengan dengan DNA target, suhu anneling yang digunakan, dan kemurnian

DNA hasil ekstraksi.

Primer yang dipilih merupakan primer yang sesuai dengan nukleotida

(45)

target sehingga dapat digandakan untuk diidentifikasi bagaimana pola pita yang

dihasilkan. Jika sekuen nukleotida yang digunakan tidak sesuai maka proses

penggandaan tidak akan akan terjadi. Surrahmann et al. (2007) menjelaskan bahwa pemilihan primer yang sesuai dengan DNA target akan mempengaruhi

keberhasilan proses amplifikasi, oleh sebab itu pengujian primer perlu dilakukan

untuk mendapatkan primer-primer informatif. Primer yang informatif tersebut

akan dapat menunjukkan adanya keragaman pada genotipe tanaman yang sedang

diuji.

Keberhasilan proses PCR juga dipengaruhi oleh suhu annneling, hal ini

sesuai dengan pernyataan Suryanto (2003) yang menjelaskan bahwa suhu

berpengaruh pada penempalan enzim taq-polimerase. Pada proses anneling terjadi penempelan oleh enzim taq-polimerase, jika suhu yang digunakan pada saat PCR tidak sesuai maka proses amplifikasi tidak akan terjadi. Suhu anneling pada

masing-masing DNA individu berbeda-beda, tergantung dari jenis spesies yang

digunakan dan juga primer yang dipakai.

Kemurniaan DNA juga dapat mempengaruhi keberhasilan pada saat proses

amplifikasi dimana jika DNA yang digunakan masih mengandung banyak zat lain

(lipid, polisakarida, protein dan RNA) maka akan dapat menyebabkan terjadinya

gangguan pada saat penempelan DNA karena zat-zat ini akan mengganggu

aktifitas enzim polymerase (Weising et al. 2005).

Pada penelitian yang telah dilakukan memperlihatkan bahwa proses PCR

telah berhasil dilakukan artinya bahwa dari empat primer yang digunakan,

(46)

kuantitatif dari vertical polyacrilamide gel pada penelitian ini dapat dilihat pada Tabel. 1.

Tabel 1. Profil Kuantitatif hasil elektroforesis empat marka SSR pada kelapa sawit material genetik PT Socfindo

No. Primer Ukuran Alel (bp) N Na Ne Ho He PIC

1 mCnCIR0038 94-121 62 11.00 7.74 0.81 0.88 0.86

2 mEgCIR3785 250-282 62 11.00 7.93 0.97 0.87 0.86

3 mEgCIR3663 122-241 62 20.00 12.32 0.97 0.92 0.91

4 mEgCIR0257 183-293 62 17.00 11.05 1.00 0.91 0.90

Rataan 14.75 9.77 0.93 0.90 0.88

Keterangan : N : jumlah sampel; Na : Jumlah alel teramati; Ne : Jumlah alel efektif; Ho: nilai heterozigositas teramati; He : Nilai heterozigositas harapan; PIC : kandungan informasi polimorfisme

Berdasarkan Tabel 1. dapat diketahui bahwa sebaran panjang fragmen

hasil penelitian ini berkisar antara 94 sampai dengan 293 bp. Keberadaan ukuran

fragmen alel tersebut merupakan gambaran secara keseluruhan bagaimana

keragaman genetik dari sampel yang diuji. Semakin tinggi jumlah alel maka

tingkat keragaman genetik akan semakin meningkat.

Nilai PIC merupakan kemampuan primer untuk dapat menunjukkan

adanya polimorpisme pada materi genetik. Nilai PIC pada penelitian ini berkisar

antara 0.86 sampai dengan 0.91. Dengan nilai PIC tertingginya adalah primer

3663 dengan nilai PIC 0.91 sedangkan nilai PIC terendah terletak pada primer

3785. Berdasarkan Botsein et al. (1980) dapat diketahui bahwa keempat primer yang telah diuji termasuk kategori primer informatif. Primer informatif

maksudnya adalah primer-primer yang dapat menunjukkan adanya perbedaan

secara genetik antara individu yang satu dan lainnya.

Nilai PIC yang didapat pada penelitian lebih tinggi dibandingkan dengan

(47)

alel 4.71 dengan nilai PIC 0.60 dan Zulhermana (2009) dengan nilai PIC sebesar

0.68. Nilai PIC menggambarkan keragaman genetik, semakin tinggi nilai PIC

maka akan semakin tinggi pula keragaman alel per lokus.

Analisis Faktoral Principal Coordinates Analysis (PCoA) Marka SSR

Analisis selanjutnya adalah analisis PCoA, analisis ini dilakukan untuk

melihat sejauh mana keberhasilan primer dalam menunjukkan nilai keragaman

molekuler. Nilai keragaman molekuler merupakan nilai yang menunjukkan

bagaimana perbedaan genetik pada individu yang diuji. Adapun hasil perhitungan

nilai keragaman molekuler pada penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 2.

Berdasarkan hasil analisis PCoA dapat telah diperoleh hasil bahwa nilai

aksis 1 sebesar 23.23% dan aksis 2 sebesar 18.45%. Dengan demikian maka nilai

keragaman molekuer pada penelitian ini adalah sebesar 41.68 %. Artinya bahwa

kemampuan primer untuk membedakan genotipe secara molekuler antara satu

(48)

-.5 -.4 -.3 -.2 -.1 .1 .2 .3 .4 .5

Gambar 34. Analisis faktorial Principal Coodinates Analysis (PCoA) pada kelapa sawit material genetik PT Socfindo berdasarkan marka SSR

Berdasarkan analisis PCoA dapat diperoleh informasi sebaran pada

masing-masing indvidu. Jika diperhatikan pada Gambar 34 dapat diketahui bahwa

primer yang telah digunakan pada penelitian ini telah mampu untuk

mengelompokkan individu yang diamati sesuai dengan kelompok hasil

crossinngnya masing-masing. Hasil penelitian Putri (2010) menunjukkan nilai keragaman molekuler sebear 31.64% pada Origin Avros, Ekona, La Me, Ghana

dan Nigeria. Hasil penelitian ini memperlihatkan nilai keragaman molekuler yang

Aksis 1 (22.64%)

Aksis 2 (18.06%)

Kuadran I Kuadran II

(49)

lebih tinggi. Artinya bahwa kamampuan marka SSR yang telah diuji memiliki

kemampuan untuk menunjukkan adanya keragaman molekuler.

Jika dibandingkan dengan hasil penelitian Okoye et al. (2016) pada tetua yang digunakan oleh NIFOR (Nigerian Institute for Oil Palm Research) yang terdiri atas NIFOR dura parents, NIFOR tenera parents dan Deli Dura Nifor

menunjukkan nilai keragaman berdasarkan analisis PCoA sebesar 64.43%. Hal ini

berarti nilai keragaman pada penelitian ini lebih rendah. Hal ini dapat dijelaskan

bahwa genotipe yang telah mengalami proses persilangan akan mengalami erosi

genetik sehingga menghasilkan nilai keragaman yang lebih rendah dari tetua asal.

Syukur et al. (2012) menjelaskan bahwa penyerbukan sendiri menyebabkan

terjadinya tangkar dalam yang mengakibatkan peningkatan homozigositas dari

generasi ke generasi. Hal ini sebagai akibat pasangan gen-gen heterozigot akan

bersegregasi menghasilkan genotipe homozigot. Adanya erosi genetik akan dapat

mengakibatkan berkurangnya tingkat keragaman genetik. Hal ini dijelaskan oleh

Arias et al. (2012) yang menyatakan bahwa jumlah lokus polymorphic akan jauh lebih tinggi pada tipe liar pada populasi. Namun akan terjadi pengurangan alel

pada lokus akibat adanya proses persilangan.

Hasil analisis berdasarkan PCoA juga mampu untuk mengidentifikasi

pengelompokan setiap genotipe berdasarkan kriiteria tertentu. Apakah

(50)

I

Analisis Kluster Keturunan Kelapa Sawit Material Genetik PT Socfindo

Setelah dilakukan pengelompokkan berdasarkan keragaman molekulernya,

maka selanjutnya adalah dilakukan pengklusteran dengan menggunakan analisis

matrix dissimilarity simple matching. Adapun hasil analisis kluster dendogram keturunan kelapa sawit material genetik PT.Socfindo disajikan pada Gambar 36.

(51)

Berdasarkan Gambar 35 dapat diketahui bahwa setiap varietas hasil

persilangan antar tetua telah sesuai dan mengelompok sesuai dengan induk yang

digunakan pada saat persilangan. Berdasarkan dendogram matrix dissimliairity

simple matching telah dapat dibuktikan bahwa ada 5 kluster sampel yang diuji hal ini sesuai dengan 5 kelompok persilangan yang telah dilakukan. Pada kluster I

merupakan persilangan SL 4543 turunan dari hasil persilangan BB 6776 D

(SL-726) dengan BB 9164 P (SL-956), pada kluster II merupakan persilangan

SL 5332 turunan dari hasil persilangan BB8619 T (LM 12108) dengan BB 6912

D (SL710), pada kluster III merupakan persilangan SL-462 turunan hasil

persilangan BB 6295 (SL-834) dengan BB 15325 T ( PO-6144), pada kluster IV

merupakan persilangan SL-4544 turunan hasil persilangan BB 6920 D (SL-710)

dengan BB 9164(SL-9560 dan pada kluster V merupakan persilangan SL-4556

turunan hasil persilangan BB 5235 D (SL-725) dengan BB 8978 P (PO-5918).

Berdasarkan hal tersebut maka dapat diketahui bahwa penggunaan marka

mCnCIR0038, mEgCIR0257, mEgCIR3785 dan mEgCIR3663 telah mampu menunjukkan pengelompokan hasil persilangan sesuai dengan tetuanya. Hal ini

membuktikan bahwa penggunaan marka SSR dapat menunjukkan asal tetua dari

suatu hasil persilangan. Hal ini disebabkan oleh karena marka SSR bersifat

kodominan sehingga mampu mendeteksi keragaman genetik pada tanaman. Smith

et al. (1997) menjelaskan bahwa marka SSR merupakan marka molekuler yang bersifat kodominan, dapat mendeteksi keberadaan alel dengan variasi yang tinggi,

mendeteksi keragaman pada tanaman yang berkerabat dekat dan relatif sederhana.

(52)

pembanding yang terdiri atas genotipe X dan Y. Genotipe yang dijadikan

pembanding merupakan genotipe yang diperoleh secara acak. Penggunaan

genotipe X dan Y untuk mengkonfirmasi bahwa tanaman dalam setiap populasi

dalam persilangan telah mengelompok sesuai dengan tetua hasil persilangan.

Berdasarkan hal tersebut maka dapat diketahui bahwa tidak ada satu pun

dari genotipe hasil persilangan yang memiliki tingkat keragaman yang dekat

dengan genotipe pembanding. Hal ini membuktikan bahwa genotipe yang

digunakan dalam persilangan tidak terkontaminasi oleh genotipe X dan Y karena

berdasarkan hasil dendogram filogenetik kluster dari genotipe X dan Y terletak

pada cabang filogenetik yang berbeda. Hal ini berarti bahwa penggunaan marka

SSR dapat mengkonfirmasi kebenaran suatu hasil persilangan sehingga marka

SSR dapat digunakan untuk mengevaluasi plasma nutfah. Hal ini sesuai dengan

penelitian yang dilakukan oleh Singh et al. (2007) yang menjelaskan bahwa

marka SSR dapat digunakan sebagai quality qontrol pada produksi massal

tanaman klon kultur jaringan. Lebih lanjut, Powell et al. (1996) menjelaskan SSR memiliki tingkat polimorfisme yang tinggi sehingga dapat digunakan untuk

mengevaluasi plasma nutfah pada tanaman.

Berdasarkan dendogram filogenetik pada Gambar 35 dapat juga

dipahami bagaimana tingkat kedekatan antara genotipe. Berdasarkan hasil kluster

dapat diketahui bahwa individu yang memiliki tingkat keragaman yang sangat

rendah terdapat pada kluster I merupakan persilangan SL 4543 turunan dari hasil

persilangan BB 6776 D (SL-726) dengan BB 9164 P (SL-956), pada kluster III

merupakan persilangan SL-462 turunan hasil persilangan BB 6295 (SL-834)