Lampiran 1. Pembuatan Larutan Stok dan Buffer
A. Pembuatan Larutan Stok
Tris HCL 1 M pH 8.0 (100 ml) : Timbang Tris sebanyak 12,114 g. Masukkan Tris ke dalam Erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades. Aduk campuran larutan sampai homogen, selanjutnya ditambah 4,2 ml HCL pekat sedikit demi sedikit sampai pH mencapai 8, kemudian volume ditepatkan dengan aquades hingga 100 ml. Larutan disterilkan dengan autoklaf.
EDTA 0,5 M pH 8.0 (100 ml) : Timbang EDTA sebanyak 18,612 g dan NaOH 2.0 g. Masukkan kedalam Erlenmeyer dan ditambah 80 ml aquades. Selanjutnya, ditambahkan HCL pekat sedikit demi sedikit sampai pH 8, kemudian volume ditepatkan dengan aquades hingga 100 ml. Larutan disterilkan dengan autoklaf.
NaCl 5 M (100 ml) : Timbang NaCl sebanyak 29,22 g. Masukkan kedalam Erlenmeyer dan ditambahkan aquades hingga larutan mendekati 100 ml dan diaduk. Kemudian volume ditepatkan dengan dengan aquades hingga 100 ml. Larutan disterilkan dengan autoklaf.
B. Pembuatan Larutan Bufer
CTAB 2 % (100 ml)
0,2 % β-merkaptotanol Buffer TAE 50 X (100 ml)
Tris = 24,2 g
Asam Asetat Glacial = 5,7 ml EDTA 0,5 M pH 8.0 = 10 ml
Buffer TAE 1 X (1000 ml)
Buffer TAE 50 X = 20 ml Aquades = 980 ml
Kloroform Isoamilalkohol 24:1 (50 ml)
Lampiran 2. Komposisi Medium Y3 yang Digunakan
Bahan Unsur Kimia Konsentrasi (mg/L)
Makro Elemen
NH4Cl 535,000
KNO3 2020,000
MgSO4.7H2O 247,000
CaCl2. 2H2O 294,000
KCL 1492,000
Fe2SO4. 7H2O 27,800
NaEDTA 37,300
Vitamin
Myoinositol 100.000
Piridixin HCl 0,050
Lampiran 3. Data Pengamatan Waktu Terbentuknya Organ (HST)
Konsentrasi 2,4-D Ulangan
1 2 3 4 5
0 mg/L - - - - -
100 mg/L 105 - - - -
115 mg/L - - 153 - -
120 mg/L - - 120 - -
135 mg/L - - 134 - -
Lampiran 4. Matriks kemiripan genetik berdasarkan coefficient dice
Sampel P0 P1 P2 P3 P4 P5
P0 1.00
P1 0.55 1.00
P2 0.58 0.73 1.00
P3 0.32 0.64 0.61 1.00
P4 0.58 0.82 0.79 0.70 1.00
Lampiran 5. Proses Isolasi DNA
Eksplan 0,4 g digerus dalam lumpang porselin dengan bantuan nitrogen cair
Eksplan ditambah kedalam tabung yang berisi 1 ml buffer
ekstrasi, 2% β-merkaptoetanol dan 1% PVP
Eksplan ditambah KIAA (24:1) dan disentrifus dengankecepatan 10.000 rpm pada suhu 4oC selama 5 menit
Supernatan ditambah 1ml isopropanol dan diinkubasi pada suhu -20oC selama 1 malam
DNA diendapkan dengan penambahan 1/10 kali volume sodium asetat dan dihomogenkan.
Supernatan dibuang sedangkan pelet diambil dan dibersihkan dengan alkohol 70% sebanyak 2 kali
DNA divakum pada suhu 37oC selama 10 menit. DNA yang telah kering dilarutkan dengan aquabides (ddH2O) steril
Untuk menghilangkan kontaminan RNA dari DNA dengan menambahkan µL RNase (20 mg/ml) pada suhu 37oC selama 90 menit
Lampiran 6. Uji Kualitas DNA
Agarose 1% ditambahkan dengan 100 ml buffer TAE 1x
Campuran dipanaskan dengan hot plate
Campuran ditambahkan 5 µl EtBr
Larutan gel dituang ke dalam cetakan yang telah dipasang sisir
Gel yang telah mengeras dipindahkan kedalam chamber berisi buffer TAE 1x
Sample dan loading dye dimasukkan kedalam sumur gel dengan perbandingan (5:1)
Alat elektroforesis dihubungkan dengan power supply 80 volt
Lampiran 7. Proses PCR – SSR
Komposisi Master Mix Volume 10 µl : Go Taq® Green 5 µl
DNA template 1 µl Primer R (10 pmol/ µl) 1 µl Primer F (10 pmol/ µl) 1 µl Nuclease free water 2 µl
Running PCR sebanyak 35 siklus : Denaturasi awal 95oC 30 detik
Denaturasi 95oC 1 menit
Annealing (Suhu optimum primer) 55oC dan 58oC 30 detik Extension 72oC 1 menit
Post Extension 72oC 5 menit Kondisi akhir PCR 4oC Tak terbatas (∞)
Lampiran 8. Proses Hasil PCR – SSR
Agarose 2 gram ditambahkan dengan 100 ml buffer TAE 1x
Campuran dipanaskan dengan hot plate
Campuran ditambahkan 5 µl EtBr
Larutan gel dituang ke dalam cetakan yang telah dipasang sisir
Gel yang telah mengeras dipindahkan ke dalam chamber berisi buffer TAE 1x
Sampel hasil PCR dan marker dimasukkan ke dalam sumur gel dengan perbandingan (10:5)
Alat elektroforesis dihubungkan dengan power supplay pada tegangan 70 V, 100 mA pada suhu ruang.
