II. MATERI DAN METODE PENELITIAN
1. Materi Penelitian, Lokasi dan Waktu Penelitian 1.1. Materi Penelitian
1.1.1. Alat
Alat yang digunakan adalah akuarium berukuran 40 X 60 X 60 cm3 dan ketinggian air adalah 40 cm, aerator, timbangan dengan ketelitian 0,1 g, ember, seser kain kassa, baki, alat bedah, homogeniser listrik, sentrifuse, spektrofotometer, tabung reaksi, tabung eppendorf, rak tabung,refrigerator, inkubator, pipet tetes,micro pipettedanpipette tip.
1.1.2. Bahan
trichloroacetic acid (TCA), larutan tyrosine standard (10 μ g/ml – 250 μ g/ml), larutan pati 1% dalam 20 mM natrium fosfat buffer pH 6,9,
mengandung 6,0 mM NaCl sebagai substrat, sampel enzim (0,5 ml) dan
0,5ml dinitrosalicylic acid (DNS). 1.2 Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian telah dilakukan di laboratorium Fisiologi Hewan Fakultas Biologi Unsoed. Uji aktivitas protease dan amilase akan dilakukan di laboratorium Riset Unsoed. Penelitian telah dilaksanakan selama enam bulan, dimulai pada bulan Januari sampai Juni 2013.
2. Metode Penelitian 2.1. Teknik Pengambilan Sampel
Metode yang digunakan dalam penelitian ini yaitu metode survei dengan pengambilan sampel dilakukan secara purposive random sampling yaitu mengambil sampel dengan ukuran tertentu yaitu besar, sedang dan kecil masing-masing 10 ekor, pengelompokan ikan ke dalam kisaran berat sebagai berikut berat 5-10 g, 11-25 g dan 35-50 g dan dengan kisaran panjang 9-10 cm, 11-12 cm dan 13-16 cm. Ikan dimasukkan ke dalam akuarium masing-masing 5 ekor, lalu diisolasi organ pencernaannya kemudian diambil hepatopankreas dan intestine (semua bagian).
2.2. Variabel yang diamati
gram tirosin per menit (protease) dan banyaknya mikro gram maltose per menit (amilase).
2.3. Cara kerja
Cara Kerja yang dilakukan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut : 2.3.1. Persiapan Akuarium
Akuarium yang digunakan dalam penelitian adalah akuarium fiber berukuran 40 x 60 x 60 cm³ yang diisi air tawar sebanyak ¾ akuarium dan diaerasi.
2.3.2. Pengadaan Ikan Uji
Ikan uji diperoleh dari Desa Beji kecamatan Kedung Banteng kabupaten Banyumas, dengan bobot awal sebesar 5-10 g, 11-25 g dan 35-50 g dan dengan kisaran panjang 9-10 cm, 11-12 cm dan 13-16 cm. 2.3.2. Penebaran Ikan Uji
Ikan Nilem (O. hasselti C.V.) dimasukkan ke dalam akuarium dengan padat penebaran sebanyak 5 ekor tiap akuarium yang terlebih dahulu diukur bobot dan panjangnya.
2.3.3. Aklimasi Ikan Uji
– 08.00 wib) dan sore hari (15.00 – 16.00 wib). Pengambilan sisa pakan diambil dengan cara penyiponan.
Gambar 2.1. Akuarium ikan uji 2.3.4. Pengukuran panjang dan bobot tubuh ikan
Pengukuran panjang tubuh ikan dilakukan menggunakan jangka sorong. Ikan diukur panjang tubuhnya dari ujung depan bagian moncong hingga ujung belakang bagian ekor. Bobot tubuh ikan diukur dengan menggunakan timbangan digital.
Gambar 2.2. Morfologi ikan nilem 2.3.5. Pembedahan ikan
Gambar 2.3. Saluran digesti ikan nilem
Pengguntingan dilakukan secara hati-hati agar organ yang terletak di sebelah dalam tidak ikut tergunting, kemudian daging bagian atas dibuka dengan pinset. Saluran digesti ikan diisolasi, setelah saluran digesti diperoleh lalu dimasukkan ke dalam botol film yang sudah diberi label lalu disimpan dalam lemari pendingin.
2.3.6. Preparasi homogenat hepatopankreas dan intestine (Nataliaet al.,
2004)
cairan supernatan ditampung untuk digunakan uji aktivitas enzim (Natalia et al., 2004). Kadar protein supernatan ditentukan dengan metode Lowryet al. (1951)dalamFurneet al. (2005). Larutan ekstrak enzim harus disimpan pada suhu sekitar 0°C atau dalamrefrigerator.
Gambar 2.4. Preparasi saluran digesti dengan homogenizer listrik
2.3.7. Penentuan kadar protein ekstrak kasar hepatopankreas dan intestine dengan metode Lowry (Furneet al., 2005)
a. Bahan dan Pereaksi
1) Larutan protein standar (0,05 mg/ml–1,0 mg/ml kasein) 2) Pereaksi A = 2 % Na2CO dalam 0,1 M NaOH
3) Pereaksi B = 0,5 % CuSO .5H O dalam 1 % Na-K tartat
4) Pereaksi C = campuran 50 ml pereaksi A dengan 1 ml pereaksi B 5) Pereaksi D = larutan 1 N pereaksi Folin Ciocalteu.
b. Prosedur
disiapkan untuk larutan protein standar (kasein). Masing-masing tabung diisi 0,5 ml larutan standar dengan konsentrasi berurut-urut 0,05 mg/ml, 0,10 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,50 mg/ml, dan 1,0 mg/ml. satu tabung untuk larutan sampel, ke dalam tabung sampel dimasukkan 0,5 ml larutan sampel (ekstrak vicera) yang kadarnya di bawah 0,25 mg/ml. Kesemua tabung (5 tabung standar dan semua tabung sampel) ditambah 5 ml pereaksi C. kemudian segera dikocok dan dibiarkan pada suhu kamar selama paling sedikit 10 menit, setelah 10 menit ditambahkan 0,5 ml pereaksi D, kocok segera dan dibiarkan pada suhu kamar selama 30 menit. Absorbansinya diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 660 nm, kemudian hasilnya dicatat dan dibuat kurva standarnya. Kadar protein sampel ditentukan dengan cara memplotkan angka absorbansi sampel ke dalam kurva standar.
2.3.8. Pengukuran Aktivitas Ekstrak Kasar Protease Digesti menggunakan Metode Hidrolisis Kasein (Hidalgoet al., 1999).
a. Bahan dan pereaksi
1) Larutan 0,1 M Glycine-HCl (pH 2,0 - 3,0) 2) Larutan 0,1 M Tris-HCl (pH 6,5–7,5)
3) Larutan 0,05 M Na HPO buffer (pH 8,0–9,0) 4) Larutan kasein 1 % (w/v)
5) Larutan 8 % (w/v) trichloroacetic acid (TCA)
b. Prosedur
Pengukuran aktivitas ekstrak kasar protease digesti menggunakan metode hidrolisis kasein yaitu disiapkan 7 buah tabung reaksi, masing-masing tabung diberi label. Satu buah tabung untuk sampel, satu buah tabung untuk kontrol, satu buah tabung untuk blanko dan 4 buah tabung keempat untuk standar dengan konsentrasi (larutan 0,01 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,10 mg/ml dan 0,25 mg/ml) larutan tirosin 1%. Tabung sampel diisi 0,35 ml larutan kasein 1%, 0,30 ml larutan buffer dan 0,10 ml larutan ekstrak kasar enzim; Diinkubasi selama 60 menit pada suhu 37°C, reaksi dihentikan dengan menambahkan 0,75 ml larutan tricholoacetic acid (TCA) 8%.
Tabung kontrol diisi larutan buffer sebanyak 0,30 ml, 0,10 ml akuades dan ditambahkan 0,75 ml TCA 8%, kemudian diinkubasi selama 60 menit pada suhu 37°C; Setelah inkubasi ditambahkan larutan kasein sebanyak 0,35 ml. Tabung blanko diisi dengan 0,30 ml buffer, 0,45 ml akuades, selanjutnya diinkubasi selama 60 menit pada suhu 37°C. setelah inkubasi ditambahkan dengan 0,75 ml TCA.
standarnya. Aktivitas enzim ditentukan dengan cara memplotkan angka absorbansi sampel ke dalam kurva standar.
2.3.9. Pengukuran Aktivitas Amilase Digesti dengan metode Somogy-Nelson (Hidalgoet al., 1999).
Disiapkan 7 buah tabung reaksi, masing-masing tabung diberi label. Satu buah tabung untuk sampel, satu buah tabung untuk kontrol, satu buah tabung untuk blanko dan 4 buah tabung untuk standar dengan konsentrasi (larutan 0,01 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,10 mg/ml dan 0,25 mg/ml) larutan maltosa 1%. Masing-masing tabung standar diisi dengan 0,70 ml larutan maltosa standar 1%, kemudian ditambah 0,10 ml akuades. Ke dalam tabung sampel diisi 0,70 ml amilum 1% dan ekstrak kasar enzim 0,10 ml, ke dalam tabung blanko diisikan 0,80 ml akuades, tabung kontrol diisi dengan 0,10 ml akuades dan ditambahkan 0,70 ml dinitrosalicylic acid (DNS).
3. Metode Analisis
