PENUNTUN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI DASAR

(1)

PENUNTUN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI DASAR

Disusun oleh :

Seveline, S.TP., M.Si.

Teknologi Pangan

Fakultas Bioindustri

Universitas Trilogi

Jakarta

2018

(2)

i Kata Pengantar

Buku petunjuk praktikum Mikrobiologi Dasar adalah buku yang dibuat untuk mempermudah mahasiswa dan mahasiswi program studi Teknologi Pangan Fakultas Bioindustri Universitas Trilogi untuk praktikum pada mata kuliah Mikrobiologi Dasar. Buku ini merupakan buku penuntun untuk mempermudah mahasiswa dalam mempersiapkan hal-hal yang berkaitan dengan praktikum Mikrobiologi Dasar.

Setiap topik praktikum dibagi dalam bagian yang berbeda-beda. Topik dimulai dari yang sederhana berupa dasar pengenalan alat berupa mikroskop dan dilanjutkan dengan topik-topik lanjutan yang agak rumit dan butuh persiapan yang lebih banyak. Topik praktikum menyertakan pendahuluan dari topik yang dipraktikumkan, tujuan dari topik yang dipraktikumkan, bahan dan metode yang digunakan dalam praktikum dan ada pula pertanyaan yang menunjang topik yang dipraktikumkan untuk mempermudah mahasiswa dalam mengembangkan pembahasan.

Akhir kata tidak ada gading yang tak retak tidak ada sesuatu yang sempurna, buku petunjuk ini masih jauh dari kesempurnaan. Semoga buku petunjuk praktikum Mikrobiologi Dasar ini mempermudah para mahasiswa untuk melakukan praktikum dan menyambungkan antara praktikum dengan teori yang diajarkan pada mata kuliah Mikrobiologi Dasar.

Jakarta, Januari 2018

Penyusun Seveline

(3)

ii Daftar Isi

Kata Pengantar i

Daftar Isi ii

Tata Tertib Laboratorium Mikrobiologi iii

I. Mikroskop

Melihat Bentuk dan Ukuran Mikroba dengan Mikroskop 1

Pengecatan Tunggal 5

Pengecatan Majemuk 8

Pengecatan Spora Bakteri Menurut Metode Klein dan Metode Wirtz 11 II. Media

Pembuatan Media Sederhana 14

III. Teknik Pembiakan

Teknik Pembiakan Murni 18

Penghitungan Koloni Bakteri 23

IV. Pengaruh Internal dan Eksternal pada Pertumbuhan Mikroorganisme

Pengaruh Oksigen pada Pertumbuhan Mikroorganisme 26 Pengaruh Tekanan Osmotik pada Pertumbuhan Bakteri (Pengaruh Penambahan Gula) 29 Pengaruh Tekanan Osmotik (Pengaruh Penambahan NaCl) 32

Pengaruh pH pada Pertumbuhan Bakteri 35

Pengaruh Suhu pada Pertumbuhan Mikroorganisme 38 V. Pengujian Biokimia pada Mikrooganisme

Uji IMViC (Indole-Methyl Red-Voges Proskauer-Citrate) 40

Pengujian TSIA (Triple Sugar-Iron Agar) 45

Pengujian Katalase 49

Fermentasi Gula-Gula Sederhana 52

(4)

iii

TATA TERTIB LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

1. DILARANG MAKAN, MINUM dan MEROKOK DI DALAM LAB

2. TAS DAN ALAT-ALAT YANG TIDAK DIPERLUKAN PADA SAAT PRAKTIKUM LETAKKAN DI TEMPAT YANG TELAH DISEDIAKAN

3. KENAKANLAH JAS LAB SEWAKTU ANDA MASUK

4. SETIAP KELOMPOK MENDAPAT 1 BAKI YANG BERISI KEBUTUHAN PRAKTIKUM DAN BERTANGGUNG JAWAB DENGAN ISI BAKI TERSEBUT : lap, Bunsen, ose, cawan petri dan tabung reaksi dll. BILA RUSAK/PECAH MAKA ANDA WAJIB MENGGANTI

5. SIAPKAN LOG BOOK YANG SUDAH ANDA TULIS PROSEDUR PRAKTIKUM

6. CUCI TANGAN DENGAN AIR SABUN SEBELUM DAN SESUDAH PRAKTIKUM (LAKUKAN HAL YANG SAMA BILA ANDA MENINGGALKAN LABORATORIUM UNTUK PERGI KE KAMAR KECIL)

7. HINDARI BICARA BERLEBIHAN

8. GUNAKAN SARUNG TANGAN, MASKER SERTA HAIR NET

9. JAUHKAN TANGAN ANDA DARI MULUT, HIDUNG DAN TELINGA SELAMA ANDA BEKERJA DI LAB

10. PERLAKUKAN ORGANISME YANG ANDA TANGANI SEBAGAI PATOGEN (MAMPU MENIMBULKAN PENYAKIT), MESKIPUN KEBANYAKAN BIAKAN YANG DISEDIAKAN DI LAB TIDAK BERBAHAYA TETAPI MUNGKIN DIANTARANYA BERBAHAYA

11. TIDAK DIPERKENANKAN MEMBAWA KE LUAR BIAKAN MIKROORGANISME APAPUN DARI RUANGAN LAB

12. MIKROORGANISME YANG ANDA TANGANI TIDAK SAMPAI TERCECER DAN TIDAK TERCAMPUR DENGAN MIKROORGANISME LAINNYA

13. BILA MEMECAHKAN TABUNG BERISI MIKROORGANISME, ATAU BILA BIAKAN MIKROORGANISME TERCECER SEGERA TUANGKAN DESINFEKTAN KE ATASNYA, SEKA DENGAN KERTAS SERAP ATAU LAP KERTAS DAN BUANG KE TEMPAT YANG TELAH DISEDIAKAN

14. ANDA BEKERJA DENGAN API/DEKAT DENGAN API, HATI-HATI JANGAN SAMPAI ADA KERTAS, RAMBUT ATAU BAHAN YANG MUDAH TERBAKAR

15. KALAU TERJADI KESALAHAN ATAU KECELAKAAN SEGERA LAPOR KEPADA PEMBIMBING PRAKTIKUM

16. ALAT-ALAT DAN BAHAN YANG SUDAH DIPAKAI KEMBALIKAN KE TEMPAT SEMULA 17. TABUNG REAKSI/ CAWAN PETRI ATAU ERLENMEYER YANG TERDAPAT BIAKAN

MIKROORGANISME YANG SUDAH TIDAK DIPAKAI UNTUK PRAKTIKUM HARUS DISTERILKAN DAHULU DENGAN AUTOKLAF, KEMUDIAN DICUCI BERSIH

18. MEJA LAB HARUS DALAM KEADAAN BERSIH SETELAH PRAKTIKUM 19. DILARANG MEMBUANG BENDA PADAT DAN CAIR DI WASTAFEL

(5)

MIKROBIOLOGI DASAR TEKNOLOGI PANGAN TRILOGI 1

Melihat Bentuk dan Ukuran Mikroba dengan Mikroskop

A. Pendahuluan

Latar Belakang

Mikroorganisme yang tersebar di seluruh alam ini memiliki berbagai macam jenis, hal ini tidak dapat kita lihat langsung dengan kasat mata. Hal ini dapat dilihat dengan bantuan mikroskop walaupun dengan uji-uji yang lain tentu juga akan sangat membantu.

Pengenalan terhadap mikroskop perlu dilakukan untuk mengetahui bagaimana kerja dari mikroskop ini maka kita akan melihat bagian-bagian dalam mikroskop. Mikroskop cahaya merupakan mikroskop yang banyak digunakan dalam praktikum sederhana. Mikroskop ini mempunyai kaki yang berat dan kokoh dengan tujuan agar dapat berdiri dengan stabil. Mikroskop cahaya memiliki tiga lensa yaitu lensa objektif, okuler dan kondensor. Lensa okuler adalah lensa yang dekat dengan mata,berbentuk lensa tunggal (monokuler) atau ganda (binokuler). Pada ujung bawah mikroskop terdapat tempat dudukan lensa objektif yang bisa dipasangi tiga lensa atau lebih. Sistem lensa yang ketiga adalah kondensor yang berperan untuk menerangi obyek dan lensa-lensa mikroskop yang lain. Pada mikroskop konvensional, sumber cahaya masih berasal dari sinar matahari yang dipantulkan dengan suatu cermin datar atau cekung yang terdapat dibawah kondensor, sedangkan pada mikroskop modern sudah dilengkapi lampu sebagai pengganti sumber cahaya matahari.

Klasifikasi mikroorganisme dapat kita lihat dengan bantuan mikroskop. Dengan mikroskop kita dapat mengetahui apakah yang kita teliti berupa bakteri, kapang atau khamir. Bakteri, kapang serta khamir memiliki ciri-ciri tertentu yang dengan mudah dapat kita lihat dari morfologi dan bentuk mikroorganisme tersebut. Bakteri bisa berbentuk batang, bulat, spiral, koma baik secara berpasang-pasangan atau tunggal. Untuk kapang umumnya berupa jamur multiseluler maka akan terlihat apakah berbentuk askus atau basidium dan begitu pula khamir yang berupa jenis jamur uniseluler. Khamir umumnya digunakan untuk bentuk-bentuk yang menyerupai jamur dari kelompok Ascomycetes yang tidak berfilamen tetapi uniseluler berbentuk ovoid atau spheroid. Hal ini dapat menjadikan dasar dari pengklasifikasian suatu mikroorganisme.

(6)

Tujuan Instruksional

1. Mahasiswa mampu untuk mengetahui kerja dari mikroskop dan bagian-bagiannya 2. Mahasiswa mampu untuk membandingkan bakteri, kapang dan khamir

(7)

B. Bahan dan Alat Bahan :

1. Preparat jadi dari bakteri misalnya E.coli, kapang Tempe dan khamir Roti 2. Oil immersion

Alat : Mikroskop

C. Prosedur kerja :

Cara kerja praktikum ini mengikuti langkah-langkah sebagai berikut :

1. Amati mikroskop dan menuliskan komponen-komponen yang ada pada mikroskop

2. Amati preparat yang sudah disediakan dengan perbesaran yang sesuai dengan cara melakukan fiksasi sederhana dan diberi minyak imersi

3. Bandingkan bentuk, ukuran dan susunan dari mikroorganisme yang anda lihat

4. Catat dan gambar apa yang anda lihat

D. Hasil Pengamatan Gambar Bakteri

Gambar Kapang

(8)

E. Daftar Pustaka

Lay. W. B., 1990. Analisis Mikroba di Laboratorium.

Madigan, Martinko, Stahl dan Clark. 2012. Biology of Microorganisms. Pearson Inc. Publishing

(9)

Pengecatan Tunggal

A. Pendahuluan

Latar Belakang

Bakteri bersifat transparan, berukuran kecil sehingga tidak dapat dilihat dengan mata telanjang. Untuk mengetahui struktur, morfologi dan sifat kimia bakteri sehingga kita perlu melakukan suatu pengecatan terhadap bakteri tersebut.

Pengecatan bakteri tergantung dari sifat fisik dan kimiawi zat warna tersebut. Persenyawaan zat warna harus memiliki komponen-komponen warna dalam tiap molekulnya.

Pada pokoknya zat warna untuk melihat bakteri adalah bahan kimia dari golongan anilin dan secara garis besar zat warna dibagi atas dua golongan, yaitu zat warna asam dan zat warna basa. Istilah asam dan basa tidaklah menunjukkan reaksi kimianya, melainkan untuk menunjukkan apakah zat warna tersebut bersatu dengan anion atau kation. Sebagai contoh dalam reaksi zat warna methylene blue chlorida, yang bertindak sebagai zat warnanya adalah kation methylene blue+.

Methylene blue chlorida ==== methylene blue+ +chlorida Jadi dalam hal ini zat warna tersebut termasuk zat warna basa.

Pengecatan memiliki bermacam-macam jenis, ada pengecatan tunggal atau sederhana dan pengecatan majemuk. Pengecatan tunggal atau sederhana biasanya pengecatan yang menggunakan satu macam zat warna saja, misalnya carbol fuchsin, crystal violet atau methylene blue. Sedangkan pengecatan majemuk ialah pengecatan yang menggunakan lebih dari satu macam zat warna

Tujuan Intruksional

1. Mengerti teknik membuat preparasi dan dan pewarnaan dengan satu macam zat warna

2. Mengetahui morfologi (bentuk susunan) bakteri dengan menggunakan suatu macam zat warna

(10)

B. Alat dan Bahan Bahan :

1. Biakan bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus 2. Zat warna crystal violet, methylene blue, safranin

3. Minyak imersi Alat :

Gelas objek - ose

Gelas penutup -lampu spiritus Mikroskop

C. Prosedur kerja : Pembuatan film

Untuk mendapatkan hasil pengamatan yang baik, pembuatan film memegang peranan penting. Bakteri yang terlalu bertumpuk atau terlalu tipis di atas gelas objek akan menghasilkan gambaran yang kurang jelas setelah pengecatan

Cara membuat film

1. Bersihkan gelas objek dengan kapas yang sudah diberi alkohol 95% untuk menghilangkan lemak dan mikroorganisme yang menempel, lalu keringkan di udara 2. Buat lingkaran kecil di bagian bawah gelas objek untuk membatasi film

3. Ambil satu ose suspensi bakteri secara aseptik (ose dibakar di atas lampu spiritus sampai memijar, kemudian didinginkan sebentar), lalu tempelkan pada bagian dalam dari tabung biakan sebelum mengambil suspensi bakteri. Buat film setipis mungkin di atas gelas objek di dalam batas lingkaran tadi

4. Lakukan fiksasi dengan cara melakukan film di atas api secara cepat 2 sampai 3 kali. Maksudnya untuk membunuh bakteri secara cepat sehingga tidak mengalami perubahan bentuk. Disamping itu fiksasi dapat melekatkan bakteri pada gelas objek. Langkah-langkah pembuatan film di atas senantiasa dilakukan sebelum kita melakukan pengecatan

2. Pengecatan

1. Tambahkan salah satu zat warna di atas film tadi dengan waktu yang sesuai, yaitu untuk carbol fuchsin 15-20 detik, untuk gentian violet 30-45 detik dan methylene blue 3-5 menit

(11)

2. Buang zat warna tersebut lalu cuci dengan air untuk menghilangkan zat warna yang tidak terpakai

3. Keringkan dengan kertas saring

4. Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat (lensa objektif 100x). Untuk perbesaran kuat (lensa objektif 100x). Untuk perbesaran kuat ini harus selalu dipakai immersion oil yang berguna untuk mengumpulkan cahaya

5. Catat dan gambar apa yang anda lihat

D. Hasil Pengamatan

Jenis Bakteri Deskripsi Mikroba Gambar Mikroba

E. coli

Bacillus subtilis

Pertanyaan :

1. Bagaimana morfologi dari kedua bakteri tersebut? Bisa anda deskripsikan!

2. Apakah ada perbedaan dari kedua bakteri tersebut ketika dilihat di bawah mikroskop? Jelaskan!

Pelczar, M.E dan Chan, E.C.S. Dasar-dasar Mikrobiologi. 2006. UI Press

Willey, J.M., Sherwood L.M., Woolverton, C.J., 2008. Microbiology. Prescott, Harley & Klein

(12)

Pengecatan Majemuk

A. Pendahuluan Latar Belakang

Christian Gram seorang bakteriologi pada tahun 1844 menemukan penggolongan bakteri Gram positif dan Gram negatif. Pewarnaan Gram merupakan contoh pewarnaan diferensial yang memilahkan bakteri menjadi kelompok Gram positif dan Gram negatif. Teknik pewarnaan Gram ini dikembangkan oleh Christian Gram untuk mencari suatu metode untuk memperlihatkan bakteri pneumokokus pada jaringan paru-paru pasien yang mati karena pneumonia. Selain itu dia melihat bahwa beberapa spesies bakteri dapat dibedakan dengan prosedur pewarnaan ini.

Bakteri yang diwarnai dengan metoda Gram ini dibagi menjadi dua kelompok. Salah satu di antaranya, bakteri Gram positif, yang mempertahankan zat pewarna ungu kristal dan karenanya tampak ungu tua. Kelompok yang lain, bakteri Gram negatif, kehilangan ungu kristal ketika dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi pewarna tandingan dengan warna merah safranin, tampak berwarna merah. Bakteri Gram positif banyak ditemukan Mg, sedangkan pada bakteri Gram negatif tidak.

Pewarnaan Gram masih merupakan salah satu prosedur yang paling banyak digunakan untuk mencirikan banyak bakteri, terutama sangat diperlukan di laboratorium diagnostik rumah sakit karena informasi yang diperoleh dari pengamatan spesimen yang diwarnai dengan pewarnaan Gram dengan cepat dapat memberi petunjuk akan organisme penyebab suatu infeksi.

Bakteri Gram positif dan Gram negatif berbeda dari struktur dan komposisi dinding sel, kerentanan terhadap antibiotik pun berbeda-beda serta persyaratan nutrisinya pun antara Gram positif dan negatif juga berbeda.

Banyak pewarnaan differensial lain digunakan secara luas dalam bakteriologi, contohnya pewarnaan Ziehl-Nielsen, yaitu pewarnaan tahan asam.

Tujuan Intruksional

1. Mahasiswa mampu mengetahui pewarnaan Gram

(13)

B. Alat dan Bahan

Bahan : Alat :

Biakan murni Bacillus subtilis dan Esherichia coli Gelas objek Zat kimia/warna carbol gentian violet, Ose

Fuchsin/safranin, Lampu spiritus

Larutan lugol alkohol 95%

C. Prosedur Kerja

1. Buat film (seperti pada praktikum pengecatan tunggal)

2. Tambahkan pewarna crystal violet selama 3 menit, buang pewarna 3. Tambahkan larutan lugol 1 menit

4. Cuci dengan alkohol sampai tidak ada zat warna yang larut 5. Cuci dengan air dan tambahkan fuchsin/safranin 1-2 menit

6. Cuci dengan air lagi dan keringkan dengan kertas saring (dilap pelan dan lembut saja) 7. Beri minyak imersi 1-2 tetes untuk perbesaran kuat (1000x)

8. Amati dengan mikroskop. Gram positif akan berwarna ungu (violet ) dan Gram negatif akan berwarna merah

9. Tuliskan reaksi pengikatan antara zat warna dan bakteri (baik bakteri Gram positif dan Gram negatif)

(14)

Bakteri Perbesaran Gambar dan Warna

E.coli B.subtilis

(15)

Pengecatan Spora Bakteri Menurut Metoda Klein dan Metode Wirtz

A. Pendahuluan

Beberapa bakteri memiliki spora dimana spora tersebut dapat berada di tengah (central), berada di pinggir (terminal) atau tepi sel. Pelczar (1986), menyatakan bahwa spora merupakan tubuh bakteri yang secara metabolik mengalami dormansi, dihasilkan pada fase lanjut dalam pertumbuhan sel bakteri yang sama seperti asalnya, yaitu sel vegetatif. Spora bersifat tahan terhadap tekanan fisik maupun kimiawi.

Struktur spora yang terbentuk di dalam tubuh vegetatif bakteri disebut sebagai ‘endospora’ (endo=dalam, spora=spora) yaitu spora yang terbentuk di dalam tubuh. Secara sederhana, dapat dikatakan bahwa endospora merupakan sel yang mengalami dehidrasi dengan dinding yang mengalami penebalan serta memiliki beberapa lapisan tambahan.

Pengamatan spora bakteri diperlukan pewarnaan tertentu yang dapat menembus dinding tebal spora. Contoh dari pewarnaan yang dimaksudkan tersebut adalah dengan penggunaan larutan hijau malakit 5% carbol fuchsin dan untuk memperjelas pengamatan. Sel vegetatif juga diwarnai dengan larutan safranin 0,5% sehingga sel vegetatif ini berwarna merah. Dengan demikian ada atau tidaknya spora dapat teramati, bahkan posisi spora di dalam tubuh sel vegetatif juga dapat diidentifikasi.

Tujuan Intruksional

1. Mahasiswa mampu melakukan pengecatan pada bakteri yang berspora 2. Mahasiswa mampu melihat posisi spora yang berada di dalam sel

(16)

Bahan : Alat :

Biakan murni Bacillus subtilis atau spesies Bacillus lainnya Gelas objek Zat kimia/warna carbol gentian violet, Ose

Malachite green, Lampu spiritus

Methylene blue Tabung reaksi

Safranin Penangas air

Asam Sulfat Termometer

alkohol 95%

C. Prosedur Kerja I. Metode Klein I

1. Campuran suspensi bakteri dengan carbol fuchsin dalam tabung reaksi dengan perbandingan 1:1, panaskan dalam penangas air selama 10 menit pada suhu 60oC 2. Buat film dari campuran suspensi tadi

3. Celupkan ke dalam asam sulfat selama 1-2 detik 4. Cuci dengan air, tambahkan metilen biru 3 menit 5. Cuci dengan air, keringkan dengan kertas saring

6. Amati dengan perbesaran kuat. Spora berwarna merah sedangkan bentuk vegetative berwarna biru

II. Metode Klein II

1. Buat film dari suspensi bakteri

(17)

3. Langkah-langkah selanjutanya sama dengan metode Klein I dari langkah 3-6 4. Amati dengan perbesaran kuat, spora merah, vegetative biru

III. Metode Wirtz

1. Buat film dengan cara difiksasi dahulu

2. Tambahkan malachite hijau, panaskan sampai menguap 2 menit 3. Cuci dengan air, tambahkan safranin selama 39 detik

4. Cuci dengan air, keringkan dengan kertas saring dan

5. Amati dengan perbesaran kuat. Spora berwarna hijau dan badan bakteri berwarna merah muda

Bakteri Perbesaran Gambar dan Warna

Bacillus subtilis Bacillus spp

Cappucino, J.G. dan Sherman N., 2005. Microbiology, A Laboratory Manual. Pearson Inc. Publishing.

Madigan, Martinko, Stahl dan Clark. 2012. Biology of Microorganisms. Pearson Inc. Publishing.

Pelczar, M.E dan Chan, E.C.S. Dasar-dasar Mikrobiologi. 2006. UI Press.

Willey, J.M., Sherwood L.M., Woolverton, C.J., 2008. Microbiology. Prescott, Harley & Klein.

(18)

Pembuatan Media Sederhana

Mikroorganisme memerlukan media untuk pertumbuhannya. Media agar, media cair dan media semisolid merupakan media yang sering digunakan untuk pertumbuhan mikroorganisme. Penggunaan media harus sesuai dengan kebutuhan. Mikroorganisme harus dibiakkan di laboratorium pada bahan dengan nutrien yang berperan penting untuk pertumbuhan dan perkembangbiakannya. Susunan bahan nutrien, baik bahan alami maupun sintetik/buatan, yang dipergunakan untuk pertumbuhan dan perkembangan bakteri harus sesuai dengan kebutuhan mikroorganisme.

Penggunaan medium pertumbuhan, aktivitas mikroba dapat dipelajari dan dengan menggunakan medium pertumbuhan dapat dilakukan isolasi mikroba menjadi biakan murni. Pada dasarnya bahan-bahan untuk pertumbuhan medium dapat dikelompokkan menjadi 3 kelompok yaitu bahan dasar yang meliputi air, agar bersifat tidak diuraikan oleh mikroba, gelatin yang merupakan protein yang dapat diuraikan oleh mikroba, dan silika gel yaitu bahan yang mengandung natrium silikat khusus untuk menumbuhkan mikroba yang bersifat obligat ototrof, unsur-unsur nutrient yang dapat diambil dari bahan alam, meliputi karbohidrat, lemak dan asam-asam organic, sumber nitrogen yang mencakup pepton dan protein, garam-garam kimia ( K, Na, Fe dan Mg), vitamin dan dari buah, ekstrak sayuran dan susu.

Media-media sederhana dan alami bisa digunakan untuk pertumbuhan mikroba, begitu pula dengan media-media sintetik dan buatan yang biasanya memiliki kandungan bahan tertentu. Media-media tersebut ada yang sebagai media umum, media pengkayaaan atau media khusus (diferensiasi).

Tujuan Intruksional

1. Mahasiswa mengerti bagaimana pembuatan media sederhana

(19)

Bahan : Alat :

Ekstrak toge Panci

Ekstrak kentang Kompor

Ekstrak daging Autoklaf Aquadest

Agar-agar swallow

C. Prosedur kerja : Pembuatan Agar toge 1. Ekstrak toge :

Ekstrak toge dibuat dengan bahan dan cara sebagai berikut : Bahan :

Toge 500 gram Aquadest 1 liter Cara :

-Toge digodog dengan aquadest selama satu jam

-Saring dan tambahkan lagi aquadest sampai volume tepat satu liter -Atur pH sampai 7.4-7.5

-Sterilkan dalam autoklaf Agar toge :

Esktrak toge 1 liter dan agar 15 gram digodog sampai agarnya larut, disaring waktu masih panas dan sterilkan dalam autoklaf

2. Ekstrak kentang

(20)

Bahan :

Kentang 500 gram Aquadest 1 L Cara :

-Kentang yang sudah dikupas dipotong kecil-kecil -Godog dengan aquadest selama satu jam

-Saring dan tambahkan lagi akuadest sampai volume tepat satu liter -Atur pH sampai 7.4-7.6

Agar kentang :

Ekstrak kentang 1 liter dan 15 gram agar digodog sampai semua agar larut, saring dan sterilkan dalam autoklaf

3. Ekstrak daging (bulyon) Bahan :

Daging sapi segar 500 g Akuadest 1 liter

Pepton 5 gram NaCl 5 gram Cara :

-Daging segar dibersihkan dari lemak kemudian dicincang halus, digodog dengan akuadest selama 30 menit

-Saring dengan kain kasar, lalu saring lagi dengan kertas saring -Tambahkan lagi akuadest sampai volume tepat satu liter -Tambahkan pepton dan NaCl

-Atur pH sampai 7,4-7-6 -Sterilkan dalam autoklaf Bulyon agar :

(21)

Ekstrak daging 1 liter dan agar 15 gram digodog sampai larut semua, saring dan sterilkan dalam autoklaf

Bulyon agar semi solid :

Ekstrak daging 1 liter dan agar 4 gram digodog sampai larut semua, disaring dan disterilkan dalam autoklaf

Karakteristik /Penampakan Warna Kelarutan Agar toge

Agar kentang Agar bulyon

-Simpan agar yang telah steril tersebut pada inkubator dan siap digunakan dalam praktikum selanjutnya

(22)

Teknik Pembiakan Murni

A. Pendahuluan

Latar Belakang

Pada praktikum mikrobiologi kali ini maka kita akan mempraktikkan teknik biakan murni. Teknik biakan murni digunakan untuk memperoleh kultur bakteri murni tetapi juga digunakan untuk memelihara serta mencegah pencemaran dari luar. Media untuk membiakkan bakteri haruslah steril sebelum digunakan. Pencemaran dari luar terutama berasal dari udara yang mengandung mikroorganisme. Secara alami, bakteri di alam ditemukan dalam populasi campuran. Hanya dalam keadaan tertentu saja populasi ini ditemukan dalam keadaan murni. Untuk dapat mempelajari sifat biakan, morfologi dan sifat faalinya maka mikroorganisme yang akan diteliti harus dapat dipisahkan. Ini berarti bahwa harus diperoleh biakan murni yang hanya mengandung satu macam bakteri.

Untuk memperoleh biakan murni dapat dilakukan pengenceran dengan menggunakan bahan cair atau padat. Pada mula-mula digunakan gelatin sebagai bahan pemadat. Gelatin terdiri dari protein sehingga dapat dicerna ataupun dicairkan oleh bakteri. Bahan pemadat yang kemudian ditemukan ialah agar yang merupakan polisakarida dari rumput laut. Agar akan mencair pada suhu 100oC, sedangkan pada suhu 44oC masih dalam bentuk cair. Suhu ini masih memungkinkan bakteri dapat tumbuh, sehingga prinsip ini dipakai untuk mengisolasi bakteri dengan cara agar tuang. Pada umumnya bakteri tidak dapat mencerna atau mencairkan agar.

Dalam praktikum ini ada beberapa cara untuk mendapatkan biakan murni, yaitu : 1. Teknik penggoresan agar (dengan agar tuang atau agar sebar)

2. Teknik agar tabung (agar semi solid, agar cair (broth) dan agar miring (slant agar)

3. Teknik goresan kuadran

Tujuan Intruksional

1. Praktikan mampu melakukan goresan agar 2. Praktikan mampu melakukan metode agar tuang 3. Praktikan mampu melakukan metode agar sebar

(23)

Alat : Bahan :

Lampu spiritus Media agar

Ose larutan broth (cair)

cawan petri agar semi solid

Biakan kultur agar padat (agar miring/slant agar) Alkohol

Pipet dan tips steril

C. Prosedur

C.1. Teknik Goresan Agar

1. Pijarkan ose pada lampu spiritus, dinginkan sebentar, kemudian ambil seulas ose dari biakan kultur

2. Sentuhkan ose pada lempengan agar , sewaktu menggores ose dibiarkan meluncur di atas permukaan lempengan. Agar yang luka menganggu pertumbuhan mikroorganisme sehingga sulit diperoleh koloni terpisah

3. Pijarkan ose setelah menggores satu daerah, pemijaran ose mematikan mikroorganisme yang melekat pada mata ose dan mencegah pencemaran pada penggoresan daerah berikutnya

4. Gunakan tutup cawan petri untuk melindungi permukaan agar dari pencemaran 5. Balikkan lempengan agar untuk mencegah air kondensasi jatuh ke atas permukaan agar sehingga dapat terjadi penyebaran koloni

Beberapa teknik goresan terlihat sebagai berikut ini a. Goresan T

1. Lempengan dibagi menjadi tiga bagian dengan membentuk huruf T pada bagian luar dasar cawan (Gambar 6.2)

2. Inokulasi daerah I sebanyak mungkin dengan gerakan sinambung 3. Panaskan ose dan biarkan dingin kembali

(24)

5. Pijarkan ose dan biarkan dingin kembali

6. Ulangi prosedur 3-5 untuk menggores daerah III 7. Pijarkan ose

b. Goresan Kuadran

Teknik ini sama saja dengan goresan T, hanya lempengan agar dibagi 4

Setiap selesai menggores dipijarkan lagi, kemudian ditunggu dingin baru digores kembali

C.2. Teknik Agar Tuang

1. Pada agar tuang dilakukan pengenceran 1 mL suspensi bakteri ke dalam tiga tabung pengencer untuk dituang dengan metode agar tuang, sehingga akan diperoleh lempengan dengan jumlah bakteri yang optimum untuk isolasi

2. Beri tanda kepada tabung pengencer I, II dan III dan cawan petri I, II dan III

3. Agar yang steril harus dalam keadaan tetap cair, oleh karena itu simpanlah pada suhu 50oC di inkubator

4. Beri tanda pada cawan petri I, II dan III

5. Inokulasi tabung I dengan 1 mL suspensi biakan

6. Jangan lupa memanaskan mulut tabung sewaktu membuka dan juga sewaktu akan ditutup. Goyangkan tabung dengan teknik seperti pada penggoresan dengan menggunakan vortex atau putarlah tabung di antara kedua telapak tangan. Hati-hati agar tidak boleh menyentuh tutup kapas

7. Inokulasi tabung pengencer II dengan 1 mL suspensi bakteri pada larutan pengencer I yang telah tercampur dengan baik

9. Kembalikan tabung agar tuang I ke rak tabung

10.Goyang atau putarlah tabung II di antara kedua telapak tangan sehingga tercampur dengan baik

11.Inokulasi tabung pengencer III dengan 1 mL suspensi tabung pengencer II

12. Goyang atau putar tabung III sehingga tercampur dengan baik, kemudian buka tutup tabung dan panaskan mulut tabung; pindahkan dengan mikropipet sebanyak 1 mL ke dalam cawan petri III

13.Cara yang sama dipergunakan untuk menuang tabung I ke cawan petri I dan tabung II ke cawan petri II

14.Setelah agar membeku, baliklah cawan petri dan masukkan ke dalam lemari inkubasi pada suhu 37oC selama 24 – 48 jam

(25)

C.3. Teknik Agar Sebar

1. Pengenceran sampel dilakukan seperti pada gambar. Pipet 0,1 mL cairan dari botol pengencer dan biarkan cairan mengalir ke atas permukaan agar

2. Cairan contoh disebarkan dengan penyebar yang terbuat dari gelas (hockey stick/spreader). Pada teknik ini sterilisasi penyebar dilakukan dengan mencelupkan ke dalam alkohol dan kemudian dipanaskan sehingga alkohol terbakar habis.

3. Penyebar didinginkan dahulu sebelum digunakan untuk menyebarkan cairan contoh pada permukaan agar. Penyebaran cairan contoh dilakukan dengan memutar agar lempengan

C.4. Menanam bakteri pada berbagai tabung berisi agar 4.1. Tabung agar tegak semi solid

1. Sediakan media agar semi solid kurang lebih 5 ml dalam tabung reaksi, kemudian sterilkan

2. Setelah dingin, tusukkan satu ose jarum suspensi bakteri pada bagian tengah media secara aseptik

3. Inkubasikan paling sedikit 24 jam,37oC

4. Lihat penyebaran pertumbuhan bakteri tersebut. Bila pertumbuhannya banyak terlihat pada permukaan media, bakteri tersebut disebut mempunyai gerak positif, dan bila pertumbuhannya hanya terdapat di sekitar bekas tusukan, maka bakteri tersebut disebut mempunyai gerak negatif

4.2. Menanam bakteri pada agar miring

1. Sediakan kurang lebih 5 ml media agar bulyon pada tabung reaksi, lalu sterilkan. Pada waktu media masih panas, tabung diletakkan miring (sudut kurang lebih 15oC) sampai media membeku

2. Ambil satu ose bakteri secara aseptik, buatlah goresan sebanyak mungkin pada permukaan media (garis zigzag). Jagalah supaya tidak tercongkel

3. Inkubasikan 24 jam,37oC

4. Lihat apakah ada pertumbuhan atau tidak 4.3. Menanam Bakteri pada media cair (broth)

1. Sediakan media cair yang sudah disterilkan pada tabung reaksi 2. Tambahkan satu ose bakteri pada media tersebut

(26)

3. Inkubasikan 24 jam, 37oC

4. Lihat apakah ada pertumbuhan atau tidak. Apabila terdapat pertumbuhan, cairan akan kelihatan keruh

I. Pembiakan bakteri pada cawan petri

Goresan T Goresan kuadran Agar Tuang Agar Sebar

II. Pembiakan bakteri pada tabung agar Keterangan/

Karaktetistik

Tabung agar semi solid

Tabung broth Tabung agar miring

Pertanyaan

1. Apakah yang membedakan teknik agar tuang dan agar sebar selain caranya yang berbeda?

2. Untuk goresan kuadran, sering digunakan untuk apa sajakah?

Lay. W. B., 1990. Analisis Mikroba di Laboratorium. IPB.

Pelczar, M.E dan Chan, E.C.S. 2006. Dasar-dasar Mikrobiologi.. UI Press Srikandi Fardiaz. 1989. Mikrobiologi Pangan. IPB.

(27)

MIKROBIOLOGI DASAR TEKNOLOGI PANGAN UNIVERSITAS TRILOGI 23

Penghitungan Koloni Bakteri

A. Pendahuluan

Latar Belakang

Kuantifikasi populasi mikroorganisme sering dilakukan untuk mendapatkan jumlah kuantitatif mikroorganisme target. Kuantifikasi tersebut dapat berupa penentuan jumlah sel dan penentuan massa sel. Penentuan jumlah sel dapat dilakukan pada mikrorganisme bersel tunggal. Penentuan massa sel dilakukan bagi mikroorganisme bersel tunggal dan mikroorganisme berfilamen.

Penghitungan jumlah sel dapat dilakukan dengan beberapa cara diantaranya metode hitungan cawan (Total Plate Count), hitungan mikroskopis langsung (Direct count) dan penghitung (counter). Cara lain penentuan jumlah sel adalah dengan menyaring sampel dengan saringan membran kemudian saringan tersebut diinkubasi pada permukaan media yang sesuai. Koloni-koloni yang terbentuk berasal dari satu sel tunggal yang dapat hidup.

Metode hitungan cawan menggunakan anggapan bahwa setiap sel akan hidup berkembang menjadi satu koloni. Jumlah koloni yang muncul menjadi indeks bagi jumlah organisme yang terkandung di dalam sampel. Teknik penghitungan ini membutuhkan kemampuan melakukan pengenceran dan mencawankan hasil pengenceran. Cawan-cawan tersebut kemudian diinkubasi dan dihitung jumlah koloni yang terbentuk. Cawan yang dipilih untuk penghitungan koloni, sesuai dengan kaidah statistik adalah cawan yang berisi 30-300 koloni. Jumlah organisme yang terdapat dalam sampel asal dihitung dengan cara mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor pengenceran pada cawan bersangkutan.

Cara perhitungan kuantitas/densitas sel bakteri pada kultur cair yang paling umum adalah dengan menggunakan nilai kekeruhan suspensi sel yang didapatkan dengan pengukuran menggunakan spektrofotometer. Sel bakteri dihitung dengan panjang gelombang 600nm dan nilai absorbansi yang muncul kemudian dikonversi untuk mendapatkan nilai densitas sel bakteri dalam kultur.

Tujuan Intruksional

1. Mahasiswa mampu menghitung bakteri dari metode tuang maupun sebar 2. Mahasiswa mampu menghitung bakteri dengan cara langsung

(28)

Bahan Alat :

Cawan Petri Nutrient Agar

Colony counter Larutan pengencer buffered pepton water Bunsen Biakan bakteri dalam nutrient broth Spreader

C. Prosedur Kerja A. Larutan pengencer

1. Buat larutan pengencer fisiologis, larutan ini dibutuhkan agar bakteri yang dipindahkan dari nutrient broth tidak shock mengalami perubahan media

2. Timbang 2 gram Buffered Peptone Water dan larutkan dalam 100 ml akuadest 3. Pipet sebanyak 9 ml dan masukan dalam tabung reaksi

B. Metode tuang

1. Dari biakan bakteri di Nutrient Broth,ambil 1 ml masukkan ke dalam larutan pengencer, goyang-goyang sebanyak 8 kali-10 kali

2. Kemudian lakukan hal yang sama sampai tabung yang ke-4

3. Ambil 1 ml larutan pengencer tadi, masukkan ke dalam cawan petri dan tuangkan agar ke atasnya. Ingat agar tidak boleh panas.

4. Inkubasikan pada suhu 37oC selama 24-48 jam,kemudian setelah itu dihitung berdasarkan jumlah koloni yang hidup dengan hand counter

C. Metode Sebar

1. Dilakukan hal yang sama dengan metode tuang, hanya saja pada metode sebar maka disiapkan terlebih dahulu agar yang sudah dingin di dalam cawan petri

2. Kemudian secara aseptis diambil 0,1 mL bakteri pada masing-masing larutan pengencer kemudian dengan menggunakan spreader diratakan.

3. Inkubasi pada suhu 37oC selama 24-48 jam, kemudian setelah itu dihitung berdasarkan jumlah koloni yang hidup dengan hand counter

Perlakuan dilakukan duplo, dan dirata-ratakan dengan jumlah bakteri harus berkisar 25-250 dikalikan faktor pengenceran

(29)

Nama Bakteri Jumlah koloni pada metode agar tuang

Jumlah koloni pada metode agar sebar

Rerataan

(30)

Pengaruh Oksigen pada Pertumbuhan Mikroorganisme

A. Latar Belakang

Pendahuluan

Laju pertumbuhan dan aktivitas bakteri dipengaruhi oleh berbagai faktor, antara lain: pH, suhu, kebutuhan akan oksigen, nutrisi, tekanan osmosis, pengeringan dan lain sebagainya. Pertumbuhan mikroorganisme berbeda pada kebutuhan akan oksigen (O2)

sehingga dapat dibedakan sebagai berikut :

1. Aerob: keperluan akan oksigen. Mikroorganisme membutuhkan oksigen untuk pertumbuhan dan sistem enzimnya dan menggunakan O2 sebagai penerima hydrogen

terakhir pada perubhana oksidasi lengkap pada molekul tingkat tinggi contohnya berupa glukosa.

2. Obligat anaerob: mikroorganisme yang tidak memerlukan oksigen, tidak membutuhkan oksigen dalam pertumbuhannya. Sistem enzim oksidatif memerlukan kehadiran molekul lain dan bukan oksigen. Pada mikroorganisme ini sebagaimana aerob, kehadiran oksigen akan menyebabkan terbentuknya metabolit beracun.

3. Fakultatif anaerob: mikroorganisme ini dapat tumbuh karena kehadiran atau ketidakhadiran oksigen bebas. Biasanya mikroba lebih menyukai menggunakan oksigen untuk respirasi aerob. Bagaimanapun juga pada lingkungan yang miskin oksigen, respirasi seluler dapat terjadi secara anaerob, dengan menggunakan komponen seperti Nitrat (NO3-) atau sulfat (SO42-)

Kebutuhan akan oksigen dapat diekatahui dengan cara menghidupkan mikroba pada gaspak atau dengan menggunakan thioglikolat cair.

1. Mahasiswa mengerti bahwa pertumbuhan mikroorganisme dapat dipengaruhi oleh oksigen

(31)

B. Bahan dan Alat

Bahan : Alat :

Media PCA Ose

Media MRSA Lampu spiritus

Alkohol teknis 70% Cawan petri

Kultur bakteri : Anaerobic jar

E.coli, Anaerobic strip

Bacillus subtilis Pediococcus sp,

Lactococcus sp

1. Siapkan kultur bakteri yang akan kita gunakan

2. Ambil 1 ose kultur bakteri goreskan ke dalam media agar yang telah ada

3. Inkubasikan dalam incubator biasa dan inkubasikan dalam anaerobic jar yang telat dimasukan anaerobic kit nya (berupa anaerobic cult dan strip)

4. Inkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam

5. Lihat hasil dari masing-masing bakteri tersebut, catat hasilnya dan bahas

D. Tabel Pengamatan

Nama bakteri Inkubator biasa Anaerobic jar

Pertanyaan :

1. Apakah fungsi alat anaerobic jar dan anaerobic kit tersebut?

2. Apakah oksigen dapat mempengaruhi pertumbuhan bakteri? Bisa anda jelaskan kebutuhan akan oksigen terhadap pertumbuhan bakteri?

(32)

Cappucino dan Sherman. 2005. Microbiology, A Laboratory Manual. Pearson : New York.

(33)

Pengaruh Tekanan Osmotik pada Pertumbuhan Bakteri

(Pengaruh Penambahan Gula)

Pada pertumbuhan mikroorganisme memerlukan makroelemen dan mikroelemen, tetapi selain itu juga memerlukan faktor-faktor lain dalam pertumbuhannya seperti kebutuhan akan oksigen, kebutuhan akan larutan dan aktivitas air, pengaruh suhu dan pH selain hal-hal tersebut ternyata dapat dipengaruhi juga oleh garam dan gula (tekanan osmotik). Tekanan osmosis sangat erat hubungannya dengan kandungan air. Apabila mikroba diletakkan pada larutan hipertonis, maka selnya akan mengalami plasmolisis, yaitu terkelupasnya membran sitoplasma dari dinding sel akibat mengkerutnya sitoplasma.

Konsentrasi tinggi garam dan gula mampu mengawetkan makanan karena kemampuannya menyerap cairan internal mikroorganisme sehingga menyebabkannya mengerut dan akhirnya mati. Ketika larutan garam atau gula konsentrasi tinggi digunakan pada makanan, makanan akan terlindung dari invasi mikroba.

Menggunakan garam dan gula merupakan cara yang lebih maju untuk mengawetkan makanan daripada sekedar membiarkannya mengering. Secara teori, mengawetkan makanan dengan garam dan gula bisa membuat makanan bertahan hingga beberapa tahun. Mengawetkan dengan garam dan gula juga telah menjadi metode yang digunakan selama berabad-abad sebelum adanya lemari es yang baru ditemukan seabad lalu.

1. Mahasiswa mampu menumbuhkan mikroba pada media yang ditambahkan sukrosa (gula)

2. Mahasiswa mampu membedakan pertumbuhan mikroba dengan konsentrasi sukrosa yang berbeda pada media

(34)

Bahan: Alat:

Biakan bakteri murni Volume pipet

Larutan pengencer Lampu spiritus

Media NA dengan penambahan sukrosa 10%, 20%, 30% dan 40% Alkohol teknis

C. Prosedur kerja

1. Pipet biakan bakteri sebanyak 1 mL, pindahkan ke larutan pengencer tandai sebagai larutan pengencer 101

2. Pipet lagi sebanyak 1 mL dari tabung 101 dan pindahkan ke larutan pengencer lagi dan tandai sebagai larutan pengencer 102, lakukan sampai 106

3. Kemudian pipet 1 mL dari larutan-larutan pengencer tadi dan taruh di dalam cawan petri

4. Tambahkan NA yang sudah diberi sukrosa dengan konsentrasi berbeda-beda, lakukan secara duplo

5. Lakukan semua perkerjaan secara aseptis dan lakukan juga untuk kontrol (tanpa penambahan apapun)

5. Inkubasi pada 37oC selama 24-48 jam dan hitunglah koloninya D. Hasil Pengamatan

Konsentrasi Gula Biakan Bakteri 1 Biakan Bakteri 2 10%

20% 30% 40%

Pertanyaan :

1. Apakah gula dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroorganisme? Bagaimana mekanismenya?

2. Selain gula apakah ada senyawa lain yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba? Sebutkan!

3. Bisa anda sebutkan salah satu aplikasi penggunaan gula ini dalam proses pengolahan pangan? Atau produk-produk lainnya

(35)

Pelczar, M.E dan Chan, E.C.S. 2006. Dasar-dasar Mikrobiologi. UI Press

(36)

Pengaruh Tekanan Osmotik (Pengaruh Penambahan NaCl) I. Pendahuluan

Latar Belakang

Mikroba memiliki karakteristik dan ciri yang berbeda-beda di dalam persyaratan pertumbuhannya. Bakteri juga memiliki kebutuhan dasar yang sama meliputi air, karbon, energi, mineral, dan faktor tumbuh. Bakteri merupakan organisme yang bersifat prokariotik dengan inti tidak berselaput. Dalam lingkungannya, bakteri ini berperan sangat penting dalam menguraikan zat-zat organik.

Bakteri dalam aktivitasnya dipengaruhi oleh faktor-faktor lingkungan yang terbagi menjadi dua bagian, yaitu faktor yang meliputi kimia dan fisika serta faktor yang berhubungan dengan makhluk hidup lain. Faktor kimia mencakup pH, CO, amonia, dan lain-lain. Sedangkan faktor fisika mencakup suhu, salinitas, tekanan osmotik, pengeringan, dan lain-lain.

Bakteri mempunyai kisaran tertentu dalam suhu. Dalam pertumbuhannya, suhu bakteri terbagi 3 macam, yaitu minimum, optimum, dan maksimum. Bakteri akan tumbuh dengan baik pada suhu optimum.

Selain suhu, bakteri juga dipengaruhi oleh salinitas atau tekanan osmotik. Tekanan osmotik terbagi 3, yaitu hipotonis, isotonis, dan hipertonis. bakteri akan tumbuh dengan baik atau akan hidup pada keadaan isotonis, karena pada keadaan hipotonis ataupun hipertonis sel bakteri tidak akan mampu menahannya lalu kemudian pecah atau mati kehabisan cairan. Oleh karena itu perlu diketahui pengaruh salinitas dan suhu terhadap viabilitas bakteri.

1. Mahasiswa mampu menghidupkan bakteri pada media yang mengandung berbagai macam konsentrasi NaCl

2. Mahasiswa mampu mengetahui perbedaan pertumbuhan bakteri pada berbagai konsentrasi media tersebut

(37)

Bahan : Alat:

Nutrient agar 100 mL Ose

Larutan pengencer Lampu Spiritus

NaCl 1%, 5%. dan 10% Cawan petri

Inkubator

C. Prosedur

1. Ambil bakteri 1 mL dari biakan murni, kemudian pindahkan 1 mL ke dalam larutan pengencer 1 (tulis 101) kemudian ambil lagi 1 mL pindahkan ke tabung pengencer 2 (tulis 102) dan seterusnya sampai 105

2. Pipet 1 mL dari larutan pengencer 104 dan larutan 105, masukkan ke dalam cawan petri

3. Tuang media agar yang telah diberi NaCl 1%, 5% dan 10% 4. Goyang merata ke seluruh cawan petri

5. Inkubasikan pada suhu 37oC selama 24-48 jam, lakukan pula untuk kontrol (tanpa penambahan apapun)

6. Laporkan hasil pertumbuhan dengan menghitung koloni dari cawan petri tersebut

Jenis Bakteri NaCl 1% NaCl 5% NaCl 10% Biakan bakteri 1

Biakan bakteri 2 Biakan bakteri 3 Pertanyaan :

1. Media dengan penambahan NaCl konsentrasi berapakah yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba?

2. Selain NaCl apakah ada jenis garam lain yang dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme? Jelaskan dan sebutkan!

(38)

(39)

Pengaruh pH pada Pertumbuhan Bakteri

Faktor pertumbuhan mikroorganisme selain dipengaruhi oleh faktor internal maka faktor eksternal juga sangat mempengaruhi laju pertumbuhannya. Faktor eksternal yang mempengaruhi laju pertumbuhan dan aktivitas bakteri antara lain: pH, suhu, nutrisi, tekanan osmosis, pengeringan dan lain sebagainya. Suhu dan pH adalah faktor penting bagi pertumbuhan bakteri, karena masing-masing spesies bakteri mempunyai suhu dan pH optimum untuk pertumbuhannya.

Pada saat pertumbuhan mikororganisme sering kali terjadi perubahan pH media. Mikroorganisme yg melaksanakan proses fermentasi menghasilkan asam sehingga pH dapat turun menjadi 3.5. Sebaliknya, sewaktu metabolisme protein dan asam amino dilepaskan ion amonium sehingga pH media menjadi basa.

Perubahan pH terjadi dengan cepat dalam lingkungan tertutup seperti misalnya kaldu nutrien dalam tabung, sehingga menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Untuk mencegah perubahan pH seringkali ditambahkan larutan penyangga pada media. Pada umumnya bakteri tumbuh baik pada pH sekitar 7 meskipun masih dapat tumbuh pada kisaran 5,0 sampai dengan 8,0. Untuk melihat pengaruh pH, bakteri ditumbuhkan pada berbagai pH, baik dengan penambahan asam maupun penambahan basa.

1. Mahasiswa dapat melihat perubahan pH pada media sebagai salah satu penghambat pertumbuhan mikroorganisme

2. Mahasiswa dapat melihat pertumbuhan mikroorganisme pada pH asam 3. Mahasiswa dapat melihat pertumbuhan mikroorganisme pada pH basa

(40)

Bahan : Alat :

Media PCA dengan penambahan asam 10%,20%,30% (HCl) Pipet volume Media PCA dengan penambahan basa 10%,20%,30% (NaOH) Lampu spiritus

Alkohol teknis Cawan petri

Larutan pengencer Inkubator

1. Siapkan media yang telah ditambahkan larutan asam dengan konsentrasi 10%, 20% dan 30%

2. Siapkan kembali media yang telah ditambahkan larutan basa dengan konsentrasi 10%, 20% dan 30%

3. Pipet 1 mL biakan murni bakteri dan masukkan ke dalam larutan pengencer, tandai sebagai 101, goyang-goyang tabung dengan larutan pengencer tadi sebanyak 8-10 kali 4. Pipet secara aseptis dari larutan pengencer 101 sebanyak 1 mL dan masukkan ke dalam tabung larutan pengencer kembali dan tandai dengan 102, lakukan hal yang sama sampai 105

5. Kemudian ambil 1 mL dari masing-masing tabung dan secara aseptis masukkan ke dalam cawan petri

6. Tambahkan agar PCA yang diberi larutan asam, kemudian di cawan petri yg lain dimasukkan PCA yang diberi larutan basa

7. Goyang-goyang pelan dan biarkan sampai agar mengeras

8. Lakukan secara duplo, dan lakukan juga untuk kontrol (tanpa penambahan apapun) 9. Inkubasi pada suhu 37oC selama 24 sampai 48 jam

(41)

D. Tabel Pengamatan Bakteri

Konsentrasi penambahan larutan asam

Konsentrasi penambahan larutan basa

10% 20% 30% 10% 20% 30%

Pertanyaan :

1. Pada media dengan penambahan asam/basa, maka konsentrasi asam/basa berapa yang sudah dapat menghambat pertumbuhan mikroba?

2. Media asam/basa dengan konsentrasi berapa yang paling besar daya hambatnya terhadap pertumbuhan mikroba?

(42)

Pengaruh Suhu Pada Pertumbuhan Mikroorganisme

Mikroorganisme dapat dipilah berdasarkan pertumbuhannya pada suhu tertentu. Seperti makhluk hidup pada umumnya, pertumbuhan mikroba tentunya tidak lepas dari pengaruh lingkungan (eksternal) selain faktor internal dari mikroba tersebut. Faktor-faktor yang mempengaruhi itu dapat berupa faktor fisika, faktor kimia, maupun faktor biologi. Namun, pertumbuham mikroba ini tidak hanya dipengaruhi faktor lingkungan, tetapi juga mempengaruhi keadaan lingkungan. Karena ukurannya yang sangat mikroskopis, pertumbuhan mikroba sangat tergantung pada keadaan sekelilingnya (Pelczar dan Chan, 2006). Faktor suhu merupakan faktor lingkungan terpenting yang mempengaruhi pertumbuhan dan kehidupan mikroba karena enzim yang menjalankan metabolisme sangat peka terhadap suhu. Berdasarkan suhu minimum, optimum dan maksimum yang dimiliki mikrobia digolongkan ke dalam tiga kelompok yaitu mikrobia psikrofil, mikrobia mesofil, dan mikrobia termofil (Madigan et.al., 2012).

Setelah mengetahui suhu optimum bagi mikroba untuk hidup, kita dapat mengatur suhu yang tepat untuk mengembangbiakan mikroba untuk keperluan industri. Dalam pertumbuhan mikroorganisme bukan hanya suhu saja yang berpengaruh tetapi masih banyak faktor-faktor eksternal lainnya. Latar belakang praktikum kali ini adalah agar praktikan dapat mengetahui kemampuan mikroba hidup dari nutrisi serta bahan-bahan yang mempengaruhi keadaan fisiologi dan morfologi dari suatu mikroba

1. Mahasiswa mampu mengetahui pengaruh suhu lingkungan terhadap pertumbuhan bakteri

(43)

Bahan : Alat :

Larutan pengencer Ose

Biakan murni E.coli, S.aureus, S.typhimurium Lampu spiritus Media Plate Count Agar 100 mL Alkohol 70%

Cawan petri Inkubator

C. Prosedur

1. Pipet biakan murni bakteri sebanyak 1 mL pada larutan pengencer 1 tandai 101, kemudian pipet 1 mL pada larutan pengencer 2 tandai 102, lakukan hal yang sama sampai larutan pengencer ke 5 atau 105

2. Pipet 1 mL larutan 104ke dalam cawan petri, tuang agar PCA

3. Kemudian inkubasi pada suhu 10oC, 25oC, 37oC dan 70oC selama 24-48 jam 4. Amati hasilnya dan hitung koloni yang ada di cawan petri. Lakukan pula untuk kontrol.

Suhu Biakan bakteri 1 Biakan bakteri 2 Biakan bakteri 3 10oC

25oC 37oC 70oC

Pertanyaan :

1. Kisaran suhu berapa yang optimum untuk pertumbuhan mikroba?

2. Dan kisaran suhu berapa yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba?

Srikandi Fardiaz. 1989. Mikrobiologi Pangan. IPB.

(44)

Uji IMViC (Indole- Methyl Red- Voges Proskauer-Citrate) A. Pendahuluan

Latar Belakang

Uji IMViC adalah uji untuk membedakan antara Enterobactericeae dan

Escherichia coli yang terdiri dari uji-uji Indol Methyl Red Voges Proskauer Citrate.

Uji indol digunakan untuk mengetahui bakteri yang mampu menggunakan triptofan (komponen asam amino), sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat penguraian protein. Bakteri tertentu seperti misalnya Escherichia coli mampu menggunakan triptofan sebagai sumber karbon. Untuk mengetahui penumpukan indol dalam media biakan dapat diketahui dengan penambahan berbagai reagens contohnya Kovacs, Gore, Ehrlich dan Ehrlich-Bohme. Reagens bereaksi dengan indol dengan menghasilkan senyawa yang tidak larut dalam air dan berwarna merah pada permukaan medium.

Uji metil red digunakan untuk menentukan adanya fermentasi asam campuran. Dimana beberapa bakteri dapat memfermentasikan glukosa dan menghasilkan berbagai produk yang bersifat asam sehingga akan menurunkan pH media pertumbuhannya menjadi 5.0 atau lebih rendah. Penambahan indikator pH metil red dapat menunjukkan adanya perubahan pH menjadi asam. Metil red berwarna merah pada lingkungan dengan pH 4.4 dan berwarna kuning dalam lingkungan dengan pH 6.2.

Fermentasi asam campuran ditentukan dengan cara menumbuhkan mikroorganisme dalam kaldu yang mengandung glukosa, dan setelah masa inkubasi menambahkan reagens metil merah ke dalam kaldu. Bila terjadi fermentasi asam campuran maka kaldu biakan berubah menjadi kuning setelah penambahan reagens metil red. Bila tidak terjadi fermentasi asam campuran maka kaldu biakan berubah menjadi kuning setelah penambahan reagens metil red. Uji ini sangat berguna dalam identifikasi kelompok bakteri yang menempati saluran pencernaan.

Uji Voges Proskauer digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme yang melaksanakan fermentasi 2-3 butanadiol. Bila bakteri memfermentasikan karbohidrat menjadi 2-3 butanadiol sebagai produk utama, akan terjadi penumpukan bahan tersebut dalam media pertumbuhan. Penambahan 40% KOH dan 5% larutan alfanaftol dalam etanol dapat menentukan adanya asetoin (asetilmetilkarbinol), suatu senyawa awal dalam sintesis 2-3 butanadiol.

(45)

Pada penambahan KOH adanya asetoin ditunjukkan oleh perubahan warna kaldu menjadi merah muda. Perubahan warna ini diperjelas dengan penambahan larutan α-naftol. Perubahan warna kaldu biakan ini lebih jelas pada bagian yang berhubungan dengan udara, karena sebagian 2-3 butanadiol dioksidasikan kembali menjadi asetoin sehingga memperjelas reaksi. Berdasarkan hal ini tabung yang berisi kaldu dikocok sehingga berbuih, kemudian dibuka tutup tabungnya dan dimiringkan di atas meja. Uji Voges Proskauer sebenarnya merupakan uji tidak langsung untuk mengetahui adanya 2-3 butanadiol. Asetoin adalah senyawa pendahulu 2-3 butanadiol dan selalu didapatkan secara serentak, sehingga uji VP sah untuk menentukan adanya 2-3 butanadiol.

Uji sitrat dengan menggunakan simmons citrate agar, digunakan untuk mengetahui bakteri yang dapat menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon. Bila mikroorganisme mampu menggunakan sitrat, maka asam akan dihilangkan dari medium biakan, sehingga menyebabkan peningkatan pH dan mengubah warna medium dari hijau menjadi biru.

Tujuan Intruksional

1. Mahasiswa mampu mengetahui uji IMViC dan kegunaan uji tersebut

2. Mahasiswa mampu mengetahui dan mengidentifikasi jenis bakteri E.coli atau bukan jenis E.coli

(46)

Bahan Alat :

Media yang mengandung trypton (triptofan) misalnya TSA atau TSB Tabung reaksi Media broth MR-VP (Methyl Red – Voges Proskauer) Ose

Media simmons citrate agar Lampu Bunsen

Indikator Metil Merah Rak tabung

KOH 40% Inkubator

Alfanaftol 5% Reagens Kovacs Bakteri E.coli

Bakteri Enterococcus aerogenes

C. Prosedur Kerja A. Uji Indol

Cara Mengerjakan : Hari Pertama :

1. Tandai tabung dengan nama, tanggal, dan mikroorganisme yang digunakan

2. Inokulasi biakan semi padat dengan cara menusukkan jarum sampai pada kedalaman ¾ bagian dari permukaan media

3. Inkubasikan pada suhu 35-37oC selama 48 jam atau lebih (24x5) Hari Kedua

1. Tambahkan reagens Kovacs setetes-setetes ke dalam biakan semi padat (6 tetes). Penumpukan indol dalam media ditandai oleh warna merah pada permukaan media beberapa menit setelah penambahan reagens

2. Laporkan hasil pengujian, jika terdapat pembentukan indol akan terlihat warna merah/merah muda pada bagian atas media biakan

B. Uji Metil Red Hari Pertama

1. Tandai tabung kaldu MR-VP dengan biakan bakteri yang digunakan 2. Inokulasi kaldu MR-VP dengan biakan bakteri

(47)

Hari Kelima

1. Tambahkan 5 tetes reagens metil red ke dalam tabung MR VP

2. Laporkan hasil. Uji bersifat positif bila kaldu berwarna merah setelah penambahan reagens metil red. Uji bersifat negatif bila kaldu MR-VP berubah menjadi kuning atau jingga setelah penambahan reagens

C. Uji Voges Proskauer Hari Pertama

1. Tandai kaldu MR-VP dengan biakan bakteri yang digunakan 2. Inokulasi kaldu MR-VP dengan biakan bakteri

3. Inkubasikan dalam 37oC selama 24-48 jam Hari Kedua

1. Tambahkan 10 tetes larutan 40% KOH dan 15 tetes larutan alfanaftol dalam kaldu MR-VP

2. Kocok tabung sehingga kaldu terlihat berbuih. Pengocokan dengan baik meningkatkan aerasi sehingga terjadi peningkatan oksidasi 2-3 butanadiol menjadi asetoin dan memperjelas hasil reaksi uji ini. Hasil reaksi dapat terlihat paling lambat setelah 30 menit

3. Uji bersifat positif bila kaldu berwarna merah dalam waktu 30 menit setelah penambahan reagens. Uji bersifat negatif bila kaldu MR-VP tidak memperlihatkan perubahan warna setelah penambahan reagens

D. Uji Sitrat Hari Pertama :

1. Tandai Tabung Simmons citrate agar dengan nama, tanggal dan nama mikroorganisme yang diuji

2. Inokulasi tabung agar dengan inoculum yang tipis. Inokulum yang tebal kadangkala menyebabkan mikroorganisme seakan-akan dapat tumbuh dalam SC agar, sehingga hasil pengujian dapat memberikan hasil yang tidak benar

3. Inkubasi pada suhu 35-37oC selama 48 jam Hari Kedua :

(48)

1. Perhatikan perubahan warna dengan melihat pertumbuhan dan perubahan warna dari hijau ke biru

2. Laporkan hasil pengujian Hasil IMVIC :

E. coli = + + - -

E. aerogenes = - - + +

Keterangan Indol MR VP Citrate

E.coli

Enterobacter aerogenes

Pertanyaan :

1. Materi (bahan) apa yang diubah menjadi indol? Dan zat apa yang mengubah sehingga menjadi indol?

2. Mikroorganisme apa saja yang hasil ujinya positif terhadap Methyl Red? Tuliskan reaksinya!

3. Dan bakteri apakah yang hasil ujinya negatif terhadap uji Voges Proskauer? Tuliskan reaksinya?

4. Pada uji sitrat, apakah E.coli menggunakan sitrat sebagai sumber nutrisi?

(49)

Pengujian TSIA (Triple Sugar-Iron Agar)

Uji Triple sugar-iron agar (TSIA) digunakan untuk membedakan diantara grup atau genera dari Enterobacteriaceae, yang mana semuanya berbentuk batang dan berupa gram negatif yang mampu mengubah glukosa dengan cara memfermentasinya dan menghasilkan asam, yang merupakan pembeda dari gram negatif saluran pencernaan lainnya.

Uji pembeda ini dengan menggunakan pola fermentasi karbohidrat dan produksi hidrogen sulfida oleh beberapa grup mikroorganisme saluran pencernaan. Untuk memfasilitasi penggunaan karbohidrat pada mikroorganisme, maka TSI agar miring mengandung konsentrasi 1% laktosa dan sukrosa dan mengandung konsentrasi glukosa sebesar 0.1%. Indikator asam basa yaitu fenol red juga disertakan untuk mendeteksi perubahan media dari oranye-merah menjadi kuning karena adanya asam. Agar miring diinokulasi dengan cara menusuk dan menggores agar tersebut. Hal ini memerlukan jarum ose lurus yang steril, dengan menusuk lurus sampai bawah dan kemudian dilakukan penggoresan pada permukaan agar miring. Sehingga dihasilkan hal sebagai berikut :

1. Agar bagian miring basa (merah) dan dasarnya asam (kuning) dengan atau tidak dengan produksi gas (terjadinya pemecahan di dasar agar): Hanya fermentasi glukosa terjadi. Mikroba lebih menyukai menurunkan glukosa dahulu.

2. Agar miring asam (kuning) dan dasar asam (kuning) atau tidak dengan produksi gas. Fermentasi laktosa atau sukrosa terjadi.

3. Agar miring basa (merah) dan dasar basa (merah) dengan tidak ada perubahan pada dasar (oranye-merah). Tidak ada fermentasi karbohidrat terjadi, malah sebaliknya pepton dikatabolik dalam keadaan anaerob dan atau dalam kondisi aerob, menghasilkan pH basa dengan tujuan produksi ammonia.

TSI juga mengandung natrium tiosulfate, substrat untuk produksi H2S

menunjukkan perubahan kehitaman pada dasar karena presipitasi besi sulfit yang tidak larut. Hanya organisme yang dapat memproduksi H2S akan menghasilkan perubahan

(50)

Tujuan Intruksional

1. Mahasiswa mampu mengetahui uji pembedaan pada grup Enterobacteriaceae 2. Mahasiswa mampu melakukan pembedaan terhadap jenis bakteri Enterobacteriaceae dan grup bakteri batang pada saluran pencernaan

(51)

Bahan Alat :

Triple Sugar Iron Agar Tabung reaksi

Buffered pepton water Bunsen

Aquadest ose

inkubator

kultur bakteri : biakan bakteri dalam broth ( E.coli, Enterobacter, Klebsiella, Proteus,

S.typhi, Shigella dll)

1. Siapkan TSI agar miring yang telah steril, beri label.

2. Ambil kultur yang akan digunakan, gunakan ose untuk menginokulasi ke agar TSI dengan cara menusuk dan menggores agar TSI dan tutup dengan baik, siapkan pula untuk kontrol

3. Inkubasi selama 18 sampai 24 jam pada suhu 37oC D. Hasil Pengamatan

Jenis Bakteri Fermentasi Karbohidrat Produksi H2S

Warna dasar agar dan reaksi Warna agar miring dan reaksi Fermentasi Karbohidrat Menghitam H2S + atau - E. coli Enterobacter aerogenes Proteus vulgaris dll

(52)

MIKROBIOLOGI DASAR TEKNOLOGI PANGAN TRILOGI 48 Catatan : -Bagian miring asam -Dasar agar asam -Tidak terbentuk H2S -Bagian miring asam -Dasar agar asam -Terbentuk H2S -Bagian miring basa -Dasar agar asam -Tidak terbentuk H2S -Bagian miring basa -Dasar agar asam -Terbentuk H2S -Bagian miring basa -Dasar agar basa atau tidak ada perubahan pada dasar agar

Escherichia Klebsiella Enterobacter Citrobacter Arizona Beberapa Proteus spp Shigella Beberapa Proteus spp Kebanyakan Salmonella Arizona Citrobacter Alcaligenes Pesudomonas Acinetobacter Pertanyaan :

1. Untuk tujuan apakah uji TSI tersebut?

2. Indikator fenol red pada media berfungsi sebagai apa? 3. Mengapa waktu inkubasinya harus selama 18 sampai 24 jam?

(53)

Pengujian Katalase

Uji katalase digunakan untuk mengetahui aktivitas katalase pada bakteri yang diuji. Keberadaan H2O2 pertama kali dideteksi pada kultur Pneumococcus, sebuah

organisme yang tidak memproduksi katalase dan sedikit sensitif terhadap peroksida. Organisme yang tidak memproduksi katalase dilindungi oleh penumbuhan dengan jaringan hewan atau tumbuhan atau organisme lain yang mempunyai kemampuan memproduksi enzim. Katalase diproduksi oleh beberapa bakteri. Beberapa bakteri diantaranya memproduksi katalase lebih banyak daripada yang lain. Ini ditunjukkan dengan jumlah yang banyak pada bakteri aerob. Sedangkan enzim tidak diproduksi oleh bakteri anaerob obligat karena mereka tidak memerlukan enzim tersebut.

Umumnya bakteri memproduksi enzim katalase yang dapat memecah H2O2 menjadi H2O dan O2. Enzim katalase diduga penting untuk pertumbuhan aerobik

karena H2O2 yang dibentuk dengan pertolongan berbagai enzim pernafasan bersifat

racun terhadap sel mikroba. Beberapa bakteri yang termasuk katalase negatif adalah Streptococcus dan Enterococcus.

Bakteri katalase negatif tidak menghasilkan gelembung-gelembung gas sedangkan pada katalase positif maka akan menghasilkan gelembung-gelembung gas. Pada percobaan kali ini kita akan melihat bakteri apa saja yang bersifat katalase positif atau katalase negatif.

1. Mahasiswa mampu mengetahui mikroorganisme apa saja yang dapat mendegradasi hidrogen peroksida dengan memproduksi enzim katalase