TESIS
UJI AKTIVITAS ANTIKANKER FRAKSI AKTIF EKSTRAK
ETANOL KULIT BATANG POHON TANJUNG (Mimusopsi
cortex) TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA
Oleh:
VONNA AULIANSHAH
NIM 127014001
PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UJI AKTIVITAS ANTIKANKER FRAKSI AKTIF
EKSTRAK ETANOL KULIT BATANG POHON TANJUNG
(Mimusopsi cortex) TERHADAP SEL KANKER
PAYUDARA
TESIS
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Farmasi pada Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara
Oleh:
VONNA AULIANSHAH
NIM 127014001
PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
LEMBAR PERSETUJUAN TESIS
UJI AKTIVITAS ANTIKANKER FRAKSI AKTIF
EKSTRAK ETANOL KULIT BATANG POHON TANJUNG
(Mimusopsi cortex) TERHADAP SEL KANKER
PAYUDARA
Oleh:
VONNA AULIANSHAH
NIM 127014001
Medan, April 2014 Menyetujui:Komisi Pembimbing, Komisi Penguji,
Prof. Dr. Urip Harahap, Apt. Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt. NIP 195301011983031004 NIP 195311281983031002
Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt. Prof. Dr. Syafrudin Ilyas, M.Biomed. NIP 195103261978022001 NIP 196602091992031003
Prof. Dr. Urip Harahap, Apt. NIP 195301011983031004
Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt. NIP 195103261978022001
Mengetahui: Disahkan Oleh:
Ketua Program Studi, Dekan,
PENGESAHAN TESIS
Nama Mahasiswa : Vonna Aulianshah Nomor Induk Mahasiswa : 127014001
Program Studi : Magister Farmasi
Judul Tesis : Uji Aktivitas Antikanker Fraksi Aktif Ekstrak Etanol Kulit Batang Pohon Tanjung (Mimusopsi cortex) Terhadap Sel Kanker Payudara
Telah diuji dan dinyatakan LULUS di depan Tim Penguji pada hari Kamis tanggal tujuh belas bulan April tahun dua ribu empat belas.
Mengesahkan: Tim Penguji Tesis
Ketua Tim Penguji Tesis : Prof. Dr. Urip Harahap, Apt. Anggota Tim Penguji Tesis : Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt.
Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt. Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M.Biomed.
SURAT PERNYATAAN
Saya yang bertanda tangan dibawah ini:
Nama Mahasiswa : Vonna Aulianshah Nomor Induk Mahasiswa : 127014001
Program Studi : Magister Farmasi
Judul Tesis : Uji Aktivitas Antikanker Fraksi Aktif Ekstrak Etanol Kulit Batang Pohon Tanjung (Mimusopsi
cortex) Terhadap Sel Kanker Payudara
Dengan ini menyatakan bahwa tesis yang saya buat adalah hasil karya saya sendiri, bukan plagiat, dan apabila dikemudian hari diketahui tesis saya tersebut plagiat karena kesalahan saya sendiri, maka saya bersedia diberi sanksi apapun oleh Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi USU. Saya tidak akan menuntut pihak manapun atas perbuatan saya tersebut.
Demikianlah surat pernyataan ini saya perbuat dengan sebenarnya dalam keadaan sehat.
Medan, April 2014
Yang membuat pernyataan,
Vonna Aulianshah NIM 127014001
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur kepada Allah SWT atas segala nikmat yang tak terhingga sehingga penulis bisa menyelesaikan penelitian dan penulisan tesis dengan judul “Uji Aktivitas Antikanker Fraksi Aktif Ekstrak Etanol Kulit Batang Pohon Tanjung (Mimusopsi cortex) Terhadap Sel Kanker Payudara”,sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar Magister Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara. Selama menyelesaikan penelitian dan tesis ini penulis telah banyak mendapatkan bantuan dan dorongan dari berbagai pihak, baik moril maupun materil. Untuk itu penulis ingin menghaturkan penghargaan dan terima kasih yang tiada terhingga kepada:
1. Rektor Universitas Sumatera Utara, Bapak Prof. Dr. dr. Syahril Pasaribu, DTMH&H., M.Sc., (CTM)., Sp.A(K).
2. Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Bapak Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt., yang telah menyediakan fasilitas dan kesempatan bagi penulis menjadi mahasiswa Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi.
3. Ketua Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Bapak Prof. Dr. Karsono, Apt., yang telah menyediakan fasilitas bagi penulis selama menjadi mahasiswa Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi.
4. Bapak Prof. Dr. Urip Harahap, Apt., dan Ibu Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt., selaku Pembimbing yang tiada hentinya membimbing, mengarahkan, memberikan dorongan dan semangat dengan penuh kesabaran sehingga penulis terpacu untuk menyelesaikan penelitian dan penyelesaian tesis ini.
5. Bapak Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt., dan bapak Prof. Dr. Syafrudin Ilyas, M.Biomed., sebagai penguji.
6. Ibu Dra. Suwarti, M.Si., Apt., Kepala Laboratorium Farmakognosi beserta staf.
7. Bapak Prof. Dr. Supargiyono Kepala Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada beserta staf.
Penulis juga mengucapkan terima kasih dan penghargaan yang tiada hentinya kepada ayahanda Drs. M. Thaib M. Syah, M.Pd., dan ibunda Dra. Elli Dahnum tercinta, yang tiada hentinya berkorban dengan tulus ikhlas bagi kesuksesan penulis, juga kepada saudaraku Verdy Razqianshah dan Vahmi Khairianshah, juga yang teristimewa Cut Putri Agustina, teman-teman Denny Satria, Fitriyanti, Mainal Furqan, Sri Wastuti, Ninda T.M, serta buat semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu yang telah banyak membantu dalam penelitian tesis ini. Kiranya Allah SWT memberikan balasan yang berlipat ganda atas kebaikan dan bantuan yang telah diberikan kepada penulis.
Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari kesempurnaan, sehingga penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun. Akhir kata semoga tulisan ini dapat menjadi sumbangan yang berarti bagi ilmu pengetahuan khususnya bidang farmasi.
Medan, April 2014 Penulis,
Vonna Aulianshah NIM 127014001
UJI AKTIVITAS ANTIKANKER FRAKSI AKTIF EKSTRAK ETANOL KULIT BATANG POHON TANJUNG (Mimusopsi cortex) TERHADAP SEL
KANKER PAYUDARA
ABSTRAK
Kanker payudara merupakan penyebab utama kematian pada wanita. Kanker merupakan pertumbuhan sel-sel tubuh yang tidak terkendali atau abnormal. Minat terhadap penggunaan obat tradisional khususnya untuk penyakit kanker akhir-akhir ini cenderung meningkat. Ekstrak etanol kulit batang pohon Tanjung (EEKBPT) diketahui memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel T47D. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui karakteristik simplisia dan EEKBPT, dan untuk mengetahui aktivitas fraksi aktif EEKBPT melalui nilai IC50,
Fraksi diperoleh melalui ekstraksi cair-cair dari EEKBPT menggunakan pelarut heksana dan etilasetat. Dari ekstraksi tersebut diperoleh fraksi n-heksana, fraksi etilasetat dan fraksi air (sisa). Nilai IC
selektivity index (SI), mekanisme penghambatan siklus sel dan efek penekanan ekspresi
enzim COX-2 sel kanker payudara T47D.
50
Hasil karakterisasi simplisia dan EEKBPT diperoleh kadar air berturut-turut5,32% dan 22,58%;kadar sari larut air 16,57%dan 64,81%; kadar sari larut dalam etanol 20,84% dan 64,15%; kadar abu total 3,23% dan 1,01%;serta kadar abu tidak larut asam 1,54% dan 0,06%. Hasil skrining fitokimia ditemukan golongan steroid/triterpenoid dalam fraksi n-heksana; flavonoid, tanin, glikosida, dalam fraksi etil asetat dan flavonoid, saponin, glikosida dalam fraksi air.
fraksi diperoleh melalui uji sitotoksik terhadapsel T47D dan sel normal (Vero) menggunakan metode MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazoliumbromida] untuk selanjutnya ditentukan nilai SI masing-masing fraksi. Fraksi yang paling aktif dilanjutkan untuk uji mekanisme penghambatan siklus sel dengan metode flowsitometri dan efek penekanan ekspresi enzim COX-2 pada sel T47D dengan metode imunositokimia.
Aktivitas antikanker fraksi aktif EEKBPT ditunjukkan melalui nilai IC50 fraksi n-heksana, etilasetat, dan air terhadap sel T47D berturut-turut sebesar 5796,218 µg/ml; 398,236 µg/ml; dan 145,068 µg/ml; dan fraksi air merupakan fraksi yang paling aktif. Nilai SI 4,130 yang menunjukkan fraksi ait selektif terhadapsel T47D, menghambat siklus sel padafase G2-M, dan mampu menekan ekspresi enzim COX-2 pada sel T47D. Berdasarkan beberapa parameter di atas dapat disimpulkan bahwa fraksi aktif EEKBPT memiliki aktivitas antikanker terhadap sel kanker payudara T47D.
Kata Kunci: fraksi n-heksana, fraksi etilasetat, fraksi air, fraksi aktif, T47D, Vero,
BARKETHANOLICEXTRACT (MIMUSOPSI CORTEX) AGAINSTBREASTCANCER CELL
Abstract
Breast cancer is primary cause of death on women. Cancer is growth uncontrolled or abnormal of cells. Interest touse traditional medicine, especially forcanceron recent years tended to increase. Mimusopsi cortex’s ethanolic extract are known have cytotoxic activity against T47D cell. The aims ofthis study was investigated the characteristics of simplex and Mimusopsi cortex’s ethanolic extract, and investigated the anticancer activity of active fraction of Mimusopsi
cortex’s ethanolic extract through calculated the IC50 values, selectivity index (SI) values, the mechanism of cell cycle inhibition and suppression effect of COX-2 enzyme expressionon T47D breast cancer cell.
Fractions were obtained by liquid-liquid extraction of values using n-hexane and ethylacetate solvent. From the extraction were obtained n-n-hexane fraction, ethyl acetate fraction and aqueous fraction (residu). IC50 values of fractions were obtained through the cytotoxic test against T47D cell and normal cells (Vero) using MTT [3 -(4,5-dimetiltiazol-2-yl) -2,5difeniltetrazoliumbromide] method, then was determined SI values of each fraction. The most active fraction was continued to mechanism of cell cycle inhibiti on test using flowcyitometry method and suppresion effects of COX-2 enzyme expression on T47D cells using immunocytochemistry method.
Based ons implex and ethanolic extract of Mimusopsi cortex characterization showed water content respectively 5.32% and 22.58%, water-soluble extract content 16.57% and 64.81%; ethanol-water-soluble extract content 20.84% and 64.15%, total ash content 3.23% and 1.01%, and acidic unsoluble ash 1.54% and 0.06%. Phytochemical screening showed steroids/triterpenoids in n-hexane fraction; flavonoids, tannins, glycosides,in ethylacetate and flavonoids, saponins, glycosides in aqueous fraction.
Anticancer activity of active fraction of Mimusopsi cortex’s ethanolic extract was showed through IC50 values of n-hexane fraction, ethylacetate, and aqueous to T47D cells, respectively 5796.218 µg/ml, 398.236 µg/ml, and 145.068 µg/ml, Aqueous fraction is the most active fraction of Mimusopsi cortex’s ethanolic extract. SI value of 4.130 indicates the aqueous fraction selective against T47D cells, inhibited the G2-M phase cell cycle, and able to suppressed the COX-2 enzyme expression of T47D cells. Based on some parameters above had conclusive that active fraction of Mimusopsi cortex’s ethanolic extract has
anticancer activity on T47D breast cancer cells.
Keywords: Ethanolic extract of Mimusopsi corte xfractions, T47D, Vero,
DAFTAR ISI
Halaman
JUDUL ... i
LEMBAR PENGESAHAN ... iii
PENGESAHAN TESIS ... iv SURAT PERNYATAAN ... v KATA PENGANTAR ... vi ABSTRAK ... viii ABSTRACT ... ix DAFTAR ISI ... x DAFTAR TABEL ... xv
DAFTAR GAMBAR ... xvi
DAFTAR LAMPIRAN xvii BAB I PENDAHULUAN ... 1 1.1 Latar Belakang ... 1 1.2 Perumusan Masalah ... 6 1.3Hipotesis ... 7 1.4 Tujuan Penelitian ... 7 1.5 Manfaat Penelitian ... 8
1.6 Kerangka Pikir Penelitian ... 8
1.7 Alur Penelitian ... 9
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 11
2.1 TumbuhanTanjung ... 11
2.1.1 Morfologi tumbuhan ... 11
2.1.3 Manfaat kulit batang pohon tanjung ... 12
2.2 Ekstraksi ... 12
2.2.1 Ekstraksi cair-cair ... 13
2.3 Kanker ... 14
2.3.1 Tinjauan umum kanker ... 14
2.3.2 Sifat kanker ... 14 2.3.3 Siklus sel ... 18 2.3.4 Mekanisme apoptosis ... 21 2.3.5 Karsinogenesis ... 21 2.4Kanker payudara ... 21 2.5 Sel T47D ... 21 2.6Uji sitotoksik ... 26 2.7MTT assay ... 26 2.8Flowcytometry ... 27 2.9Selectivity index ... 28
2.10Enzim Cyclooxygenase-2 (COX-2) ... 28
BAB III METODE PENELITIAN ... 31
3.1 Alat dan Bahan ... 32
3.1.1 Alat ... 32
3.1.2 Bahan ... 33
3.2 Pengumpulan dan Pengolahan Sampel ... 33
3.2.1 Pengambilan sampel ... 33
3.3 Pembuatan Pereaksi ... 34
3.3.1 Pereaksi Bouchardat ... 34
3.3.2 Pereaksi Dragendorff ... 35
3.3.3 Pereaksi Mayer ... 35
3.3.4 Besi (III) Klorida 1% ... 35
3.3.5 Pereaksi Molish ... 35
3.3.6 Timbal (II) asetat 0,4 M ... 35
3.3.7 Larutan asam klorida 1 N ... 35
3.3.8 Larutan asam klorida 2 N ... 36
3.3.9 Pereaksi natrium hidroksida 1 N ... 36
3.3.10 Pereaksi natrium hidroksida 2 N ... 36
3.3.11Pereaksi Lieberman-Bouchardat ... 36
3.3.12 Pereaksi kloralhidrat ... 36
3.4 Karakterisasi Simplisia ... 36
3.4.1 Pemeriksaan makroskopik ... 36
3.4.2 Pemeriksaan mikroskopik ... 36
3.4.3 Penetapan kadar air ... 37
3.4.4 Penetapan kadar sari larut dalam air ... 37
3.4.5 Penetapan kadar sari larut dalam etanol ... 38
3.4.6 Penetapan kadar abu total ... 38
3.4.7 Penetapan kadar abu tidak larut asam ... 38
3.5 Karakterisasi Ekstrak ... 39
3.6 Skrining Fitokimia ... 39
3.6.2 Pemeriksaan flavonoid ... 39 3.6.3 Pemeriksaan glikosida ... 40 3.6.4 Pemeriksaan antrakinon ... 40 3.6.5 Pemeriksaan saponin ... 40 3.6.6 Pemeriksaan tanin ... 41 3.6.7 Pemeriksaan steroid/triterpenoid ... 41
3.7 Pembuatan Ekstrak Etanol Kulit Batang Pohon Tanjung ... 41
3.8 Pembuatan Fraksi-Fraksi EEKBPT ... 42
3.9 Uji antikanker Ekstrak dan Fraksi EEKBPT ... 42
3.9.1 Pembuatan media RPMI ... 43
3.9.2 Pembuatan media kultur lengkap (MK-RPMI) ... 43
3.9.3 Pembuatan media M199 ... 44
3.9.4 Pembuatan media kultur lengkap (MK-M199) ... 44
3.9.5 Penumbuhan sel T47D ... 44
3.9.6 Penumbuhan sel Vero ... 45
3.9.7 Subkultur sel ... 46
3.9.8 Panen sel ... 46
3.9.9 Perhitungan sel ... 46
3.9.10 Pembuatan larutan uji ... 47
3.10Uji Sitotoksik Ekstrak dan Fraksi EEKBPT ... 48
3.11 Analisis Hasil ... 49
3.12 Indek Selektivitas ... 49 3.13 Pengamatan Penghambatan Siklus Sel Dengan
3.14 Uji Penekanan Ekpresi Enzim COX-2 dengan
metode imunositokimia ... 50
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 52
4.1Hasil Identifikasi Tumbuhan ... 52
4.2Karakterisasi Simplisia dan EkstrakEtanol Kulit Batang Pohon Tanjung (EEKBPT) ... 52
4.3Ekstraksi ... 54
4.4Hasil Skrining Fitokimia Fraksi EEKBPT ... 56
4.5Uji Sitotoksik dan Penentuan Indeks Selektivitas Ektrak Etanol dan Fraksi EEKBPT Terhadap sel T47D dan Sel Vero (Sel Normal) ... 58
4.6Uji Penghambatan Siklus Sel Dengan Metode Flowsitometri ... 61
4.7Uji Penekanan Ekspresi Enzim Cyclooxygenase-2 (COX-2) Dengan Media Sel T47D ... 64
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 69
5.1Kesimpulan ... 69
5.2Saran ... 70
DAFTAR PUSTAKA ... 71
DAFTAR TABEL
Ha
Tabel 2.1 Ikatan kompleks CDK-Cyclin pada fase siklus sel ... 21
Tabel 3.1 Matrik uji sitotoksik fraksi EEKBPT terhadap sel T47D dan Vero ... 31
Tabel 3.2Matrik uji penghambatan siklus sel T47D ... 32
Tabel 3.3 Matrik uji penekanan ekspresi enzim COX-2 sel T47D ... 32
Tabel 4.1 Hasil karakterisasi simplisia KBPT ... 53
Tabel 4.2Hasil karakterisasi EEKBPT ... 53
Tabel 4.3Hasil skrining fitokimia fraksi EEKBPT ... ... 56
Tabel 4.4Nilai IC50 Tabel 4.5Akumulasi sel T47D setelah pemberian sampel pada masing-masing sampel uji ... 59
DAFTAR GAMBAR
Ha
Gambar 1.1 Diagram kerangka pikir penelitian ... 8
Gambar 1.2 Diagram alur penelitian ... 9
Gambar 2.1 Pohon Tanjung dan batang pohon Tanjung... 12
Gambar 2.2 Siklus sel ... 20
Gambar 2.3 Proses terjadinya karsinogenesis sel ... 23
Gambar 2.4 Reduksi MTT menjadi formazan ... 27
Gambar 2.5Mekanisme COX-2 dalam regulasi sel kanker ... . 29
Gambar 3.1Hemositometer (kamar hitung) ... 47
Gambar 4.1Profil siklus sel T47D kontrol ... 62
Gambar 4.2 Profil siklus sel T47D dengan perlakuan fraksi air dengan konsentrasi IC50 Gambar 4.3 Profil siklus sel T47D dengan perlakuan fraksi air ... 62
dengan konsentrasi ½ IC50 Gambar 4.4Profil siklus sel T47D dengan perlakuan doksorubisin ... 62
dengan konsentrasi IC50 Gambar 4.5Profil siklus sel T47D dengan perlakuan doksorubisin ... 63
dengan konsentrasi ½ IC50 Gambar 4.6Hasil Pengamatan ekpresi enzim COX-2 pada sel T47D ... 63
DAFTAR LAMPIRAN
Ha Lampiran 1 Hasil identifikasi kulit Batang pohon Tanjung
(Mimusopsi cortex.)... 79
Lampiran 2 Gambar simplisia kulit batang pohon Tanjung
(Mimusopsi cortex.)... 80
Lampiran 3 Cara pengambilan sampel kulit batang pohon Tanjung ... 81 Lampiran 4 Hasil Pemeriksaan Mikroskopik Serbuk kulit
batang pohon Tanjung ... 82 Lampiran 5 Bagan ekstraksi serbuk simplisia secara perkolasi ... 83 Lampiran 6 Bagan pembuatan fraksi dari ekstrak etanol kulit batang
Tanjung ... 84 Lampiran 7 Perhitungan kadar air simplisia kulit batang pohon
Tanjung ... 85 Lampiran 8 Perhitungan kadar sari larut air simplisia kulit
batang pohon Tanjung ... 86 Lampiran 9 Perhitungan kadar sari larut etanol simplisia kulit
batang pohon Tanjung ... 87 Lampiran 10 Perhitungan kadar abu total simplisia kulit
batang pohon Tanjung ... 88 Lampiran 11 Perhitungan kadar abu tidak larut asam simplisia kulit
batang pohon Tanjung ... 89 Lampiran 12 Perhitungan kadar air ekstrak etanol kulit batang pohon
Tanjung ... 90 Lampiran 13 Perhitungan kadar sari larut air ekstrak etanol
kulit batang pohon Tanjung ... 91 Lampiran 14 Perhitungan kadar sari larut etanol ekstrak etanol
kulit batang pohon Tanjung ... 92 Lampiran 15 Perhitungan kadar abu total ekstrak etanol
Lampiran 16 Perhitungan kadar abu tidak larut asam ekstrak etanol
kulit batang pohon Tanjung ... 94
Lampiran 17 Perhitungan absorbansi persen sel hidup T47D ... 95
Lampiran 18 Perhitungan absorbansi persen sel hidup Vero ... 97
Lampiran 19Perhitungan IC50 sampel uji terhadap sel T47D ... 99
Lampiran 20Perhitungan IC50 sampel uji terhadap sel Vero ... 103
Lampiran 21Bagan pembuatan media RPMI ... 107
Lampiran 22Bagan pembuatan media kultur lengkap (MK)-RPMI ... 108
Lampiran 23Bagan pembuatan media M199 ... 109
Lampiran 24Bagan pembuatan media kultur lengkap (MK)-M199 ... 110
Lampiran 25Bagan penumbuhan sel T47D dan Vero ... 111
Lampiran 26Bagan panen sel T47D dan Vero ... 112
Lampiran 27Bagan penghitungan sel T47D dan Vero ... 113
Lampiran 28Bagan pembuatan larutan uji ... 114
Lampiran 29Bagan pengujian sitotoksik ... 115
Lampiran 30Bagan pengujian flowsitometri ... 116
Lampiran 31Bagan pengujian imunositokimia ... 117
Lampiran 32Sel T47D di bawah mikroskop ... 119
Lampiran 33Sel Vero di bawah mikroskop ... 120
Lampiran 34Microplate -96 sumuran ... 121
Lampiran 35Mikroskop inverted, Elisa reader, inkubator CO2, Lampiran 36 Flowsitometer, Laminar Air Flow ... 122
Sertifikat kultur jaringan dari laboratorium pusat Kedokteran tropis fakultas kedokteran UGM ……… 124
