ISOLASI DAN SELEKSI Bacillus sp. UNTUK BIOKONTROL PADA TAMBAK UDANG DESY LESTARI

(1)

ISOLASI DAN SELEKSI Bacillus sp.

UNTUK BIOKONTROL PADA TAMBAK UDANG

DESY LESTARI

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(2)

ABSTRAK

DESY LESTARI. Isolasi dan Seleksi Bacillus sp. untuk Biokontrol pada Tambak

Udang. Di bawah bimbingan IMAN RUSMANA dan NISA RACHMANIA

MUBARIK.

Penyakit bakteri yang umum ditemukan pada budidaya udang terutama

disebabkan oleh Vibrio harveyi, selain itu syarat mutu dan keamanan pangan

produk perikanan antara lain harus bebas dari cemaran mikrob seperti Escherichia

coli. Tujuan penelitian ini untuk mengisolasi dan menyeleksi isolat bakteri

Bacillus sp. dari tambak udang yang potensial digunakan sebagai agen biokontrol

untuk menghambat V. harveyi dan E. coli di tambak udang.

Bacillus sp. diisolasi dari sampel yang diambil dari tambak di provinsi

Lampung. Sebanyak 175 isolat diperoleh dari 17 sampel berupa lumpur, air

tambak dan saluran pencernaan udang. Dari 18 isolat yang yang memiliki aktifitas

penghambatan, hanya delapan isolat yang memiliki indeks zona bening pada

kedua bakteri indikator yaitu V. harveyi dan E. coli (perbandingan antara zona

bening dan diameter koloni) yaitu sama dengan atau lebih dari 0.50. Tiga isolat

yaitu LTS36, LTS40 dan LTW54 menunjukkan aktivitas antimikrob paling stabil

saat diuji terhadap bakteri indikator dengan metode lapis ganda.

Pada uji tantang, Isolat LTW54 yang diisolasi dari air tambak memiliki

kemampuan menghambat pertumbuhan V. harveyi dan E. coli sebesar 99.99 %

sehingga dapat direkomendasikan sebagai kandidat bakteri biokontrol.

ABSTRACT

DESY LESTARI. Isolation and Screening of Bacillus sp. for Biocontrol Agents

in Shrimp Ponds. Under supervision of IMAN RUSMANA and NISA

RACHMANIA MUBARIK.

Bacterial diseases in shrimp aquacultures are mainly caused by Vibrio harveyi.

Based on quality and food safety regulations, fishery product have to be free from

microbial pathogents such as Escherichia coli. The aim of this research was to

isolate and screen Bacillus sp. isolates that had potential used as biocontrol agents

in aquacultures.

Several isolates of Bacillus sp. were isolated from sediment, pond water and

shrimp guts. Samples were collected from shrimp ponds in Lampung Province. As

many as 175 isolates were obtained from 17 samples. From eighteen isolates that

showed inhibiton activity, eight isolates showed high inhibition activities to either

V. harveyi and E. coli. The values inhibition zone index were equal to or more

than 0.50. Three isolates, i.e. LTS36, LTS40 and LTW54 isolates demonstrated

the highest and stable antimicrobial activity against the indicator bacteria.

Challenge tests showed that the LTW54 isolates had ability to inhibit growth

of V. harveyi and E. coli growth up to 99.99%, therefore it could be recomended

as biocontrol agents in shrimp ponds.

(3)

ISOLASI DAN SELEKSI Bacillus sp.

UNTUK BIOKONTROL PADA TAMBAK UDANG

DESY LESTARI

Skripsi

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains pada

Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(4)

Judul : Isolasi dan Seleksi Bacillus sp. untuk Biokontrol pada Tambak Udang

Nama : Desy Lestari

NIM : G34102033

Menyetujui:

Pembimbing I Pembimbing II

Dr. Iman Rusmana, M.Si. Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si.

NIP 131 956 713 NIP 132 045 531

Mengetahui:

Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Institut Pertanian Bogor

Dr. Drh. Hasim, DEA

NIP 131 578 806

(5)

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Sukabumi, Jawa barat pada tanggal 18 September 1984

dari pasangan bapak Alm.Yuyun Junaedi dan Ibu Hodijah. Penulis merupakan

putri ke tujuh dari sembilan bersaudara.

Penulis lulus dari SMU Negeri 1 Cibadak, Sukabumi dan diterima di IPB

melalui jalur Penelusuran Minat Dan Kemampuan (PMDK) pada tahun 2002.

Penulis memilih jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Alam (FMIPA).

Selama mengikuti perkuliahan, Penulis aktif pada berbagai kegiatan kampus

yaitu: staf Departemen Informasi dan Komunikasi Dewan Keluarga Mesjid

Al-hurriyah dan staf Departemen Kewirausahaan Himpunan Mahasiswa Biologi

(HIMABIO) pada tahun 2002, staf Departemen Kajian Strategis dan Advokasi

Badan Eksekutif Mahasiswa FMIPA IPB pada tahun 2003, serta menjabat sebagai

sekretaris I Himpunan Mahasisiwa Biologi pada tahun 2004.

Penulis mendapat beberapa program Beasiswa pendidikan diantaranya dari

Perhimpunan Orang tua Mahasiswa (POM), Student Equity, serta Beasiswa

Pengabdian Masyarakat dari PT. Indonesia Power Unit Bisnis Pembangkitan

Kamojang, Garut.

Selama kuliah penulis pernah menjadi asisten pada mata kuliah Biologi dasar

dan Botani umum pada tahun ajaran 2003/2004. Penulis juga pernah

melaksanakan Praktek Lapang selama satu bulan di bagian produksi PT. Indomeiji

Dairy Food Sukabumi.

(6)

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Illahi Rabbi karena atas rahmat

dan hidayah-Nyalah karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian dengan

judul Isolasi dan Seleksi Bacillus sp. untuk Biokontrol pada Tambak Udang ini

dilaksanakan sejak bulan Desember hingga Agustus 2006 di Laboratorium

Mikrobiologi Departemen Biologi FMIPA IPB.

Pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada Dr.

Iman Rusmana, M.Si. dan Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si. selaku

pembimbing yang telah memberikan bimbingan dengan penuh perhatian dan

kesabaran, sehingga penulis mampu menyelesaikan skripsi ini, dan Ir.

Sulistijorini, MS. selaku dosen penguji yang telah memberikan saran dan masukan

sehingga turut membantu menyempurnakan karya ilmiah ini.

Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada staf laboratorium

Mikrobiologi atas segala fasilitas dan bantuan yang diberikan, rekan-rekan

BIO’39 atas kenangan terindah selama di Bogor, PT. Indonesia Power yang telah

mendukung pendidikan melalui bantuan beasiswa, serta Prof. AM Satari yang

telah memberikan dukungan materiil dan juga spirit di saat penulis ditempa ujian.

Penghargaan tertinggi penulis persembahkan untuk Alm. Bapak, Mamah, kak

Dadang, kak Rahmat, suami tercinta Bayu Ferdiman dan seluruh keluarga Besar

M. Toha atas segala dukungan, do’a dan kasih sayangnya selama ini.

Semoga skripsi ini bermanfaat.

Bogor, Januari 2008

(7)

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL... viii

DAFTAR GAMBAR ... viii

DAFTAR LAMPIRAN... viii

PENDAHULUAN

Latar Belakang... 1

Tujuan... 1

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat ... 1

Bahan... 1

Metode Penelitian... 1

Isolasi dan Seleksi Awal Bacillus sp... 1

Uji Daya Hambat Isolat Bacillus sp. terhadap Bakteri Indikator ... 2

Pengamatan Terbatas Isolat Bacillus sp. Terpilih ... 2

Uji Tantang Isolat Bacillus sp. Terpilih terhadap Bakteri Indikator ... 2

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil ... 2

Isolasi dan Seleksi Awal Bacillus sp... 2

Uji Daya Hambat Isolat Bacillus sp. terhadap Bakteri Indikator... 2

Pengamatan Terbatas Isolat Bacillus sp. Terpilih. ... 3

Uji Tantang Isolat Bacillus sp. Terpilih terhadap Bakteri Indikator... 4

Pembahasan ... 5

SIMPULAN ... 7

SARAN ... 7

DAFTAR PUSTAKA ... 7

(8)

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Hasil isolasi Bacillus sp. secara umum ... 3

2 Seleksi delapan isolat Bacillus sp. terpilih... 3

3 Karakter morfologi ketiga isolat Bacillus sp. terpilih ... 3

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. menggunakan

metode lapis ganda terhadap E. coli dan V. harveyi

... 3

2 Populasi E. coli pada uji tantang secara in vitro ... 4

3 Populasi V. harveyi pada uji tantang secara in vitro ... 5

4 Persentase penghambatan isolat Bacillus sp. terhadap populasi

E. coli dan V. harveyi ... 5

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Hasil isolasi dan seleksi awal Bacillus sp. dari berbagai macam sampel .... . 10

2 Seleksi 28 isolat Bacillus sp. dengan metode lapis ganda ... . 15

3 Seleksi 18 isolat Bacillus sp. dengan metode lapis ganda ... . 16

4 Hasil pewarnaan Gram dan pengamatan motilitas ke-18 isolat Bacillus sp . 17

5 Populasi E. coli pada uji tantang dengan ketiga isolat Bacillus sp... ... . 18

6 Populasi V. harveyi pada uji tantang dengan ketiga isolat Bacillus sp... ... . 19

(9)

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Salah satu faktor yang menekan keberhasilan budidaya ikan dan udang di Indonesia ialah masalah penyakit pada tingkat pembenihan dan pembesaran. Kegagalan tersebut terutama disebabkan belum teratasinya permasalahan penyakit, yang tidak saja dapat berakibat pada kematian massal, namun juga menurunkan mutu (Fryer et al. 1972). Di lain pihak, tantangan yang harus dihadapi pasar dunia bagi komoditi ekspor perikanan budidaya ialah menyangkut mutu dan sanitasi (food safety) seperti masalah kandungan hormon dan antibiotik, bakteri patogen, racun hayati (biotoksin laut) dan pestisida (Djazuli 2002).

Lightner (1993) melaporkan terdapat beberapa kelompok bakteri penyebab penyakit udang yaitu: Vibrio berpendar, Aeromonas,

Pseudomonas, dan Flavobacterium.

Kelompok Vibrio berpendar merupakan

penyebab utama serangan penyakit pada udang, baik pada tingkat larva maupun dewasa (Lavilla-Pitogo et al. 1992). Penggunaan antibiotik untuk pemberantasan penyakit telah menyebabkan resistensi bakteri

Vibrio terhadap beberapa jenis antibiotik

(Tjahjadi et al. 1994). Penyakit vibriosis terjadi karena adanya infeksi sekunder oleh patogen oportunistik, sedangkan penyebab utamanya ialah infeksi oleh patogen lain, defisiensi nutrisi, kondisi lingkungan yang memburuk, dan stress (Lavilla-pitogo et al. 1992, Lightner et al. 1993). Organisme lain yang termasuk bakteri patogen diantaranya

Escherichia coli, spesies ini dapat dijadikan

sebagai indikator buruknya sanitasi, yaitu terkontaminasi feses manusia dan hewan berdarah panas lainya (Kanduri 2002). Oleh karena itu, salah satu syarat mutu udang ialah bebas dari cemaran mikrob seperti E. coli (SNI 01-2728-1992).

Salah satu upaya untuk menjamin kelangsungan produksi, mencegah dan menanggulangi penyakit pada budidaya udang ialah melalui pendekatan biokondisioner atau biokontrol, antara lain penggunaan aktivitas bakteri probiotik yang biasa disebut dengan uji kompetisi (Widiyanto 1996). Istilah probiotik didefinisikan sebagai mikrob hidup yang memberikan pengaruh menguntungkan pada inang dengan memodifikasi komunitas mikrob atau berasosiasi dengan inang, memperbaiki nilai nutrisi, memperbaiki respon inang terhadap penyakit, atau memperbaiki lingkungan kualitas ambang

batas. Bakteri yang direkomendasikan sebagai agen biokontrol dalam akuakultur ialah bakteri asam laktat (seperti Lactobacillus dan

Corinebacterium), genus Vibrio (seperti Vibrio alginolyticus), genus Bacillus dan

genus Pseudomonas.

Tujuan

Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh isolat Bacillus sp. yang mampu menghambat pertumbuhan E. coli dan V.

harveyi.

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Desember 2005 sampai dengan Agustus 2006 di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi FMIPA IPB, Baranangsiang-Bogor.

Bahan

Bahan penelitian yang digunakan ialah sampel berupa air, sedimen serta udang segar dari tambak di kabupaten Tulangbawang, provinsi Lampung. Sedangkan bahan penelitian hidup yaitu: E. coli diperoleh dari koleksi isolat laboratorium mikrobiologi Departemen Biologi FMIPA IPB, dan Vibrio

harveyi berasal dari koleksi isolat

laboratorium mikrobiologi Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Kelautan IPB.

Media yang digunakan untuk isolasi, kultur dan pengujian bakteri ialah: Sea Water

Complete atau SWC 50% (air laut 75%,

akuades 25%, gliserol 1.5 ml, bactopeptone 2.5 g, yeast extract 0.5 g dan 2.0% agar, pH 7.0) cair dan padat, Eosin Methylene Blue (EMB) dan Thiosulphate-Citrate-Bile-Salt (TCBS).

Isolasi dan Seleksi Awal Bacillus sp.

Sebanyak 1 g sampel sedimen atau 1 ml air tambak disuspensikan ke dalam 9 ml NaCl fisiologis steril dengan konsentrasi 98%. Kemudian dikocok dengan vorteks dan diencerkan secara serial dan diberi renjatan panas (heat shock) pada suhu 80 ºC selama 15 menit. Sebanyak 100 µl larutan diencerkan secara serial lalu disebar pada media SWC 50% agar dan diinkubasi selama 48 jam secara aerob. Koloni yang tumbuh dimurnikan kembali pada media yang sama.

Sampel berupa udang segar ditimbang beratnya, lalu dengan menggunakan cutter steril udang dibedah pada bagian dorsal. Saluran usus diambil secara aseptik lalu

(10)

dimasukkan ke dalam NaCl fisiologis steril dengan konsentrasi 98%. Kemudian usus udang digerus hingga halus dan membentuk suspensi, lalu 1 ml suspensi diencerkan secara serial.

Bakteri indikator berupa E. coli dan V.

harveyi diremajakan masing-masing pada

media EMB dan TCBS. Seleksi awal dilakukan dengan menggunakan metode lapis ganda. Satu lup biakan bakteri indikator diinokulasikan ke dalam 50 ml SWC 50% cair. Kemudian diinkubasi pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 110 rpm pada suhu ruang selama 24 jam. Sebanyak 1 ml biakan bakteri indikator disuspensikan ke dalam 100 ml SWC 50% semi solid. Lapis ganda dibuat dengan menuangkan 5 ml agar semisolid ke dalam media SWC padat. Setelah agar menjadi padat, setiap isolat

Bacillus sp. yang telah dimurnikan ditotol di

atas permukaaan agar dengan menggunakan tusuk gigi steril secara duplo. Biakan diinkubasi pada suhu 28 °C selama 24 jam dan diukur indeks penghambatannya. Panjang diameter zona bening diukur berdasarkan diameter seluruh zona dikurangi diameter isolat.

Uji Daya Hambat Isolat Bacillus sp. terhadap Bakteri Indikator

Tahap ini dilakukan dengan metode yang sama seperti seleksi awal untuk menguji isolat yang memiliki diameter zona bening terbesar. Konsentrasi sel bakteri indikator telah ditentukan yaitu 106 sel/ml untuk E. coli dan 107 sel/ml untuk V. harveyi. Seleksi lanjut dilakukan selama tiga kali berturut-turut dengan dua kali ulangan. Zona hambatan yang terbentuk diukur pada tiga posisi lalu dirata-ratakan.

Pengamatan Terbatas Isolat Bacillus sp. Terpilih

Morfologi, sifat pewarnaan gram, dan motilitas isolat Bacillus sp. diidentifikasi menggunakan prosedur mikrobiologi standar (Hadioetomo 1993).

Uji Tantang Isolat Bacillus sp. Terpilih terhadap Bakteri Indikator

Tiga isolat Bacillus sp. yang memiliki indeks penghambatan terbesar dan paling stabil dijadikan kandidat biokontrol untuk diuji tantang. Uji tantang secara in vitro dilakukan menggunakan media kaldu SWC dalam labu erlenmeyer. Kepadatan bakteri E.

coli dan V. harveyi dibuat menjadi 106 sel/ml dan 107 sel/ml. Hasil uji pada penelitian

sebelumnya menunjukkan bahwa V. harveyi bersifat patogen pada kepadatan 107 sel/ml (Rengpipat et al. 1998) dan kepadatan bakteri penantang (LTS36, LTS40, dan LTW54) sebesar 108 sel/ml (Hala 1999).

Kontrol dibuat dengan menginokulasikan

Bacillus sp. dan bakteri indikator secara

terpisah. Kemudian dari masing-masing kultur diambil sebanyak 100 µl, diencerkan dan disebar pada media SWC 50% padat. Penyebaran dilakukan pada jam ke-0, 24, 48, dan 96. Setelah itu, diinkubasi selama 24 jam dan dihitung jumlah populasi E. coli dan V.

harveyi yang terbentuk. Persentase penghambatan bakteri indikator oleh isolat

Bacillus sp. diperoleh melalui cara :

% Penghambatan = X-Y x 100% X

Keterangan

X = Jumlah sel bakteri indikator pada kontrol Y = Jumlah sel bakteri pada perlakuan

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil

Isolasi dan Seleksi Awal Bacillus sp.

Dari contoh berupa air tambak, sedimen sifon, sedimen tambak umur 138 hari dan usus udang diperoleh total 175 isolat yang didominasi oleh isolat asal air tambak sebanyak 64 isolat. Sedangkan jumlah isolat yang paling sedikit diperoleh dari usus udang yaitu sebanyak 32 isolat (Lampiran 1). Seleksi awal isolat terhadap bakteri indikator menghasilkan persentase penghambatan paling besar ialah isolat yang berasal dari sedimen sifon masing-masing sebesar 17,5% dan 42,5% (Tabel 1). Dari total 175 isolat

Bacillus sp. dilakukan penyeleksian kembali

sehingga diperoleh 18 isolat yang memiliki indeks penghambatan yang sama dengan atau lebih dari 0.5 (Lampiran 2 dan 3).

Uji Daya Hambat Isolat Bacillus sp. terhadap Bakteri Indikator. Seleksi lanjutan

dilakukan untuk mencari kandidat biokontrol yaitu isolat yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri indikator dilihat dari besar nilai dan kestabilan indeks penghambatan.

(11)

3

Tabel 1 Hasil isolasi Bacillus sp. secara umum

Jumlah isolat yang menghambat

E. coli V. harveyi

Jenis sampel Jumlah _sampel Jumlah _isolat

Jumlah Persentase (%) Jumlah Persentase (%) Air tambak 2 64 6 9.37 11 17.19 Sedimen sifon 7 40 7 17.50 17 42.5

Sedimen tambak umur

138 hari 2 39 9 23.00 16 41.02

Usus udang 6 32 1 3.13 10 31.25

Total 17 175 23 13.14 54 30.85

Tabel 2 Seleksi delapan isolat Bacillus sp. terpilih

Nomor Indeks Penghambatan *

isolat Asal Kode E. coli V. harveyi

1 Sedimen tambak umur 138 hari LTC5 0.71 ± 0.29 0.92 ± 0.2 2 Sedimen tambak umur 138 hari LTC8 0.91 ± 0.69 0.92 ± 0.08 3 Sedimen tambak umur 138 hari LTC13 0.87 ± 0.47 0.59 ± 0.05

4 Air tambak LTW54 1.17 ± 0.06 1.55 ± 0.12

5 Sedimen sifon LTS36 1.2 ± 0.54 1.54 ± 0.04

8 Air tambak LTW4 0.68 ± 0.18 0.65 ± 0.05

* Data menunjukkan rataan ± SE, n = 2

Dari delapan isolat yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri indikator terdapat tiga isolat yaitu LTW54, LTS36, dan LTS40 yang memiliki nilai indeks penghambatan masing-masing sebesar 1.55 1.54, dan 2.25 terhadap V. harveyi. Sedangkan pengujian terhadap E. coli menunjukkan indeks penghambatan masing-masing sebesar 1.17 untuk LTW54, 1.20 untuk LTS36, dan 1.61 untuk LTS40 (Tabel 2).

Pada penelitian ini tidak diperoleh kandidat biokontrol atau isolat Bacillus sp. terpilih yang berasal dari saluran pencernaan udang, maupun dari sedimen tambak umur 138 hari, karena nilai indeks penghambatan yang diperoleh tidak stabil dan relatif kecil (Gambar 1).

(a)

(b)

Gambar 1 Aktivitas penghambatan isolat

Bacillus sp. menggunakan

metode lapis ganda terhadap E.

coli (a) dan V. harveyi (b) (1.

LTC5 2. LTC8 3. LTC13 4. LTW54 5. LTS36 6. LTS39 7. LTS40 8. LTW4).

(12)

Pengamatan Terbatas Isolat Bacillus sp. Terpilih. Pewarnaan gram dan spora

menunjukkan bahwa semua isolat Bacillus sp. terpilih bersifat gram positif, berbentuk batang, dan membentuk spora (Lampiran 4). Pengamatan morfologi menunjukkan bahwa isolat LTS36 bersifat motil, bentuk bundar, tepian berombak, elevasi seperti kawah dengan bentuk koloni putih dengan bintik coklat pada bagian tengah koloni. Isolat LTW54 memiliki kemiripan dengan LTS36, hanya warna koloni yang berbeda yaitu putih susu. Sedangkan koloni isolat LTS40 bersifat nonmotil, bentuk bundar, tepian tak beraturan, elevasi timbul, serta warna putih susu (Tabel 3).

Tabel 3 Karakter morfologi ketiga isolat

Bacillus sp. terpilih

Isolat Bacillus sp. terpilih Ciri

morfologi _{LTS36 LTS40}_LTW54 Pewarnaan

gram positif positif positif Bentuk batang batang batang Motilitas motil nonmotil motil

Bentuk bundar bundar bundar Tepian berombak tak

beraturan berombak Elevasi seperti kawah timbul seperti

kawah Warna koloni putih susu dengan bintik di bagian tengah

putih susu putih susu

Endospora ada ada ada

Uji Tantang Isolat Bacillus sp. Terpilih terhadap Bakteri Indikator. Hasil penelitian

uji tantang isolat Bacillus sp. terhadap E. coli memperlihatkan adanya kemampuan penghambatan yang hanya terjadi pada percobaan dengan menggunakan isolat LTW54. Perubahan populasi bakteri indikator awal yakni sebesar 7.0 x 104 CFU/ml pada jam ke-0 menjadi 3.4 x 103 CFU/ml pada jam ke-96 pascainokulasi (Lampiran 5). Sedangkan percobaan E. coli bersama isolat LTS36 dan LTS40 menunjukkan pola yang berbeda yaitu mengalami kenaikan populasi mulai dari jam ke-24 hingga jam ke-96 pascainokulasi (Gambar 2). 0 2 4 6 8 10 12 0 24 48 72 96 Waktu (jam) Log C F U /m l E. coli E. coli + LTW54 E. coli + LTS36 E. coli + LTS40

Gambar 2 Populasi E. coli pada uji tantang secara in vitro.

Populasi V. harveyi pada semua

perlakuan biokontrol mengalami pola yang sama yaitu penurunan dari hari ke-1 sampai hari ke-4 sejak diinokulasi. Penurunan paling tinggi terjadi pada perlakuan yang menggunakan isolat LTW54, yaitu dari 3.7 x 106CFU/ml pada jam ke-0 menjadi 3.5 x 104

CFU/ml pada jam ke-96 (Gambar 3, Lampiran 6). Sedangkan isolat LTS36 dan LTS40 memperlihatkan pola penghambatan terhadap perkembangan populasi V. harveyi yang relatif hampir sama, yaitu dari hari ke-1 sampai ke-4, penurunan jumlah bakteri indikator tidak setajam pada perlakuan dengan menggunakan isolat LTW54. 0 2 4 6 8 10 12 0 24 48 72 96 Waktu (jam) L og C F U /m l V. harveyi V. harveyi + LTW54 V. harveyi + LTS36 V. harveyi + LTS40

Gambar 3 Populasi V. harveyi pada uji tantang secara in vitro.

Pada uji tantang yang terjadi pada ke tiga isolat Bacillus sp. dengan E. coli, tidak semua isolat dapat menekan pertumbuhan bakteri target dengan baik. Isolat LTS36 memiliki daya hambat terendah terhadap E. coli yaitu sebesar 91.89%. Pada inkubasi 96 jam, isolat

Bacillus sp. LTW54 dapat menghambat Vibrio Vibrio + LTS36 Vibrio + LTW54 Vibrio + LTS340 E. coli E. coli + LTW54 E. coli + LTS36 E. coli + LTS40

(13)

5

E. coli dengan persen penghambatan

mencapai 99.99% (Gambar 4a). Penghambatan isolat Bacillus sp. terhadap pertumbuhan V. harveyi ditunjukkan dengan nilai persentase penghambatan yang tinggi pada ketiga isolat LTW54, LTS36 dan LTS40 yaitu masing-masing sebesar 99.98%, 99.80% dan 99.79% (Gambar 4b).

Secara umum nilai persentase penghambatan ketiga isolat Bacillus sp. terhadap bakteri target tergolong tinggi, akan tetapi isolat LTW54 mampu menekan pertumbuhan kedua bakteri target lebih baik dibandingkan kedua isolat lainnya. Hal ini dapat dilihat berdasarkan nilai persentase penghambatan yang tinggi terhadap E. coli dan V. harveyi yaitu masing-masing sebesar 99.99% dan 99.98%. 86 88 90 92 94 96 98 100 102 104 LTW54 LTS40 LTS36 Isolat Bacillus sp. % P e ngham bat an te rhadap E. co li (a) 99.6 99.7 99.8 99.9 100 100.1 LTW54 LTS40 LTS36 Isolat Bacillus sp. % P e nghambat an te rhadap V . har v ey i (b)

Gambar 4 Persentase penghambatan isolat

Bacillus sp. terhadap populasi E. coli (a) dan V. harveyi (b).

Pembahasan

Sedimen sifon adalah sedimen yang berada pada bagian dasar tambak dan dikeluarkan secara periodik dari tambak selama masa budidaya udang, sedangkan jenis sedimen tambak umur 138 hari diperoleh dari tambak pada saat pascapanen. Peremajaan isolat bakteri indikator pada media selektif bertujuan untuk melihat kemurnian isolat. Biakan E. coli berwarna hijau logam pada media EMB. Medium ini bersifat selektif

terhadap mikroorganisme Gram negatif karena zat warna yang terkandung di dalamnya melancarkan efek bakteriostatik terhadap bakteri Gram positif. Selama pertumbuhannya dalam medium tersebut, bakteri Gram negatif yang dapat memfermentasi laktosa akan mengambil sebagian dari zat warna yang terkandung di dalam medium sehingga koloninya akan tampak ungu atau gelap dibagian tengahnya. (Hadioetomo 1993). Biakan V. harveyi diremajakan pada media TCBS, medium ini bersifat selektif untuk bakteri dari genus

Vibrio dengan menampilkan koloni berwarna

hijau dan berpendar jika diamati pada ruang gelap (Lavilla-Pitogo et al. 1992).

Isolasi Bacillus sp. dilakukan dengan memberi perlakuan renjatan panas (80 ºC selama 15 menit), perlakuan ini akan mematikan semua sel reproduktif dan sel vegetatif, dan hanya menyisakan endospora (Lindquist 2001). Endospora merupakan tubuh berdinding tebal, sangat refraktif, dan sangat resisten, dihasilkan oleh semua spesies

Bacillus sp. (Pelczar et al. 1986). Inkubasi

secara aerob akan menyebakan endospora dari spesies Bacillus sp. yang dapat berkecambah (Anonim 2005). Selain dari sedimen tambak,

Bacillus sp. juga diisolasi dari usus udang, hal

ini sesuai laporan Lavilla-Pitogo et al. (1992) mengemukakan bahwa kolonisasi bakteri terjadi pada organ-organ saluran pencernaan dan jarang ditemukan pada eksoskeleton.

Hasil isolasi dari lingkungan lebih banyak dibanding dengan hasil isolasi dari usus udang, hal ini diduga karena kelimpahan

Bacillus sp. di lingkungan lebih banyak

dibanding pada usus udang. Pernyataan ini diperkuat oleh Verschuere et al. (2000), bahwa spesies Bacillus sp. umumnya ditemukan pada sedimen laut dan dicerna secara alami oleh hewan seperti udang. Moriarty (1999) melaporkan bahwa Bacillus sp. adalah gram positif, nonpatogen, organisme pembentuk spora dan secara normal terdapat di udara, air, tanah dan sedimen. Bakteri ini diperkirakan dapat masuk ke saluran pencernaan melalui asosiasi dengan makanan (Farzanfar 2006).

Isolat yang berasal dari sedimen sifon dan sedimen tambak umur 138 hari menghasilkan persentase penghambatan yang relatif besar daripada isolat yang berasal dari sampel lain, hal ini diduga berkaitan dengan kelimpahan bahan organik yang mengendap pada bagian dasar sedimen. Sugama (2002) melaporkan bahwa kelebihan sisa pakan diperairan dapat menyebabkan bakteri

(14)

menjadi subur, rendahnya kelarutan oksigen dan menyebabkan peningkatan senyawa metabolit seperti NH4, H2S, nitrit dan SO2.

Isolat Bacillus sp. LTW54, LTS36 dan LTS40 merupakan isolat terpilih yang memiliki penghambatan paling baik terhadap

E. coli dan V. harveyi, yakni dibuktikan

dengan dihasilkannya zona hambat yang luas dan jelas. Adanya zona bening pada uji daya hambat menunjukkan kemampuan isolat

Bacillus sp. dalam menghambat kolonisasi

dari bakteri indikator. Penghambatan ini diduga karena ketiga isolat Bacillus sp. tersebut dapat memproduksi senyawa antimikrob yang dapat berdifusi melalui media semisolid sehingga diperoleh zona bening yang terlihat jelas. Rachmaniar (1997) menyatakan bahwa faktor yang mempengaruhi besar kecilnya zona hambat zat antimikrob antara lain: aktivitas zat antimikrob gugus fungsi dari substansi sendiri, resistensi terhadap substansi zat antimikrob, kadar substansi aktif serta kepadatan bakteri uji.

Efek antibakteri disebabkan oleh faktor berikut: produksi antibiotik, bakteriosin, siderofor, lisozim, protease, dan atau hidrogen peroksida dan perubahan nilai pH melalui produksi asam organik. Komponen penghambat populasi mikrob yang dihasilkan oleh suatu organisme yaitu kemampuan untuk melepaskan substansi kimia yang memiliki efek bakterisida atau bakteriostatik terhadap populasi mikrob lain (Anonim 2000). Pada awalnya sejumlah bakteri tidak memproduksi senyawa aktif apapun dan produksi akan dilakukan pada saat bakteri tersebut terpapar oleh produk ekstraselular yang dihasilkan oleh bakteri lain (Armstrong et al. 2001).

Secara umum, nilai persentase penghambatan isolat Bacillus sp. pada uji daya hambat terhadap bakteri indikator tidak terlalu besar. Hal ini diduga berkaitan erat dengan sifat dari bakteri indikator yaitu E.

coli dan V. harveyi termasuk kelompok

bakteri gram negatif. Ballow et al. (2000) mengemukakan bahwa kebanyakan antimikrob yang diproduksi oleh Bacillus sp. aktif menyerang organisme gram positif. Pelczar dan Chan (1988) menambahkan, bahwa pada umumnya bakteri gram negatif mempunyai ketahanan yang lebih baik terhadap senyawa antimikrob dibandingkan bakteri gram positif karena struktur dinding sel bakteri gram positif lebih sederhana sehingga memudahkan senyawa antimikrob masuk ke dalam sel. Sedangkan bakteri gram negatif mempunyai struktur yang lebih

kompleks yaitu lapisan luar berupa lipoprotein, lapisan tengah berupa polisakarida dan paling dalam ialah peptidoglikan.

Aktivitas penghambatan pertumbuhan bakteri tidak selalu dapat diamati dengan melihat adanya zona bening pada media padat. Oleh karena itu, untuk mengetahui daya hambat zat antimikrob dilakukan uji tantang antara isolat Bacillus sp. terhadap bakteri indikator secara in vitro. Hasil uji menunjukkan isolat LTW54 mampu menghambat E. coli dan V. harveyi secara kuat, hal ini dilihat berdasarkan jumlah sel bakteri indikator yang terus berkurang hingga jam ke-96. Isolat LTW54 diduga memiliki zat antimikrob yang bersifat bakterisida sehingga mengakibatkan sel bakteri indikator lisis. Williams et al. (1996) menyebutkan bahwa mekanisme kerja bakteriosin dalam menghambat pertumbuhan bakteri dapat dilakukan melalui hambatan terhadap pembentukkan dinding sel target, menghambat pembentukkan asam nukleat dan protein, serta mengganggu permebilitas membran sel melalui pembentukkan pori-pori pada membran sel.

Pola penghambatan isolat LTS36 dan LTS40 mengindikasikan bahwa kedua isolat tersebut memiliki aktivitas antimikrob yang hanya dapat menghambat pertumbuhan bakteri indikator (bakteriostatik). Hal ini dilihat berdasarkan pertumbuhan sel E. coli yang tetap meningkat pada perlakuan dengan penambahan kedua isolat tersebut. Kedua isolat ini tumbuh lambat diduga karena penginokulasian isolat Bacillus sp. dan bakteri indikator secara bersamaan. Berbeda halnya dengan penelitian lanjutan (Suparnika 2007) dan (Isramilda 2007) yakni uji tantang dilakukan dengan menumbuhkan isolat

Bacillus sp. terlebih dahulu sehingga dapat

langsung melakukan penghambatan dengan mengekskresikan senyawa antimikrobnya ketika diuji dengan bakteri indikator.

Isramilda (2007) melaporkan hasil karakterisasi zat antimikrob yang dihasilkan oleh isolat Bacillus sp. LTS40 berupa bakteriosin. Bakteriosin adalah senyawa polipeptida yang disintesis melalui ribosom dan banyak dihasilkan oleh spesies Bacillus sp. Senyawa ini memiliki efek bakteriostatik atau bakterisida terhadap bakteri yang berkerabat dekat dengan biakan penghasil, akan tetapi mudah didegradasi oleh enzim proteolitik dalam pencernaan hewan (Jack et

al. 1995, Klaenhammer 1993). Jack et al.

(15)

7

dapat dibedakan dari antibiotik diantaranya dari proses produksi yakni dihasilkan pada saat fase logaritmik, sedangkan antibiotik diproduksi pada saat akhir fase stasioner.

Uji daya hambat dalam cawan petri dan uji tantang secara in vitro dalam gelas erlenmeyer menunjukkan bahwa isolat LTW54 lebih baik kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri indikator dibandingkan dengan ke dua isolat lainnya. Nilai persentase penghambatan isolat LTW54 terhadap E. coli dan V. harveyi tergolong tinggi yaitu masing-masing sebesar 99.99% dan 99.98%. Berdasarkan kemampuan dalam menghambat pertumbuhan bakteri target, isolat LTW54 laik untuk dijadikan sebagai kandidat probiotik. Kemampuan penghambatan isolat Bacillus sp. LTW54 disebabkan oleh adanya produksi senyawa inhibitor berupa antimikrob. Akan tetapi, untuk memastikan jenis senyawa antimikrob yang dihasilkan oleh isolat

Bacillus sp. LTW54 perlu dilakukan uji lanjut.

SIMPULAN

Tiga dari 175 isolat Bacillus sp. yang diisolasi dari sedimen sifon dan tambak udang memiliki nilai zona bening terbesar yaitu LTW54, LTS36, dan LTS40. Isolat LTW54 yang diisolasi dari air tambak memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan E. coli dan V. harveyi tertinggi yaitu masing-masing sebesar 99.99 % dan 99.98 %.

SARAN

Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk melihat sifat patogenisitas dari Bacillus LTW54 serta kemampuan pelekatan pada larva udang untuk melihat kelaikan bakteri tersebut untuk dijadikan agen biokontrol.

DAFTAR PUSTAKA

Armstrong E, Yan L, Boyd KG, Wright PC, Burgess JG. 2001. The symbiotic role of marine microbes on living surfaces.

Hydrobiologia 461:37-40.

Anonim. 2000. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture [ulas balik]. J Microbiol Mol Biol 64 (4): 655-671.

Anonim. 2005. Todar’s online textbook of bacteriology: the genus Bacillus. Kenneth Todar University of Winconsin-Madison Departement of Bacteriology. http://www. [1 Juli 2005].

[BSN] Badan Standarisasi Nasional. 1992. Standar Nasional Indonesia Produk Perikanan: SNI 01-2728-1992 Udang Segar. Jakarta: Badan Standarisasi Nasional.

Ballow CH, Bhavnani SM. 2000. New agents for gram-positive bacteria. Curr. Op.

Microbiol 3: 528-534.

Djazuli N. 2002. Penanganan dan Pengolahan Produk Perikanan Budidaya dalam Menghadapi Pasar Global: Peluang dan Tantangan. Bogor: Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan IPB. http://rudyct.tripod.com/sem1_023/nazor i_djazuli.htm. [8 Mei 2005].

Farzanfar A. 2006. The use of probiotic in shrimp squaculture. Federation of

European Microbiological Societies (FEMS) Immunol Med microbiol XX:

1-10.http://www.blackwellsynergy.com/doi /abs/10.1111/j.1574-695X.2006.00116X. [5 Agustus 2006]

Fryer JL, JS Nelson, RL Garison. 1972. Vibriosis in fish. Progress in fishery and food science. Fish New Series 5: 129-133 Hadioetomo RS. 1993. Mikrobiologi Dasar

dalam Praktek. Jakarta : PT. Gramedia

Pustaka Utama.

Hala Y. 1999. Penggunaan gen penanda molekular untuk deteksi pelekatan dan kolonisasi Vibrio harveyi pada larva udang windu (Penaeus monodon). J

Mikrobiol Indones hlm 13-18.

Isramilda. 2007. Karakterisasi zat antimikrob penghambat pertumbuhan Vibrio harveyi dan Escherichia coli dari Bacillus sp. asal tambak udang. [tesis]. Bogor: Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB

Jack RW, Tagg JR, Ray B. 1995. Bacteriocins of Gram-positive bacteria. Bacteriol Rev 59: 171-200.

Kanduri L, Eckhardt RA. 2002. Food Safety

in Shrimp Processing. New York: Fishing

New Books.

Klaenhammer TR. 1993. Bacteriocins of lactid acid bacteria. FEMS Microbiol

Rev 12: 39-86.

Lavilla-Pitogo RC, Albright LJ, Panner MG, Sunaz NA. 1992. Studies on the Source of Luminecent Vibrio harveyi in

Penaeus monodon Fab. Hatcheries. Di

dalam: M Sharrif, RP Subagshinge, JR Arthur, editor. Disease in Asian

Aquaculture I. Manila: Asian Fisheries

(16)

Lightner DV. 1993. Disease of culture penaeid shrimp. Di dalam: Mc Vey PJ, editor. Handbook of Mariculture: Crustacean Aquaculture. Florida: CRC

Press Inc. hlm 393-487.

Lindquist J. 2001. Isolation of Bacillus. University of Winconsin-Madison. http://www.splammo.net/bact102/102bac illus.html. [1 Juli 2005].

Moriaty DJW. 1999. Disease control in shrimp aquculture with probiotic bacteria. Di dalam: Bell CR, Brylinsky M, Johnson GP, editor. Microbial

Biosystem: New Frontiers. Proceedings of the 8th International Symposium on Microbial Ecology; Halifax, 9-14

Agustus 1998. Halifax: Atlantic Canada Society for Microbial Ecology. hlm 237-243.

Pelczar MJ, Chan ECS. 1988. Dasar- Dasar

Mikrobiologi. Volume ke-2. Hadioetomo

RS, Tedja-Imas. Tjitrosomo SS, Angka SL, penerjemah; Jakarta: UI Pr. Terjemahan dari: Elements of Microbiology.

Rachmaniar R. 1997. Potensi spon asal kepulauan spermonde sebagai antimikroba. Seminar Perikanan Indonesia II; Makasar 2-3 Desember

1997. Makasar: Badan Penelitian dan Pengembangan Perikanan. hlm 13-22. Rengpipat S, Phianphak W, Piyatiratitivorakul

S, Menavesta P. 1998. Effects of a probiotic bacterium on black tiger shrimp Penaeus monodon survival and growth. J Aquaculture 167: 301-313. Sugama K. 2002. Status budidaya udang,

introduksi serta prospek pengembangannya dalam tambak air tawar. Warta Penelitian Perikanan

Indones 8: 19-22.

Suparnika I. 2007. Aktivitas antimikrob

Bacillus sp. yang diiolasi dari tambak

udang. [skripsi]. Bogor: Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB.

Tjahjadi MR, Angka SL, Suwanto A. 1994. Isolation and evaluation of marine bacteria for biocontrol of luminous bacterial diseases in tiger shrimp larvae (Penaeus monodon Fab.). Aspac J Mol

Biol Biotechnol 2:234-352.

Verschuere L, Rombaut G, Sorgeloos P, Verstraete W. 2000. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture [ulas balik]. J Microbiol Mol Biol 64

(4):655-671. http://mmbr.asm.org/cgi/

content/abstract/64/4/655. [8 Mei 2005].

Widiyanto T. 1996. Bakteri fotosintetik anoksigenik sebagai biokontrol di tambak udang: pengurangan produksi H2S dan pengaruhnya pada pertumbuhan Vibrio harveyi. [tesis]. Bogor: Jurusan

Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB.

(17)

(18)

(19)

10

Lampiran 1 Hasil isolasi dan seleksi awal Bacillus sp. dari berbagai macam sampel A. Sampel berupa sedimen tambak umur 138 hari

(*) = tidak ada penghambatan

(**) = zona bening sangat kecil sehingga sulit diukur

Ø zona bening Bacillus sp. pada bakteri indikator:

V. harveyi (mm) E. coli (mm)

No

isolat Kode

ulangan 1 ulangan 2 ulangan 1 ulangan 2

1 LTC1 6 6 5 4 2 LTC2 * 6 * * 3 LTC3 4 5 7 7 4 LTC4 * * * * 5 LTC5 6 7 8 7 6 LTC6 4 4 6 7 7 LTC7 * * * * 8 LTC8 5 5 * 7 9 LTC9 * * * * 10 LTC10 * * * * 11 LTC11 * * * * 12 LTC12 5 * * * 13 LTC13 4 14 7 * 14 LTC14 4 9 * * 15 LTC15 7 * * * 16 LTC16 6 * * * 17 LTC17 3 5 * * 18 LTC18 * * * * 19 LTC19 * * * * 20 LTC20 * 4 * * 21 LTC21 * * * * 22 LTC22 3 9 * * 23 LTC23 * * * * 24 LTC24 * * * * 25 LTC25 * * * * 26 LTC26 * * * * 27 LTC27 * * * * 28 LTC28 * * * * 29 LTC29 * * * * 30 LTC30 * * * * 31 LTC31 * * * * 32 LTC32 * * 9 6 33 LTC33 * * * 5 34 LTC34 * * * * 35 LTC35 * * * * 36 LTC36 * * * * 37 LTC37 * * * * 38 LTC38 * * * * 39 LTC39 * * 22 *

(20)

Lampiran 1 (Lanjutan)

B. Sampel dari saluran pencernaan udang

Ø zona bening Bacillus sp pada bakteri indikator:

No.

Isolat Kode

1 INT1 * * * * 2 INT2 * * * * 3 INT3 12 6 * * 4 INT4 ** ** * * 5 INT5 * * * * 6 INT6 * * * * 7 INT7 * * * * 8 INT8 * * * * 9 INT9 * * * * 10 INT10 * 20 6 10 11 INT11 * * * * 12 INT12 * * * * 13 INT13 * * * * 14 INT14 * * * * 15 INT15 * * * * 16 INT16 * * * * 17 INT17 * * * * 18 INT18 * * * * 19 INT19 * ** * * 20 INT20 ** * * * 21 INT21 ** * * * 22 INT22 * ** * * 23 INT23 * * * * 24 INT24 * * * * 25 INT25 9 11 * * 26 INT26 * * * * 27 INT27 * * * * 28 INT28 * * * * 29 INT29 * * * * 30 INT30 ** ** * * 31 INT31 ** * * * 32 INT32 * * * *

(21)

12

Lampiran 1 (Llanjutan)

C. Sampel dari sedimen sifon

V. harveyi (mm) E. coli (mm)

No.

Isolat Kode

1 LTS1 11 * * * 2 LTS2 ** * * * 3 LTS3 14 * * * 4 LTS4 ** ** * * 5 LTS5 7 4 9 * 6 LTS6 * * * * 7 LTS7 * * * * 8 LTS8 12 * * * 9 LTS9 * * * * 10 LTS10 * * * * 11 LTS11 * * * * 12 LTS12 5 * * * 13 LTS13 ** * 6 * 14 LTS14 * * * * 15 LTS15 * * 6 * 16 LTS16 6 6 * * 17 LTS17 * * * * 18 LTS18 * * * * 19 LTS19 * * * * 20 LTS20 * * * * 21 LTS21 * * * * 22 LTS22 * * * * 23 LTS23 * * * * 24 LTS24 * * * * 25 LTS25 * * * * 26 LTS26 * * * * 27 LTS27 * * * * 28 LTS28 * * * * 29 LTS29 * * * * 30 LTS30 * * * * 31 LTS31 * * * * 32 LTS32 ** * * * 33 LTS33 11 14 8 10 34 LTS34 11 8 9 ** 35 LTS35 * * * * 36 LTS36 11 12 12 * 37 LTS37 * 11 7 ** 38 LTS38 * 9 * * 39 LTS39 9 15 7 9 40 LTS40 * 12 12 9

(22)

D. Asal sampel dari air tambak

ukuran zona bening Bacillus sp. pada bakteri indikator:

V. harveyi (mm) E. coli (mm)

No.

Isolat Kode

1 LTW1 * * * * 2 LTW2 * * * * 3 LTW3 * * * * 4 LTW4 0,5 0,6 * 6 5 LTW5 * * * * 6 LTW6 * * * * 7 LTW7 * * * * 8 LTW8 0,7 * * * 9 LTW9 * * * * 10 LTW10 * * 10 * 11 LTW11 * * * * 12 LTW12 * * * * 13 LTW13 * * * * 14 LTW14 * * * * 15 LTW15 * * * * 16 LTW16 * * * * 17 LTW17 * * * * 18 LTW18 * * * * 19 LTW19 * * * * 20 LTW20 * * * * 21 LTW21 * * * * 22 LTW22 * * * * 23 LTW23 * * * * 24 LTW24 * * * * 25 LTW25 * * * * 26 LTW26 * * * * 27 LTW27 * * * * 28 LTW28 * * * * 29 LTW29 * * * * 30 LTW30 * * * * 31 LTW31 * * * * 32 LTW32 * * * * 33 LTW33 * * * * 34 LTW34 * ** * * 35 LTW35 * ** * *

(23)

14

No.

Isolat Kode

36 LTW36 * ** * * 37 LTW37 * * * * 38 LTW38 * * * * 39 LTW39 * * * * 40 LTW40 * ** * * 41 LTW41 * ** * * 42 LTW42 * * * * 43 LTW43 * * * * 44 LTW44 * * * * 45 LTW45 * * * * 46 LTW46 * * 7 * 47 LTW47 * * * * 48 LTW48 * * * * 49 LTW49 * * * * 50 LTW50 * 11 * * 51 LTW51 * * 4 8 52 LTW52 * * * * 53 LTW53 * * * * 54 LTW54 4 21 4 9 55 LTW55 * * * * 56 LTW56 5 * 6 * 57 LTW57 * * * * 58 LTW58 * * * * 59 LTW59 * * * * 60 LTW60 * * * * 61 LTW61 * * * * 62 LTW62 * * * * 63 LTW63 * * * * 64 LTW64 5 11 * *

(24)

Lampiran 2 Seleksi 28 isolat Bacillus sp. dengan metode lapis ganda

Indeks penghambatan

E. coli V. harveyi

Jenis sampel Kode

isolat

ulangan 1 ulangan 2 rataan ulangan 1 ulangan 2 rataan INT3 * * * * * * INT10 * 1.5 0.75 0.33 6 3.17 Usus udang INT30 1.67 * 0.84 0.33 0.18 0.26 LTC1 0.9 * 0.45 0.45 0.8 0.63 LTC3 2 2.25 2.13 4.3 * 2.15 LTC5 3 3.75 3.4 10 1.33 5.67 LTC6 1.25 0.66 0.96 1.75 1.75 1.75 LTC8 3 1.75 2.38 0.33 2.75 1.54 LTC13 6.33 10 8.17 2 2.5 2.25 LTC22 0.75 3 1.88 4 1.33 2.67 LTC24 * * * * * * LTC25 * * * * * * LTC30 * * * * * * LTC32 * * * * * * Sedimen tambak umur 138 hari LTC39 * * * * * * LTW4 0.8 3.67 2.24 1.33 1.5 1.42 LTW10 * * * * * * LTW51 * * * * * * LTW54 2 7.5 1.38 1.33 2.5 1.92 LTW55 * * * * * * LTW56 4.5 2.25 3.38 * 2.7 2.7 Air tambak LTW64 3 2 2.5 1.9 0.7 2.6 LTS33 1.33 2 1.67 0.6 * 0.3 LTS34 0.23 2 1.12 0.66 0.66 0.66 LTS36 4 2.33 3.17 0.5 1.8 1.15 LTS37 3 1 2 0.33 0.5 0.42 LTS39 3 2 2.5 0.33 2.67 1.5 Sedimen sifon LTS40 4 4.5 4.25 0.75 0.75 0.75

(25)

15

Lampiran 3 Seleksi 18 isolat Bacillus sp. dengan metode lapis ganda A. Tabel penghambatan pada E. coli

Indeks penghambatan Jenis sampel Kode isolat

ulangan 1 ulangan 2 rataan LTW4 1.80 1.67 1.74 LTW54 3.00 2.50 2.75 LTW56 0.50 * 0.25 Air Tambak LTW64 1.45 0.83 1.14 LTS33 0.33 1.00 0.67 LTS34 0.63 2.00 1.32 LTS36 2.35 2.33 2.34 LTS37 1.38 0.46 0.92 LTS39 1.73 1.90 1.57 Sedimen Sifon LTS40 2.00 2.55 2.27 LTC3 1.28 0.5 0.89 LTC5 2.58 1.24 1.41 LTC6 1.25 0.66 0.95 LTC8 1.00 1.85 1.43 LTC13 1.63 1.20 1.42 Sedimen tambak umur

138 hari

LTC22 0.75 3.00 1.88 INT10 1.00 0.45 0.73 Usus Udang

INT30 0.87 1.41 1.14

B. Tabel penghambatan pada V. harveyi

Indeks penghambatan jenis sampel Kode isolat

ulangan 1 ulangan 2 rataan

LTW4 1.33 1.50 1.42 LTW54 2.33 2.50 2.42 * * * Air Tambak LTW56 LTW64 * * * LTS33 0.60 * 0.30 LTS34 0.66 0.66 0.66 LTS36 1.50 1.80 1.65 LTS37 0.33 0.50 0.42 LTS39 1.33 2.67 2.00 Sedimen Sifon LTS40 1.75 2.75 2.25 LTC3 4.30 * 2.15 LTC5 3.33 1.33 2.33 LTC6 0.50 0.75 0.63 LTC8 1.34 1.78 1.56 LTC13 2.00 1.50 1.75 Sedimen tambak umur

138 hari

LTC22 0.85 1.33 1.09 INT10 0.33 3.00 1.65 Usus Udang

INT30 0.33 0.98 0.65 (*) = zona bening tidak terdeteksi

(26)

Lampiran 4 Hasil pewarnaan Gram dan pengamatan motilitas ke-18 isolat Bacillus sp.

No Isolat Gram Motilitas

1 INT10 Positif motil

2 INT30 Negatif motil

3 LTC3 Positif motil 4 LTC5 Positif motil 5 LTC6 Positif motil 6 LTC8 Positif motil 7 LTC13 Positif motil 8 LTC22 Positif motil 9 LTW4 Positif motil 10 LTW54 Positif motil 11 LTW56 Positif motil 12 LTW64 Positif motil 13 LTS33 Positif motil 14 LTS34 Positif motil 15 LTS36 Positif motil 16 LTS37 Positif nonmotil 17 LTS39 Positif nonmotil 18 LTS40 Positif nonmotil

(27)

17

Lampiran 5 Populasi E. coli pada uji tantang dengan ketiga isolat Bacillus sp.

Persentase penghambatan populasi E. coli oleh isolat LTW54 Jumlah sel E. coli (CFU)

Uji tantang [Y] Jam ke

Kontrol [X] *)

Ulangan 1 Ulangan 2 Rataan

% penghambatan 0 7.9 x 104 7.3 x 104 6.7 x 104 7.0 x 104 11.39 24 9.6 x 105 5.1 x 104 1.5 x 104 3.3 x 104 96.56 48 5.1 x 106 8.3 x 103 7.1 x 103 7.7 x 103 99.84 72 3.9 x 107_1.1_x₁₀3_2.4_x₁₀3_6.9_x₁₀3_99.98 96 5.8 x 107 2.1 x 103 4.7 x 103 3.4 x 103 99.99

Persentase penghambatan populasi E. coli oleh isolat LTS36 Jumlah sel E. coli (CFU)

Kontrol [X] *)

% penghambatan 0 7.9 x 104 4.9 x 104 2.1 x 104 3.5 x 104 55.69 24 9.6 x 105 1.9 x 104 6.7 x 104 4.3 x 105 55.20 48 5.1 x 106 4.6 x 105 8.8 x 105 6.7 x 105 86.86 72 3.9 x 107 2.1 x 105 4.5 x 105 3.3 x 106 91.53 96 5.8 x 107_2.3_x₁₀5_7.1_x₁₀5_4.7_x₁₀6_91.89

Persentase penghambatan populasi E. coli oleh isolat LTS40 Jumlah sel E. coli (CFU)

Kontrol [X] *)

% penghambatan 0 7.9 x 104 1.4 x 104 5.0 x 104 3.2 x 104 59.49 24 9.6 x 105 6.3 x 104 9.3 x 104 7.8 x 104 91.87 48 5.1 x 106 8.8 x 104 1.1 x 104 9.7 x 104 98.09 72 3.9 x 107_5.1_x₁₀5_3.1_x₁₀5_4.1_x₁₀5_98.95 96 5.8 x 107 1.0 x 105 3.2 x 105 6.7 x 105 98.84 Keterangan: % penghambatan = X-Y x 100% X Konsentrasi awal = 106 sel/mL

*) Bukan uji tantang (inokulasi secara terpisah)

(28)

Lampiran 6 Populasi V. harveyi pada uji tantang dengan ketiga isolat Bacillus sp.

Persentase penghambatan populasi V. harveyi oleh isolat LTW54 Jumlah sel V. harveyi (CFU)

Kontrol [X] *)

% penghambatan 0 2.7 x 106 5.5 x 106 1.9 x 106 3.7 x 106 -37.03 24 2.5 x 107 2.7 x 106 7.1 x 106 4.9 x 106 80.4 48 3.7 x 107 3.1 x 105 5.3 x 105 4.2 x 105 98.86 72 2.5 x 108 1.0 x 104 6.1 x 104 8.1 x 104 99.96 96 3.2 x 108_1.8_x₁₀4_5.2_x₁₀4_3.5_x₁₀4_99.98

Persentase penghambatan populasi V. harveyi oleh isolat LTS36 Jumlah sel V. harveyi (CFU)

Kontrol [X] *)

% penghambatan 0 2.7 x 106 7.8 x 106 3.2 x 106 5.5 x 106 -103.7 24 2.5 x 107_1.5_x₁₀6_8.7_x₁₀6_5.1x₁₀6_79.6 48 3.7 x 107 5.2 x 106 4.0 x 106 4.6 x 106 87.56 72 2.5 x 108 1.2 x 105 5.3 x 105 8.3 x 105 99.67 96 3.2 x 108 9.8 x 105 2.8 x 105 6.3 x 105 99.8

Persentase penghambatan populasi V. harveyi oleh isolat LTS40 Jumlah sel V. harveyi (CFU)

Kontrol [X] *)

% penghambatan 0 2.7 x 106 2.2 x 106 7.4 x 106 4.8 x 106 -77.77 24 2.5 x 107 3.6 x 106 5.0 x 106 4.3 x 106 82.8 48 3.7 x 107 1.0 x 105 9.6 x 105 9.9 x 105 97.32 72 2.5 x 108 4.7 x 105 1.2 x 105 8.3 x 105 99.67 96 3.2 x 108 2.4 x 105 1.1 x 105 6.5 x 105 99.79 Keterangan: % penghambatan = X-Y x 100% X Konsentrasi awal = 107 sel/mL