Aktivitas antimikrob Bacillus sp. yang diisolasi dari tambak udang

(1)

AKTIVITAS ANTIMIKROB Bacillus sp.

YANG DIISOLASI DARI TAMBAK UDANG

IKA SUPARNIKA

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(2)

ABSTRAK

IKA SUPARNIKA. Aktivitas Antimikrob Bacillus sp. yang Diisolasi dari Tambak Udang. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan ANJA MERYANDINI.

Dalam usaha penapisan senyawa antimikrob yang dihasilkan oleh isolat Bacillus sp. hasil isolasi dari tambak udang maka dilakukan uji aktivitas dan produksi senyawa aktifnya secara in vitro. Sebanyak enam isolat Bacillus sp. yang berhasil diisolasi dari tambak udang diuji aktivitas penghambatannya terhadap bakteri indikator dengan metode double layer, 5 isolat menunjukkan adanya aktivitas antimikrob terhadap Staphylococcus aureus, 4 isolat diantaranya dapat menghambat Vibrio harveyi dan hanya 2 isolat yang dapat menghambat Escherichia coli. Isolat

Bacillus sp. LTC 8 memiliki indeks penghambatan yang paling baik terhadap semua bakteri indikator dan dibuktikan kembali dengan metode cross-streak dan uji kompetisi dalam kultur campuran. Hasil ini menunjukkan bahwa isolat tersebut memiliki penghambatan yang luas karena dapat menghambat bakteri Gram positif dan Gram negatif. Hasil uji kompetisi dalam kultur campuran menunjukkan isolat tersebut memiliki penghambatan terutama terhadap S. aureus

dengan persen penghambatannya mencapai 100 %. Aktivitas senyawa antimikrob yang dihasilkan oleh isolat Bacillus sp. LTC 8 terhadap S. aureus dihasilkan pada fase eksponensial pertumbuhannya.

ABSTRACT

IKA SUPARNIKA. Antimicrobial Activity of Bacillus sp. Isolated from Shirmp Ponds. Supervised by IMAN RUSMANA and ANJA MERYANDINI.

Screening of antimicrobial substance produced by Bacillus sp. isolated from shirmp ponds was conducted their activity and production analyzed in vitro experiments. Six Bacillus sp. isolates isolated from shirmp ponds was determinated their antimicrobial activity against indicator bacteria using double layer method. The results showed that 5 isolates was able to inhibit Staphylococcus aureus growth, 4 isolates could inhibit Vibrio harveyi growth, and 2 isolates could inhibit against

Escherichia coli growth. Bacillus sp. LTC 8 were the highest inhibition zone against all indicator bacteria and analyzed again with cross-streak method and competition test in mixed culture. The result showed that this isolates have a broad inhibition activity able inhibit Gram positive and Gram negative bacteria. The competition test in mixed culture showed that these isolates could inhibit S. aureus up to 100 %. The antimicrobial substance of Bacillus sp. LTC 8 were S. aureus

(3)

AKTIVITAS ANTIMIKROB Bacillus sp.

YANG DIISOLASI DARI TAMBAK UDANG

IKA SUPARNIKA

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains pada

Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI

(4)

Judul Skripsi : Aktivitas Antimikrob Bacillus sp.yang Diisolasi dari Tambak Udang Nama : Ika Suparnika

NIM : G34103058

Disetujui

Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si. Dr. Anja Meryandini, M.S. NIP 131956713 NIP 131663016

Diketahui

Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor

Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, M.S. NIP 131473999

(5)

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Kuningan pada tanggal 4 Desember 1984 dari ayah H. Nasuha dan Ibu Hj. Sarwiyah. Penulis merupakan anak ke empat dari empat bersaudara.

Pada tahun 2003 penulis lulus dari SMU Negeri 2 Cirebon dan pada tahun yang sama diterima di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA), Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI).

Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum Botani Umum pada tahun ajaran 2004/2005, Taksonomi Tumbuhan Berpembuluh pada tahun ajaran 2005/2006, Fisiologi Tumbuhan pada tahun ajaran 2005/2006, Mikrobiologi Dasar pada semester ganjil dan semester genap tahun ajaran 2006/2007 dan Biologi Dasar pada tahun ajaran 2006/2007. Penulis juga pernah aktif menjadi anggota Wahana Muslim Himabio (WMH) dan Bioworld.

(6)

PRAKATA

Alhamdulillahirobilalamin, segala puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Karya ilmiah dengan judul Aktivitas Antimikrob Bacillus sp. yang Diisolasi dari Tambak Udang ini disusun berdasarkan hasil penelitian dari bulan Februari sampai dengan Juni 2007.

Penulis mengucapakan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu penyusunan karya ilmiah ini, terutama kepada Bapak Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si dan Ibu Dr. Anja

Meryandini, M.S selaku pembimbing yang telah memberikan arahan dan bimbingan. Terima kasih kepada Ibu Dra. Triadiati, M.Si atas saran dan diskusi yang berguna. Terima

kasih kepada Ibu Dr. Nisa Rachmania, M.Si dan seluruh staf laboratorium Mikrobiologi, Mbak Iis, Ibu It, Irni, Ima, Bibah, Ryo, Besty, dan teman - teman penelitian di lab Mikrobiologi yang telah memberikan informasi, arahan dan bantuan selama di laboratorium.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak, Ibu dan nenek tercinta, A Nana, A Jaja, A Onih, serta seluruh keluarga atas segala doa dan kasih sayangnya. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Zahroh, Ifun, Arieza, Nindya, mbak Dwi, keluarga besar Tm16 serta teman-teman Biologi 40 yang selalu memberikan dukungan dan doa.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Oktober 2007

(7)

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR GAMBAR... vii

DAFTAR LAMPIRAN... vii

PENDAHULUAN Latar Belakang... 1

Tujuan... 1

Waktu dan Tempat Penelitian... 1

BAHAN DAN METODE Bahan ... 1

Metode Peremajaan dan Pemurnian isolat... 1

Aktivitas Penghambatan Isolat Bacillus sp. Penghasil Zat Antimikrob... 2

Metode Cross-streak Isolat Bacillus sp. terhadap Bakteri Indikator... 2

Uji Kompetisi terhadap Bakteri Indikator... 2

Waktu Optimum Produksi Zat Antimikrob Isolat Bacillus sp. ... 2

HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Aktivitas Penghambatan Isolat Bacillus sp. Penghasil Zat Antimikrob... 3

Metode Cross-streak Isolat Bacillus sp. terhadap Bakteri Indikator... 4

Uji Kompetisi terhadap Bakteri Indikator ... 4

Waktu Optimum Produksi Zat Antimikrob Isolat Bacillus sp. ... 5

Pembahasan... 6

SIMPULAN... 8

SARAN... 8

DAFTAR PUSTAKA

...

8

(8)

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. dengan menggunakan metode double layer terhadap (a) E. coli dan (b) V. harveyi... 3

2 Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. LTC 8 terhadap bakteri indikator dengan

metode cross-streak... 4

3 Persentase penghambatan isolat Bacillus sp. LTW 4 terhadap bakteri indikator pada

inkubasi (a) 24 jam dan (b) 48 jam... 4

4 Persentase penghambatan isolat Bacillus sp. LTC 8 terhadap bakteri indikator pada

inkubasi (a) 24 jam dan (b) 48 jam... 5

5 Aktivitas antimikrob sel Bacillus sp. LTW 4 terhadap S. aureus... 5

6 Aktivitas antimikrob isolat Bacillus sp. LTC 8 terhadap S. aureus (a) filtrat sel dan (b)

supernatan bebas sel... 6

7 Aktivitas penghambatan supernatan isolat Bacillus sp. LTC 8 terhadap S. aureus

selama pertumbuhan. ... 6

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. LTW 4 terhadap bakteri indikator ... 11

2 Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. LTC 8 terhadap bakteri indikator... 11

3 Aktivitas antimikrob sel Bacillus sp. LTW 4 terhadap S. aureus... 11

(9)

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Budi daya udang merupakan salah satu sektor perikanan di Indonesia yang sangat potensial dalam perekonomian nasional. Djazuli (2002) menyatakan bahwa sektor perikanan berperan penting terutama dalam

penyediaan lapangan kerja, sumber

pendapatan bagi nelayan, sumber protein hewani yang bernilai gizi tinggi serta sumber devisa negara yang sangat potensial. Usaha peningkatan produktivitas budi daya udang di tambak sering mengalami kendala yaitu munculnya berbagai serangan penyakit pada udang. Vibriosis merupakan penyakit udang utama di tambak yang disebabkan oleh bakteri patogen Vibrio. Bakteri berpendar Vibrio harveyi merupakan penyebab utama kematian massal udang di tambak pada tahap larva (Rengpipat et al. 1998; Muliani et al. 2003).

Berbagai usaha penanggulangan penyakit udang telah banyak dilakukan, diantaranya dengan pemberian antibiotik. Penggunaan antibiotik dalam penanganan penyakit udang dapat menyebabkan resistensi pada bakteri,

menimbulkan residu antibiotik dan

pencemaran lingkungan. Oleh karena itu, perlu adanya alternatif biokontrol dalam penanggulangan penyakit udang sehingga didapat produk udang yang bebas bakteri patogen dan residu antibiotik yang sesuai syarat mutu produk pangan.

Probiotik memberikan alternatif sebagai biokontrol pertumbuhan bakteri patogen yang aman bagi lingkungan dan organisme budi daya (Moriarty 1999). Probiotik dalam akuakultur merupakan mikroba hidup yang memberikan pengaruh menguntungkan pada inang, menjamin perbaikan dalam penggunaan pakan, memperbaiki respon inang terhadap penyakit, dan memperbaiki kualitas lingkungan (Verschuere et al. 2000).

Salah satu mikrob probiotik yang banyak diteliti ialah jenis Bacillus. Bacillus

merupakan bakteri Gram positif berbentuk batang, memiliki endospora, bersifat motil dan tergolong ke dalam bakteri aerob atau fakultatif anaerob (Holt et al. 1994). Genus

Bacillus merupakan bakteri yang sangat baik digunakan sebagai kandidat agen biokontrol karena dapat menghasilkan beberapa metabolit aktif seperti antibiotik, proteinase dan bakteriosin (Torkar & Matijasic 2003).

Pada umumnya antimikrob yang

dihasilkan Bacillus berupa polipeptida seperti bakteriosin dan antibiotik. Beberapa antibiotik

Bacillus sp. yang telah diidentifikasi ialah

polymiksin, colistin, tyrotrisin, basitrasin dan gramisidin S (Katz & Demain 1977). Beberapa jenis bakteriosin yang dihasilkan oleh Bacillus ialah subtilin (B. subtilis), megacin (B. megaterium), ericin (B. subtilis), lichernin (B. licherniformis), coagulin (B. coagulans), cerein (B. cereus), dan thuricin (B. thuringiensis) (Lisboa et al. 2006; Torkar & Matijasic 2003). Dalam usaha penapisan suatu senyawa antimikrob yang dihasilkan oleh isolat Bacillus sp. hasil isolasi dari tambak udang maka dilakukan uji aktivitas dan produksi senyawa aktifnya secara in vitro.

Tujuan

Penelitian ini bertujuan mengetahui aktivitas penghambatan zat antimikrob dari beberapa isolat Bacillus sp.yang diisolasi dari tambak udang.

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Februari sampai dengan Juni 2007 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi FMIPA IPB.

BAHAN DAN METODE

Bahan

Bahan yang digunakan ialah isolat

Bacillus sp. LTC 5, LTC 8, LTC 13, LTC 39, LTW 54 dan LTW 4 hasil penelitian sebelumnya yang berhasil diisolasi dari tambak udang. Bakteri indikator yang digunakan untuk menguji aktivitas antimikrob

Bacillus sp. yaitu bakteri Vibrio harveyi, Escherichia coli dan Staphylococcus aureus

koleksi Laboratorium Mikrobiologi,

Departemen Biologi FMIPA IPB.

Media yang digunakan ialah media cair

Sea Water Complete (SWC) 50% dengan komposisi (g/l) air laut 750 ml, akuades 250 ml, bakto pepton 2.5 g, ekstrak khamir 1.5 g, dan gliserol 1.5 ml. Media agar-agar SWC dibuat dengan menambahkan 20 g/l agar-agar dan untuk media SWC semisolid ditambahkan 10 g/l agar-agar.

Metode

Peremajaan dan Pemurnian isolat

Pemurnian dilakukan dengan

(10)

2

Aktivitas Penghambatan Isolat Bacillus sp. Penghasil Zat Antimikrob

Isolat Bacillus sp. diuji aktivitas antimikrobnya terhadap bakteri indikator V. harveyi, E. coli dan S. aureus dengan menggunakan metode double layer (Lisboa et al. 2006). Sebanyak 50 µl bakteri indikator dengan kepadatan sel 108 sel/ml disuspensikan kedalam 50 ml SWC semisolid kemudian sebanyak 10 ml dituang pada permukaan media padat SWC. Setelah permukaan media SWC double layer memadat, isolat Bacillus

sp. yang berumur dua hari ditotolkan dengan menggunakan jarum ose dan diinkubasi pada suhu 30 ºC selama 24 jam. Bakteri yang memiliki kemampuan untuk menghasilkan zat antimikrob ditunjukkan dari adanya zona bening (zona hambat) di sekitar koloni. Diameter koloni dan zona hambatnya diukur

untuk mengetahui nilai indeks

penghambatannya. Isolat Bacillus sp. yang memiliki zona hambat terluas akan digunakan untuk uji selanjutnya.

Metode Cross-streak Isolat Bacillus sp. terhadap Bakteri Indikator

Isolat Bacillus sp. yang memiliki indeks zona hambat terluas diuji kembali terhadap bakteri indikator dengan metode cross-streak

(Chytanya et al. 2002). Satu ose inokulum

Bacillus sp. umur 24 jam dalam media SWC cair digoreskan pada media agar-agar kemudian diinkubasi pada suhu 30 ºC selama 24 jam, selanjutnya bakteri indikator digoreskan tegak lurus terhadap goresan

Bacillus sp. kemudian diinkubasi pada suhu 30 ºC. Zona hambat yang terbentuk berupa garis lurus pada masing-masing tempat bakteri indikator diinokulasikan kemudian diukur pada inkubasi ke 24 dan 48 jam.

Uji Kompetisi terhadap Bakteri Indikator

Penghambatan isolat Bacillus sp. terhadap bakteri indikator dilakukan dengan uji kompetisi dalam kultur campuran media SWC cair. Pada lima erlenmeyer berisi 50 ml

media SWC cair, masing-masing

disuspensikan 100 µl inokulum bakteri indikator umur 24 jam dengan kepadatan sekitar 107_{sel/ml. Pada erlenmeyer II, III, IV,}

dan V masing-masing ditambahkan 100 µl, 200 µl, 400 µl dan 1000 µl inokulum Bacillus

sp. sehingga diperoleh kultur campuran dengan rasio antara bakteri indikator dan

Bacillus sp. ialah 1:1, 1:2, 1:4, dan 1:10 (v:v). Erlenmeyer kultur bakteri indikator (tanpa inokulum Bacillus sp.) sebagai kontrol negatif dan satu erlenmeyer yang disuspensikan 100

µl inokulum Bacillus sp. digunakan sebagai kontrol positif. Pada jam ke 24 dan 48 dihitung jumlah sel Bacillus sp. dan bakteri indikator dengan metode cawan sebar pada media agar-agar SWC lalu dihitung jumlah sel dan persentase penghambatannya. Persen penghambatan dihitung dengan cara:

%Penghambatan = A – B x 100% A

Keterangan :

A = Jumlah sel bakteri indikator pada kontrol B = Jumlah sel bakteri indikator pada

perlakuan

Waktu Optimum Produksi Zat Antimikrob Isolat Bacillus sp.

Sebanyak satu ose biakan isolat bakteri

Bacillus sp. disubkulturkan pada 50 ml media SWC cair lalu diinkubasi selama enam jam pada suhu ruang diatas shaker dengan kecepatan 94 rpm, kemudian 2 ml inokulum diinokulasikan kedalam 200 ml media produksi SWC cair lalu dishaker. Setiap 6 jam dilakukan pengukuran turbiditas sel pada panjang gelombang 600 nm dan dilakukan pengambilan sampel sebanyak 5 ml kultur dan dimasukan kedalam eppendorf. Biakan bakteri dari setiap pengambilan sampel selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 15 menit kemudian dilakukan pemisahan supernatan dari filtrat selnya untuk diuji aktivitas antimikrobnya terhadap bakteri indikator dengan menggunakan metode

double layer.

Pada metode double layer, 50 µl bakteri indikator dengan kepadatan sel 108 sel/ml disuspensikan kedalam 50 ml SWC semisolid lalu sebanyak 10 ml dituang pada permukaan media padat SWC dan didiamkan hingga beku. Uji aktivitas antimikrob dari filtrat sel

Bacillus sp. dilakukan dengan menotolkan filtrat sel secara langsung dengan menggunakan jarum ose pada permukaan

media SWC double layer, kemudian

diinkubasi pada suhu 30 oC selama 24 jam. Aktivitas supernatan bebas sel dilakukan dengan meneteskan supernatan sebanyak 20 µl pada kertas cakram berdiameter 6 mm dan dibiarkan mengering terlebih dahulu kemudian cakram diletakan pada permukaan media SWC double layer. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 30 o_{C selama 24 jam dan}

(11)

2

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil

Isolat murni Bacillus sp. yang berhasil diisolasi dari lingkungan tambak udang memiliki morfologi koloni bulat berwarna krem setelah diinkubasi 2 hari pada media SWC.

Seleksi untuk mengetahui aktivitas penghambatan antimikrob yang dimiliki isolat –isolat Bacillus sp. yang berhasil diisolasi dari tambak udang dilakukan dengan uji kompetisi isolat tersebut terhadap bakteri indikator V. harveyi, E. coli dan S. aureus dengan menggunakan metode double layer. Dari enam isolat yang diuji kompetisi didapatkan 5 isolat yang menunjukkan adanya aktivitas antimikrob terhadap S. aureus, 4 isolat diantaranya dapat menghambat V. harveyi dan hanya 2 isolat yang dapat menghambat E. coli

(Tabel 1). Isolat Bacillus sp. LTW 4 memiliki penghambatan yang paling maksimum yaitu terhadap E. coli denganindeks penghambatan mencapai 1.40, terhadap V. harveyi sebesar 1.11, dan terhadap S. aureus sebesar 0.47, sedangkan isolat Bacillus sp. LTC 8 merupakan isolat yang memiliki indeks penghambatan paling maksimum terhadap S. aureus dan V. harveyi dengan indeks penghambatan mencapai 0.75 dan terhadap E. coli sebesar 0.67. Oleh karena itu, isolat

Bacillus sp. LTW 4 dan LTC 8 merupakan isolat terpilih yang akan dianalisis lebih lanjut untuk dikarakterisasi aktivitas penghambatan senyawa antimikrobnya terhadap bakteri indikator.

(a)

(b)

Gambar 1 Aktivitas penghambatan isolat

Bacillus sp. dengan

menggunakan metode double layer terhadap (a) E. coli dan (b) V. harveyi (1. LTW 4, 2. LTW 54, 3. LTC 39, 4. LTC 13,

5. LTC 8, dan 6. LTC 5).

Tabel 1 Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. terhadap bakteri indikator dengan metode

double layer

Aktivitas penghambatan terhadap

Vibrio harveyi Escherichia coli Staphylococcus aureus

Isolat Ø koloni

(mm)

Ø zona bening

(mm) IP

Ø koloni

(mm)

Ø zona bening

(mm) IP

Ø koloni

(mm)

Ø zona bening

(mm) IP

LTW 4 2.13 4.50 1.11 1.25 3.00 1.40 13.75 20.25 0.47

LTC 8 3.00 5.25 0.75 1.50 2.50 0.67 7.00 12.25 0.75

LTC 13 2.25 3.25 0.44 - - - 12.00 16.50 0.36

LTC 5 2.25 3.63 0.61 - - - 15.25 16.50 0.09

LTW 54 - - - 4.50 6.25 0.39

LTC 39 - - - -

Keterangan : IP = Indeks Penghambatan

(12)

4

Tabel 2 Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. terpilih terhadap bakteri indikator dengan metode cross-streak

Zona hambat (mm)

Inkubasi 24 jam Inkubasi 48 jam

Isolat V. harveyi E. coli S. auerus V. harveyi E. coli S. auerus

LTW 4 6.5 9 11.75 6.5 9 11.75

LTC 8 6 8 20 6 8 20

Metode Cross-streak Isolat Bacillus sp. terhadap Bakteri Indikator

Isolat Bacillus sp. LTW 4 dan LTC 8 sebagai isolat terpilih yang memiliki aktivitas penghambatan paling baik diuji kembali terhadap bakteri indikator dengan metode

cross-streak. Pada metode ini isolat Bacillus

sp. LTW 4 dan LTC 8 dapat menghambat semua bakteri indikator dengan hambatan maksimum terhadap S. aureus. Pada inkubasi 24 jam, isolat Bacillus sp. LTW 4 memiliki zona hambat terhadap S. aureus sebesar 11.75 mm, terhadap E. coli sebesar 9 mm dan terhadap V. harveyi sebesar 6.5 mm. Isolat

Bacillus sp. LTC 8 memiliki zona hambat paling maksimum yaitu terhadap S. aureus

mencapai 20 mm, terhadap E. coli sebesar 8 mm dan terhadap V. harveyi sebesar 6 mm (Tabel 2). Pada inkubasi 48 jam, aktivitas penghambatan kedua isolat tersebut terhadap

bakteri indikator tidak mengalami

peningkatan.

Bacillus sp. LTC 8 terhadap bakteri indikator dengan metode

cross-streak.

Uji Kompetisi terhadap Bakteri Indikator

Aktivitas penghambatan isolat Bacillus

sp. terpilih LTW 4 dan LTC 8 terhadap bakteri indikator dalam kultur campuran menunjukkan bahwa kedua isolat Bacillus sp. tersebut mampu menghambat pertumbuhan semua bakteri indikator dengan daya hambat yang berbeda-beda. Hal ini terlihat dari

jumlah sel bakteri indikator yang dikompetisikan dengan isolat Bacillus sp. lebih rendah dibandingkan kontrol negatif (bakteri indikator tanpa isolat Bacillus sp.). Pada inkubasi 24 jam, isolat Bacillus sp. LTW 4 memiliki daya hambat paling maksimum yaitu terhadap E. coli dengan persen penghambatan mencapai 98.33% (Lampiran 1).

0 20 40 60 80 100

1 : 1 1 : 2 1 : 4 1 : 10 Rasio inokulum

%

P

en

g

h

am

b

at

an

V. harveyi + LTW 4 E.coli + LTW 4 S.aureus + LTW 4

(a)

0 20 40 60 80 100

1 : 1 1 : 2 1 : 4 1 : 10 Rasio inokulum

%

P

en

g

h

am

b

at

an

V. harveyi + LTW 4 E. coli + LTW 4 S. aureus + LTW 4

(b)

Gambar 3 Persentase penghambatan isolat

(13)

Aktivitas penghambatan masing–masing perlakuan mengalami peningkatan pada

inkubasi 48 jam dengan aktivitas

penghambatan maksimum terhadap E. coli

dan S. aureus dengan persen penghambatan mencapai 100%, sedangkan terhadap V. harveyi persen penghambatannya 81.89% (Gambar 3 (b)).

Isolat Bacillus sp. LTC 8 pada inkubasi 24 jam, memiliki persentase penghambatan paling maksimum hingga 100% yaitu terhadap

S. aureus (Gambar 4). Hal ini ditunjukkan dengan tidak adanya koloni S. aureus yang tumbuh pada media, karena pertumbuhannya

dihambat Bacillus sp.. Persentase

penghambatan isolat ini pada inkubasi 48 jam mengalami peningkatan, yaitu terhadap E. coli

mencapai 94.89 % dan memiliki daya hambat terendah terhadap V. harveyi sebesar 56.44% (Lampitan 2). 0 20 40 60 80 100

1 : 1 1 : 2 1 : 4 1 : 10

Rasio inokulum % P en g h am b at an

V. harveyi + LTC 8 E. coli + LTC 8 S. aureus + LTC 8

(a) 0 20 40 60 80 100

1 : 1 1 : 2 1 : 4 1 : 10

V. harveyi + LTC 8 E coli + LTC 8 S. aureus + LTC 8

(b)

Bacillus sp. LTC 8 terhadap bakteri indikator pada inkubasi (a) 24 jam dan (b) 48 jam (data menunjukkan nilai rataan ± SE, n = 2).

Waktu Optimum Produksi Zat Antimikrob Isolat Bacillus sp.

Produksi senyawa antimikrob dan uji aktivitas penghambatan filtrat sel dan supernatan isolat Bacillus sp. LTW 4 dan LTC 8 yang dipanen setiap 6 jam ditunjukkan dengan luasnya zona hambat dengan metode

double layer. Hasil uji aktivitas kedua isolat tersebut menunjukkan aktivitas antimikrobnya hanya terhadap S. aureus (Gambar 5),

sedangkan pada E. coli dan V. harveyi kedua isolat tersebut tidak menunjukkan zona penghambatan. Aktivitas antimikrob isolat

Bacillus sp. LTW 4 hanya dihasilkan oleh selnya sedangkan supernatan bebas selnya tidak menunjukkan zona penghambatan (Lampiran 3).

Hasil pengukuran serapan optik yang diplotkan terhadap selang waktu inkubasi, diperoleh kurva pertumbuhan isolat Bacillus

sp. LTW 4 pada media SWC cair dan juga aktivitas antimikrobnya, seperti yang terlihat pada Gambar 5. Senyawa antimikrob mulai

diproduksi pada fase eksponensial

pertumbuhan yaitu pada waktu inkubasi 24 jam sampai 42 jam dengan aktivitas antimikrob tertinggi ialah pada inkubasi 36 jam dengan zona hambat 16.5 mm. Zona hambatan yang paling luas menunjukkan waktu produksi senyawa antimikrob yang optimum. 0 10 20 30 40 50

6 12 18 24 30 36 42 48

Waktu (jam) L o g C F U / m l 0 4 8 12 16 20 Z o n a h am b at ( m m )

Jumlah sel Zona hambat

Gambar 5 Aktivitas antimikrob sel Bacillus

sp. LTW 4 terhadap S. aureus

(data menunjukkan nilai rataan ± SE, n = 2).

(14)

antimikrob dari supernatan bebas sel isolat

Bacillus sp. LTC 8 mulai diproduksi pada fase eksponensial yaitu pada inkubasi 6 jam sampai inkubasi 24 jam dengan aktivitas optimum ialah pada inkubasi 12 jam dan zona hambat 18.5 mm (Gambar 6 (b)).

0 2 4 6 8 10

6 12 18 24 30 36 42 48

Waktu (jam) L o g C F U / m l 0 4 8 12 16 20 Z o n a h am b at ( m m )

Jumlah sel zona hambat (a) 0 2 4 6 8 10

6 12 18 24 30 36 42 48

Waktu (jam) L o g C F U /m l 0 4 8 12 16 20 Z o n a h am b at ( m m )

Jumlah sel Zona hambat

(b)

Gambar 6 Aktivitas antimikrob isolat Bacillus

sp. LTC 8 terhadap S. aureus (a) filtrat sel dan (b) supernatan bebas sel (data menunjukkan nilai rataan ± SE, n = 2).

Gambar 7 Aktivitas penghambatan supernatan isolat Bacillus sp. LTC 8 terhadap

S. aureus selama pertumbuhan.

Pembahasan

Bacillus sp. merupakan bakteri yang umum ditemukan pada sedimen dan saluran pencernaan udang (Moriarty 1999). Pada penelitian ini menggunakan isolat Bacillus sp. yang berhasil diisolasi dari pencernaan udang, air dan sedimen tambak, sebagai agen penghasil senyawa antimikrob. Penggunaan isolat yang diisolasi dari lingkungan tambak sebagai bakteri kandidat probiotik akan lebih menguntungkan. Isolat tersebut akan lebih mudah beradaptasi, mempertahankan diri, dan berkembang dalam lingkungan perairan (Isnansetyo 2005).

Seleksi untuk mengetahui aktivitas penghambatan zat antimikrob yang dimiliki isolat – isolat Bacillus sp. yang berhasil diisolasi dari tambak udang dilakukan dengan uji kompetisi isolat tersebut secara in vitro

terhadap bakteri indikator V. harveyi, E. coli

dan S. aureus. Bakteri berpendar V. harveyi

merupakan indikator terjadinya serangan penyakit udang vibriosis di tambak udang (Rengpipat et al. 1998). E. coli dan S. aureus

merupakan standar bakteri indikator yang sering digunakan dalam pengujian bakteri penghasil senyawa antimikrob. Selain itu, E. coli merupakan salah satu syarat mutu produk udang yang harus bebas dari cemaran mikroba patogen (BSN 1992). Pada metode double layer, isolat Bacillus sp. diujikan secara bersamaan dengan bakteri indikator dalam dua lapisan media yang memungkinkan senyawa antimikrob yang dihasilkan dapat berdifusi dengan baik pada media semisolid sehingga didapat zona bening yang terlihat jelas.

Isolat Bacillus sp. LTW 4 dan LTC 8 merupakan isolat terpilih yang memiliki penghambatan paling baik terhadap V. harveyi, E. coli dan S. aureus. Aktivitas penghambatan yang baik dari kedua isolat

Bacillus sp. tersebut dalam menghambat semua bakteri indikator juga dibuktikan dengan metode cross-streak. Pada metode ini zona hambat yang dihasilkan tampak lebih jelas karena isolat Bacillus sp. dan bakteri indikator tidak dikompetisikan secara bersama. Isolat Bacillus sp. ditumbuhkan terlebih dahulu sehingga dapat langsung

melakukan penghambatan dengan

mengekskresikan senyawa antimikrobnya ketika diujikan dengan bakteri indikator. Hal ini menunjukkan bahwa kedua isolat Bacillus

(15)

Aktivitas penghambatan pertumbuhan bakteri tidak selalu dapat diamati dengan melihat adanya zona bening pada media padat. Hasil uji kompetisi isolat Bacillus sp. terhadap masing-masing bakteri indikator dalam kultur campuran menunjukkan pertumbuhan jumlah sel bakteri indikator menurun. Penurunan tersebut dapat disebabkan oleh adanya produksi senyawa antimikrob yang dihasilkan oleh isolat Bacillus sp.. Pada inkubasi 48 jam, isolat Bacillus sp. LTW 4 dapat menghambat

E. coli dan S. aureus dengan persen penghambatan mencapai 100 %, dan terhadap

V. harveyi persen penghambatannya sebesar

81.89% (Lampiran 1). Persentase

penghambatan isolat Bacillus sp. LTC 8 terhadap S. aureus mencapai 100%, terhadap

E. coli mencapai 94.89% dan terhadap V. harveyi sebesar 56.44% (Lampiran 2). Menurut Verschuere et al. (2000) penghambatan pertumbuhan tidak selalu

berkaitan dengan produksi senyawa

antimikrob seperti antibiotik, tetapi dapat juga karena adanya senyawa metabolit primer atau adanya perubahan pH.

Penghambatan kedua isolat Bacillus sp. tersebut terhadap bakteri indikator terutama terhadap V. harveyi yang merupakan

penyebab utama penyakit vibriosis

menunjukkan bahwa kedua isolat tersebut dapat diaplikasikan di tambak sebagai mikrob kandidat probiotik. Rengpipat et al. (1998) menggunakan probiotik bakteri Bacillus strain S11 yang diberikan pada larva udang, dapat meningkatkan pertumbuhan dan kelangsungan hidup larva udang windu.

Mekanisme kerja probiotik dapat berupa produksi senyawa inhibitor, kompetisi nutrisi dan sumber energi yang tersedia dan kompetisi tempat pelekatan pada tubuh inang. Probiotik juga sebagai sumber nutrisi makro dan mikro inang dan memberikan kontribusi enzim pencernaan yang dapat meningkatkan respon kekebalan inang. Selain itu, probiotik dapat berinteraksi dengan fitoplankton dan dapat memperbaiki kualitas air (Verschuere et al. 2000). Adapun persyaratan yang harus dimiliki oleh mikrob probiotik antara lain ialah tidak bersifat patogen bagi inang dan konsumennya serta tidak mengganggu keseimbangan ekosistem setempat. Selain itu, mikrob tersebut harus dapat bertahan hidup dan dapat berkembangbiak dalam usus maupun dalam wadah pemeliharaan, serta mudah dipelihara dan diperbanyak (Feliatra et al. 2004).

Aktivitas antimikrob filtrat sel dan supernatan bebas sel Bacillus sp. LTW 4 dan

LTC 8 hanya menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap S. aureus, sedangkan pada E. coli dan V. harveyi kedua isolat

tersebut tidak menunjukkan zona

penghambatan. Aktivitas penghambatan antimikrob kedua isolat Bacillus tersebut hanya menghambat bakteri Gram positif yang menunjukkan bahwa produksi senyawa antimikrob yang diproduksinya hanya menghambat spesifik bakteri Gram positif. Hal ini sama dengan yang dilaporkan Aslim (2002) yang menunjukkan bahwa aktivitas antimikrob dari strain Bacillus memiliki penghambatan paling baik pada bakteri Gram positif dari pada bakteri Gram negatif.

Aktivitas penghambatan terhadap S. aureus yang ditunjukkan isolat Bacillus sp. LTW 8 memiliki perbedaan dengan isolat

Bacillus sp. LTC 4. Isolat Bacillus sp. LTC

4 aktivitas penghambatannya hanya

ditunjukkan dari aktivitas filtrat selnya yang

menunjukkan bahwa antimikrobnya

dihasilkan secara ekstraseluler. Perbedaan tersebut dapat diduga bahwa kedua isolat tersebut menghasilkan jenis senyawa antimikrob yang berbeda. Menurut Sudirman (1997) satu spesies mikroba dapat menghasilkan banyak antimikrob dan banyak mikroba yang berbeda dapat menghasilkan jenis antimikrob yang sama.

Kurva pertumbuhan isolat Bacillus sp. LTW 4 dan LTC 8 menunjukkan senyawa antimikrobnya paling optimum diproduksi pada fase eksponensial pertumbuhan. Berdasarkan ciri tersebut dapat diduga bahwa senyawa antimikrob yang dihasilkan kedua isolat Bacillus sp. tersebut dapat berupa bakteriosin. Hal ini sesuai dengan yang dilaporkan oleh Torkar & Matijasic (2003) bahwa produksi bakteriosin B. thuringiensis

dihasilkan pada fase pertumbuhan

eksponensial. Akan tetapi, untuk memastikan jenis senyawa antimikrob yang dihasilkan oleh isolat Bacillus sp. LTW 4 dan LTC 8 perlu dilakukan uji karakterisasi lebih lanjut.

Bakteriosin merupakan senyawa

(16)

bakteri dapat dilakukan melalui hambatan terhadap pembentukkan dinding sel target, menghambat pembentukkan asam nukleat atau menghambat pembentukkan protein, dan berupa pembentukkan pori-pori pada membaran sel target sehingga permeabilitas membran sel terganggu (Williams et al.

1996).

Mekanisme kerja bakteriosin diketahui bergantung pada konsentrasi bakteriosin, kemampuan ionisasi, suhu, pH, dan fase pertumbuhan sel target (Hurst 1981). Berdasarkan hasil penelitian ini menunjukkan bahwa pada inkubasi 48 jam dengan metode

double layer aktivitas penghambatan isolat

Bacillus sp. LTW 4 dan LTC 8 mengalami penurunan yang ditunjukkan dengan semakin menyempitnya zona hambat. Hal ini karena inkubasi yang dilakukan lebih dari waktu optimum produksi senyawa antimikrob dalam media. Dajani dan Wannamaker (1969) melaporkan inkubasi yang terlalu lama menyebabkan aktivitas bakteriosin menurun,

hal ini kemungkinan disebabkan

diproduksinya inaktivator atau enzim pencernaan dan adanya reabsobsi terhadap senyawa antimikrob yang diproduksi sel. Menurut Jo et al. (1996) jika waktu inkubasi diperpanjang maka aktivitas bakteriosin menurun hal ini karena terbebasnya protease dari sel autolisis, karena bakteriosin merupakan molekul proteaneus sehingga mudah terdegradasi. Aktivitas penghambatan pada metode double layer tersebut berbeda dengan hasil uji kompetisi isolat tersebut dalam kultur campuran yang aktivitasnya mengalami peningkatan pada inkubasi 48 jam. Perbedaan aktivitas tersebut dapat disebabkan oleh adanya perbedaan konsentrasi senyawa antimikrob yang dihasilkan.

Bakteriosin dapat dihasilkan oleh bakteri Gram positif maupun bakteri Gram negatif (Jack et al. 1995). Sebagian besar bakteriosin dihasilkan oleh bakteri Gram positif terutama yang paling banyak diteliti ialah dari genus

Bacillus. Beberapa jenis bakteriosin yang dihasilkan oleh Bacillus yang telah diidentifikasi diantaranya ialah coagulin yang dihasilkan oleh B. coagulans I4 yang diisolasi

dari feses hewan (Hyronimus et al. 1998). Bizani et al. (1995) melaporkan jenis bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri tanah

B. cereus strain 8A yaitu cerein 8A. Selain itu, terdapat jenis bakteriosin yang telah diaplikasikan di industri yaitu bacillocin 490 yang dihasilkan oleh bakteri termofilik B. liceniformis (Martirani et al. 2002).

Aktivitas bakteriosin dinyatakan hanya menghambat spesies spesifik tapi beberapa bakteriosin telah dibuktikan memiliki aktivitas spektrum penghambatan yang luas sehingga dapat diaplikasikan secara luas di industri (Jack et al. 1995). Beberapa bakteriosin telah digunakan sebagai pengawet makanan dan terapeutik. Salah satu bakteriosin yang telah dikembangakan sebagai pengawet makanan ialah nisin yang telah dinyatakan tergolong

dalam kelompok GRAS (Generally

Recogenized As Safe) oleh FAO dan WHO (Joerger 2003).

Isolat Bacillus sp. LTC 8 terbukti memiliki penghambatan yang luas. Hal ini

berdasarkan hasil uji aktivitas

penghambatannya terhadap bakteri indikator

V. harveyi, E. coli dan S. aureus, dengan menggunakan metode cross-streak, uji kompetisi dalam kultur campuran dan metode

double layer. Oleh karena itu, isolat Bacillus

sp. LTC 8 berpotensi untuk diaplikasikan di industri.

SIMPULAN

Dari 6 isolat Bacillus sp. hasil isolasi dari tambak udang yang memiliki aktivitas antimikrob yang paling baik ialah isolat

Bacillus sp. LTC 8. Berdasarkan hasil uji aktivitas dengan metode double layer, metode

cross-streak dan uji kompetisi, isolat tersebut dapat menghambat V. harveyi, E. coli dan S. aureus dan memiliki penghambatan paling baik terhadap S. aureus. Aktivitas senyawa antimikrob isolat Bacillus sp. LTW 4 dan LTC 8 dihasilkan pada fase eksponensial pertumbuhannya.

SARAN

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk melakukan karakterisasi antimikrob terhadap pH dan suhu optimum, pemurnian dan penentuan bobot molekul zat antimikrob dari isolat Bacillus sp. LTC 8, sehingga dapat diketahui jenis senyawa antimikrobnya.

DAFTAR PUSTAKA

Aslim B, Saglam N, Beyatli Y. 2002. Determination of some properties of

Bacillus isolated from soil. Turk J Biol

(17)

Bizani D, Motta AS, Morrissy JA, Terra RM,

Souto AA, Brandelli A. 1995.

Antibacterial activity of cerein 8A, a bacteriocin-like peptide produced by

Bacillus cereus. Microbiol Rev 59 (2): 171-200.

[BSN] Badan Standarisasi Nasional. 1992.

Standar nasional Indonesia produk perikanan: SNI 01-2728-1992 udang segar. Jakarta: BSN.

Chytanya R, Karunasagar I, Karunasagar I. 2002. Inhibition of shirmp phatogenic vibrios by a marine Pseudomonas I-2 strain. Aquaculture 208: 1-10.

Dajani AS, Wannamaker LW. 1969.

Demonstration of bactericidal substance against beta-hemolytic streptococci in supernatant fluids of stapylococcal cultures. J Bacteriol 97: 985-991.

Djazuli N. 2002. Penanganan dan pengolahan produk perikanan budidaya dalam mengahadapi pasar global: peluang dan tantangan. Bogor: Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan IPB.

Feliatra, Efendi I, Suryadi E. 2004. Isolasi dan identifikasi bakteri probiotik dari ikan kerapu macan (Ephinephelus fuscogatus) dalam upaya efisiensi pakan ikan. J Natur Indones 6 (2): 75-80.

Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, Staley JT, Williams ST. 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Ed ke-9. Philadelphia: Lipponicott Williams & Wilkins.

Hurst A. 1981. Nisin advances. J Appl Microbiol 27: 85-123.

Hyronimus B, Marrec CL, Urdaci MC. 1998. Coagulin, a bacteriocin-like inhibitory substance produce by Bacillus coagulans

I4. J Appl Microbiol 85: 42-50.

Isnansetyo A. 2005. Bakteri antagonis sebagai probiotik untuk pengendalian hayati pada aquakultur. J Perikan 7 (1): 1-10.

Jack RW, Tagg JR, Ray B. 1995. Bacteriocins of Gram-positive bacteria. Bacteriol Rev

59: 171-200.

Jo YB, Kyung MB, Sung-Koo K, Hong-ki J. 1996. Evaluation at optimum conditions for bacteriocin production from

Lactobacillus sp. JB-42 isolated from kimichi. J Microbiol Biotechnol 6: 63-67.

Joerger RD. 2003. Alternative to antibiotics: bacteriocins, antimicrobial peptides and bacteriophages. Poultry Sci 85: 640-675. Katz E, Demain AL. 1977. Peptide antibiotics

of Bacillus: chemistry, biogenesis and

possible function. Bacteriol Rev 41: 449-474.

Klaenhammer TR.1993. Bacteriocins of lactic acid bacteria. FEMS Microbiol Rev 12: 39-86.

Lisboa MP, Bonatto D, Bizani D, Henriques JAP, Brandelli A. 2006. Characterization of a baktriosin-like substance produced by Bacillus amyloliquefaciens islolated from the Brazillian atlantic forest. Intern Micobiol 9: 111-118.

Martirani L, Varcamonti M, Naclerio G, Felice M de. 2002. Purification and partial characterization of bacillocin 490, a novel bacteriocin produced by a thermophilic strain of Bacillus licheniformis. Microbiol Cell Factories 1: 1-5.

Moriarty DJW. 1999. Disesase control in shrimp aquaculture with probiotic bacteria. Di dalam: Bell CR, Brylinsky M, Johnson GP, editor. Microbial Biosystem: New Frontiers. Proceeding of the 8 th International Symposium on Microbial Ecology. Canada.

Muliani, Suwanto A, Hala Y. 2003. Isolasi dan karakterisasi bakteri asal laut Sulawesi untuk biokontrol penyakit vibriosis pada larva udang windu (Penaeus monodon Fab.). Hayati 10 (1): 6-11.

Rengpiapat S, Phianphak W, Piyatira titivorakul S, Menaveta P. 1998. Effects of a probiotic bacterium on black tiger shirmp Penaeus monodon survival and growth. Aquaculture 167: 301-313. Sudirman LI. 1997. Potensi keragaman hayati

mikroorganisme dalam menghasilkan senyawa antimikroba. Kumpulan Abstrak Konas 7 Perhimpunan Mikrobiologi Indonesia; Denpasar, 8-10 Desember 1997.

Torkar KG, Matijasic BB. 2003. Partial characterisation of bacteriocins produced by Bacillus cereus isolat from milk and milk products. Food Technol 41 (2): 121-129.

Verschuere L, Geert R, Patrick S,Willy V. 2000. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture [ulas balik].

J Microbiol and Mol Biol 64 (4): 655-671.

(18)

(19)

Lampiran 1 Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. LTW 4 terhadap bakteri indikator (data menunjukkan rataan ± SE)

% Penghambatan

Rasio

inokulum V. harveyi E. coli S. aureus V. harveyi E. coli S. aureus

1:1 20.74 ± 0.12 94.39 ± 0.09 57.56 ± 0.06 24.18 ± 1.98 99.72 ± 0.28 98.80 ± 0.16

1:2 38.43 ± 1.86 94.70 ± 1.32 66.56 ± 0.93 60.59 ± 0.46 99.74 ± 0.26 99.12 ± 0.09

1:4 40.63 ± 1.83 95.59 ± 1.29 68.11 ± 0.91 73.39 ± 0.45 99.83 ± 0.17 99.20 ± 0.09

1:10 64.85 ± 0.82 98.33 ± 0.58 81.59 ± 0.41 81.89 ± 1.83 100 ± 0 100 ± 0

Lampiran 2 Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. LTC 8 terhadap bakteri indikator (data menunjukkan rataan ± SE)

% Penghambatan

Rasio

inokulum V. harveyi E. coli S. aureus V. harveyi E. coli S. aureus

1:1 12.51 ± 1.24 71.92 ± 0.02 100 ± 0 17.57 ± 0.21 90.20 ± 0.26 100 ± 0

1:2 21.27 ± 1.27 80.73 ± 1.78 100 ± 0 21.78 ± 0.67 92.30 ± 1.56 100 ± 0

1:4 25.88 ± 0.88 87.86 ± 0.14 100 ± 0 36.15 ± 0.59 92.76 ± 1.09 100 ± 0

1:10 51.68 ± 0.43 88.59 ± 0.02 100 ± 0 56.44 ± 1.34 94.89 ± 1.76 100 ± 0

Lampiran 3 Aktivitas antimikrob sel Bacillus sp. LTW 4 terhadap S. aureus (data menunjukkan rataan ± SE)

Jam ke- Jumlah sel (106) Zona hambat (mm)

6 0.47 0 ± 0

12 6.67 0 ± 0

18 16.02 0 ± 0

24 17.27 0 ± 0

30 21.09 2.5 ± 0.75

36 33.81 16.5 ± 1.75

42 39.16 15 ± 0

48 39.16 0.5 ± 0.25

Lampiran 4 Aktivitas antimikrob sel dan supernatan Bacillus sp. LTW 4 terhadap S. aureus (data menunjukkan rataan ± SE)

Zona hambat (mm)

Jam ke- Jumlah sel (106) Sel Supernatan

6 1.33 3 ± 0 18 ± 1

12 1.7 11.5 ± 0.5 18.5 ± 1.5

18 2.61 15.25 ± 1.25 16 ± 2

24 3.37 12.5 ± 1.5 0.75 ± 0.75

30 3.47 7.5 ± 1.5 1 ± 0

36 5.14 5 ± 0 0 ± 0

42 6.08 1 ± 1 0 ± 0

(20)