KARAKTERISASI FISIOLOGI DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER ISOLAT-ISOLAT Bacillus sp. PENGHASIL BAKTERIOSIN
ASAL TAMBAK UDANG
ANETA PRILIANI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
ABSTRAK
ANETA PRILIANI. Karakterisasi Fisiologi dan Identifikasi Molekuler Isolat-isolat Bacillus sp.
Penghasil Bakteriosin Asal Tambak Udang. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan NISA RACHMANIA MUBARIK.
Vibriosis merupakan kendala utama dalam pengembangan budidaya tambak udang.
Penggunaan probiotik dari genus Bacillus sebagai agen biokontrol dapat dijadikan cara penanggulangan penyakit vibriosis. Isolat-isolat Bacillus sp. indigenus yang diisolasi dari tambak udang seperti isolat LTC8, LTC13, LTW4, LTW54, LTS36, dan LTS40 diketahui dapat menghambat pertumbuhan Vibrio harveyi, Escherichia coli, dan Staphylococcus aureus. Dalam penelitian ini dilakukan verifikasi daya hambat, uji fisiologi secara manual maupun menggunakan MicrogenTM GN-ID A+B Panel dan analisis sekuen gen 16S rRNA dari keenam isolat tersebut.
Isolat LTS40, LTW54, dan LTC13 memiliki indeks penghambatan (IP) terbesar terhadap V.
harveyi. IP terbesar terhadap E. coli dan S. aureus ditunjukkan oleh isolat LTW54 dan LTC13.
Keenam isolat Bacillus menunjukkan hasil positif terhadap uji nitrat, Voges Proskauer (VP), pati, glukosa (kecuali LTS40), sukrosa (kecuali LTC13), O-nitrophenyl-β-D-galaktopiranosa (ONPG) (kecuali LTW4), dan gelatin (kecuali LTW54). Analisis 16S rRNA menunjukkan isolat LTW4, LTC13, LTS40, dan LTW54 memiliki kemiripan 98-99% dengan Bacillus subtilis sedangkan isolat LTS36 dan LTC8 memiliki kemiripan 98-99% dengan Bacillus sp. Pohon filogenetik menunjukkan keenam isolat berada dalam satu kelompok dan berkerabat dengan B. subtilis galur 168.
ABSTRACT
ANETA PRILIANI. Physiological Characterization and Molecular Identification of Bacteriocin Producer Bacillus sp. Isolates from Shrimp Ponds. Supervised by IMAN RUSMANA and NISA RACHMANIA MUBARIK.
Vibriosis is the main problem in development of shrimp ponds. The use of probiotic from Bacillus as a biocontrol agent can be proposed to treat vibriosis. Indigenous Bacillus sp. isolates that have been isolated from shrimp ponds which are LTC8, LTC13, LTW4, LTW54, LTS36, and LTS40 were able to inhibit the growth of Vibrio harveyi, Escherichia coli, and Staphylococcus aureus. Verification of inhibition rate, physiologycal test manually and use MicrogenTM GN-ID A+B Panel, and 16S rRNA genesequence analyzed in this research. LTS40, LTW54, and LTC13 had the biggest inhibition index against V. harveyi. LTW54 and LTC13 had the biggest inhibition index against E. coli and S. aureus. Six Bacillus isolates showed a positive reaction for nitrates, Voges Proskauer (VP), starch, glucose, (except LTS40), sucrose (except LTC13), O-nitrophenyl- β-D-galactopyranoside (ONPG) (except LTW4), and gelatine (except LTW54). LTW4, LTC13, LTS40, and LTW54 16S rRNA sequence showed that had 98-99% similarity with Bacillus subtilis, while LTS36 and LTC8 had 98-99% similarity with Bacillus sp. Phylogenetic tree showed that six isolates were placed in the same group and had a relation with B. subtilis strain 168.
KARAKTERISASI FISIOLOGI DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER ISOLAT-ISOLAT Bacillus sp. PENGHASIL BAKTERIOSIN
ASAL TAMBAK UDANG
ANETA PRILIANI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
Judul Skripsi : Karakterisasi Fisiologi dan Identifikasi Molekuler Isolat-isolat Bacillus sp. Penghasil Bakteriosin Asal Tambak Udang
Nama : Aneta Priliani NIM : G34104049
Menyetujui :
Pembimbing I, Pembimbing II,
Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si. Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si.
NIP 131956713 NIP 132045531
Mengetahui :
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor
Dr. Drh. Hasim, DEA NIP 131578806
Tanggal Lulus :
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Penyayang atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Februari hingga Juni 2008 ini ialah Karakterisasi Fisiologi dan Identifikasi Molekuler Isolat-isolat Bacillus sp. Penghasil Bakteriosin Asal Tambak Udang.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Iman Rumana, M.Si. dan Ibu Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si. selaku dosen pembimbing yang telah memberi bimbingan, kritik, dan saran selama penelitian dan penulisan laporan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih disampaikan pula kepada Prof. Dr. Ir. Alex Hartana yang telah memberi saran dan masukan.
Di samping itu, penulis sampaikan terima kasih dan syukur kepada Kak Ria, Kak Irul, Mba Ary, Mba Rika, Kak Tri, Deny, Pina, dan teman-teman Biologi angkatan 41 khususnya yang melakukan penelitian di laboratorium Mikrobiologi, yang telah membantu selama pengumpulan data. Serta pihak-pihak yang secara tidak langsung telah membantu dalam pengumpulan data karya ilmiah ini. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, kak Eka, Aditya, dan seluruh keluarga atas segala doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Oktober 2008
Aneta Priliani
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 8 April 1986 dari ayah Gelora Sembiring dan ibu Rosmawati Sebayang. Penulis merupakan anak kedua dari tiga bersaudara.
Tahun 2004 penulis lulus dari SMA Negeri 38 Jakarta dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis memilih Program Studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten mata kuliah Biologi Tingkat Persiapan Bersama pada tahun ajaran 2006/2007 hingga 2008/2009, mata kuliah Fisiologi Prokariot pada tahun ajaran 2007/2008, mata kuliah Fisiologi Tumbuhan pada tahun ajaran 2007/2008, mata kuliah Genetika Molekuler pada tahun ajaran 2007/2008, dan mata kuliah Genetika Dasar pada tahun ajaran 2008/2009. Pada tahun ajaran 2006/2007 penulis mendapatkan beasiswa prestasi Yayasan Toyota dan Astra.
Pada saat mengikuti perkuliahan, penulis melakukan studi lapang di Kawasan wana Wisata Cangkuang Sukabumi, dengan judul makalah “Biodiversitas Bakteri pada Cairan Kantung Semar (Nephenthes spp.) Asal Wana Wisata Cangkuang Sukabumi Jawa Barat”. Penulis juga melakukan praktik lapangan di PT. Prodia Widyahusada pada bulan Juli hingga Agustus 2007, dengan judul makalah “Diagnosa Penyakit Nefritis dengan Menggunakan Uji Urin Rutin di Laboratorium klinik Prodia”.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ... vi
DAFTAR GAMBAR ... vi
DAFTAR LAMPIRAN ... vi
PENDAHULUAN Latar Belakang... 1
Tujuan Penelitian... 1
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat ... 2
Bahan dan Alat ... 2
Metode Penelitian... 2
Pemurnian dan Peremajaan Isolat ... 2
Verifikasi Daya Hambat Isolat Bacillus sp. terhadap Bakteri Indikator ... 2
Uji Morfologi dan Fisiologi Isolat ... 2
Isolasi, Amplifikasi, dan Visualisasi DNA Genom ... 2
Sekuensing DNA ... 2
Analisis Filogenetik... 2
HASIL Verifikasi Daya Hambat Isolat Bacillus sp. terhadap Bakteri Indikator... 2
Uji Morfologi dan Fisiologi Isolat ... 3
Isolasi, Amplifikasi, dan Visualisasi DNA Genom... 3
Sekuensing DNA ... 3
Analisis Filogenetik... 5
PEMBAHASAN ... 5
SIMPULAN... 7
DAFTAR PUSTAKA ... 7
LAMPIRAN ... 9
DAFTAR TABEL
Halaman 1 Indeks penghambatan isolat Bacillus sp. penghasil antimikrob terhadap bakteri indikator dengan metode cawan sebar ... 4 2 Ciri-ciri fisiologi isolat-isolat Bacillus sp. ... ... 4 3 Hasil analisis sekuen gen 16S rRNA dengan menggunakan program BLAST-N ... 4
DAFTAR GAMBAR
Halaman 1 Hasil elektroforesis dari amplifikasi gen 16S rRNA menunjukkan pita DNA berukuran
~1.3 kb ... 3 2 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen gen 16S rRNA dari isolat-isolat Bacillus sp. yang dibandingkan dengan sekuen gen 16S rRNA dari beberapa spesies Bacillus lainnya ... 5
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman 1 Karakteristik morfologi sel, pewarnaan Gram, dan endospora isolat-isolat Bacillus sp. ... 10 2 Hasil pewarnaan Gram dan endospora isolat-isolat Bacillus sp. ... 11 3 Hasil sekuen gen 16S rRNA dan BLAST-N isolat-isolat Bacillus sp. ... 13
1
PENDAHULUAN
Latar BelakangIndonesia merupakan negara bahari dan kepulauan terbesar di dunia dengan luas perairan laut sekitar 5.8 juta kilometer persegi atau 75% dari total wilayah Indonesia.
Sedikitnya terdapat sepuluh sektor ekonomi kelautan yang dapat memajukan dan memakmurkan Indonesia, salah satunya ialah sektor budidaya perikanan. Sektor budidaya perikanan memiliki potensi produksi sumber daya perikanan sekitar 57.7 juta ton per tahun dan baru diproduksi 1,6 juta ton per tahun (0,3%) sehingga butuh pengembangan, termasuk budidaya tambak udang (Dahuri 2003).
Timbulnya penyakit menjadi kendala utama dalam pengembangan budidaya tambak udang. Keberadaan produk hasil metabolisme, hasil buangan, residu pakan, dan residu bahan terapeutik pada budidaya tambak udang menyebabkan menurunnya kualitas air dan timbulnya penyakit (Antony & Philip 2006).
Vibriosis adalah penyakit yang menyerang kelompok Crustacea terutama udang dan dapat menyebabkan kematian pada udang (Lavilla-Pitogo et al. 1998). Vibriosis disebabkan oleh beberapa bakteri dari genus Vibrio, yaitu V. harveyi, V. vulnificus, V.
parahaemolyticus, V. alginolyticus, V.
penaeicida, dan Vibrio sp. (Brock & Lightner 1990).
Vibrio harveyi adalah penyebab utama penyakit pada industri budidaya udang (Moriarty 1999). Bakteri ini menyerang udang mulai dari stadia larva, pascalarva, juvenil, hingga dewasa (Vandenberghe et al. 1999).
Vibrio harveyi bersifat Gram negatif, anaerobik fakultatif, patogen terhadap hewan, dan dominan pada lingkungan laut (Farmer &
Hickman-Brenner 1992).
Beberapa penelitian telah dilakukan untuk mendapatkan metode pencegahan dan penanggulangan penyakit pada udang, antara lain pengunaan antimikrob (Mohney &
Lightner 1990), pemberian klorin pada air kolam (Moriarty 1999), pemberian imunostimulan (Sakai 1999), dan melakukan bioremidiasi (Moriarty 1999).
Probiotik dapat digunakan sebagai biokontrol pertumbuhan bakteri patogen yang aman bagi lingkungan dan organisme yang dibudidayakan (Moriarty 1999). Probiotik adalah mikrob hidup yang ditambahkan dan memberikan efek yang menguntungkan bagi
inangnya dengan memperbaiki komunitas mikrob yang ada di sekitar inang. Selain itu probiotik juga berperan dalam menghambat pertumbuhan bakteri patogen dengan mengeluarkan senyawa inhibitor, memperbaiki kualitas air, merangsang respon imun inang, dan menjamin perbaikan dalam penggunaan pakan dengan memproduksi enzim pencernaan tambahan (Verschuere et al. 2000).
Beberapa genus bakteri dapat digunakan sebagai agen biokontrol pada tambak udang antara lain genus Vibrio, Pseudomonas, Bacillus (Moriarty 1999), dan Pseudoalteromonas (Muliani et al. 2003).
Genus Bacillus dapat digunakan sebagai agen biokontrol secara luas karena biasa ditemukan pada sedimen laut dan secara alami terdapat pada pencernaan hewan termasuk udang (Moriarty 1999) dan menghasilkan zat antimikrob berupa bakteriosin (Torkar &
Matijasic 2003). Bakteriosin adalah zat antimikrob polipeptida atau protein yang diproduksi oleh mikroorganisme yang bersifat bakterisida. Bakteriosin membunuh sel targetnya dengan menyisip pada membran target dan mengakibatkan fungsi membran sel menjadi tidak stabil sehingga menyebabkan lisis sel (Atlas & Bartha 1998).
Beberapa isolat Bacillus sp. indigenus yang diisolasi dari tambak udang seperti isolat LTC8, LTC13, LTW4, LTW54, LTS36, dan LTS40 diketahui dapat menghambat pertumbuhan V. harveyi, Escherichia coli, dan Staphylococcus aureus (Suparnika 2007). Dan antimikrob yang dihasilkan oleh isolat LTS40 tergolong bakteriosin (Isramilda 2007). Akan tetapi ciri fisiologi dan ciri molekuler dari isolat-isolat tersebut belum diketahui.
Identifikasi isolat-isolat Bacillus sp.
tersebut secara morfologi, fisiologi, dan molekuler penting untuk dilakukan untuk mengetahui spesies dan kemampuan fisiologi dari isolat-isolat Bacillus sp. tersebut.
Informasi spesies dan kemampuan fisiologi yang telah teridentifikasi merupakan dasar untuk penelitian lebih lanjut mengenai potensi-potensinya, analisis genom, hingga rekayasa genetika untuk meningkatkan kemampuan dan pemanfaatannya sebagai biokontrol pada budidaya perikanan.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mencari ciri-ciri fisiologi dan ciri-ciri molekul isolat- isolat Bacillus sp. asal tambak udang yang memiliki potensi menghasilkan zat antimikrob.
2
BAHAN DAN METODE
Waktu dan TempatPenelitian ini dilaksanakan mulai bulan Februari 2008 sampai dengan bulan Juni 2008 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA, IPB.
Bahan dan Alat
Isolat-isolat Bacillus sp. yang digunakan ialah isolat LTC8, LTC13, LTW54, LTW4, LTS36, dan LTS40 hasil penelitian sebelumnya yang berhasil diisolasi dari tambak udang di Lampung Tengah (Lestari 2008). Bakteri indikator yang digunakan untuk menguji aktivitas antimikrob Bacillus sp. ialah V. harveyi, E. coli, dan S. aureus koleksi Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, FMIPA, IPB.
Metode Penelitian
Pemurnian dan Peremajaan Isolat
Isolat dimurnikan dan diremajakan pada media NA yang ditambahkan dengan NaCl 2% melalui metode kuadran dan diinkubasi pada suhu ruang selama dua hari. Koloni murni yang diperoleh ditumbuhkan kembali pada media agar-agar miring NA dengan NaCl 2%.
Verifikasi Daya Hambat Isolat Bacillus sp.
terhadap Bakteri Indikator
Verifikasi daya hambat isolat Bacillus sp.
dilakukan dengan mengamati zona bening yang terbentuk menggunakan metode cawan sebar. Zona bening yang terbentuk diukur pada tiga posisi lalu dirata-ratakan. Bakteri indikator yang digunakan ialah V. harveyi, E.
coli, dan S. aureus (Suparnika 2007).
Besarnya indeks penghambatan (IP) dihitung dengan rumus:
Uji Morfologi dan Fisiologi Isolat
Isolat-isolat Bacillus sp. yang telah murni dan berumur kurang dari 24 jam dan ± 72 jam secara berurutan diamati bentuk dan morfologinya melalui pewarnaan Gram dan spora (Hadioetomo 1993). Selanjutnya dilakukan karakterisasi fisiologi dan biokimia dengan menggunakan MicrogenTM GN-ID A+B Panel dan uji pati secara manual.
Isolasi, Amplifikasi, dan Visualisasi DNA Genom
Isolasi DNA genom dilakukan dengan metode Lazo (Lazo et al. 1987). DNA genom hasil isolasi digunakan untuk amplifikasi gen 16S rRNA. Amplifikasi gen 16S rRNA dilakukan dengan mesin Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan kit Ready To Go PCR Beads (Pharmacia-Biothec) dan primer spesifik 16S rRNA untuk prokariot, yaitu 63f (5’- CAGGCCTAACACATGCAAGTC) dan 1387r (5’-GGGCGGWGTGTACAAGGC) (Marchesi et al. 1998).
Kondisi PCR yang digunakan meliputi pradenaturasi (94oC, 2 menit), denaturasi (92oC, 30 detik), Annealing primer (55oC, 30 detik), Elongation atau perpanjangan primer (75oC, 1 menit), dan pascaPCR (75oC, 5 menit), dengan jumlah siklus sebanyak 30 kali.
Pemisahan DNA produk PCR dilakukan pada Elektroforesis mini-gel dengan menggunakan agarose 1% pada tegangan listrik 70-75 volt selama 45 menit. Ethidium Bromida (EtBr) digunakan untuk mewarnai DNA dan diamati di atas UV Transluminator.
Sekuensing DNA
DNA hasil amplifikasi lalu disekuen di First Base Laboratories Sdn Bhd, Syah Alam, Selangor, Malaysia untuk mengetahui urutan basa DNA-nya. Hasil sekuen kemudian dijajarkan dengan data GenBank menggunakan program Blast-N dari situs NCBI (National Center for Biotechnology Information) melalui http://www.ncbi.nlm.nih.gov. untuk mengetahui kemiripan spesies dari isolat yang diuji.
Analisis Filogenetik
Konstruksi pohon filogenetik dilakukan dengan menggunakan program MEGA 4.0 (Tamura et al. 2007), metode Neighbor Joining (NJ) dengan bootstrap 1000x.
HASIL
Verifikasi Daya Hambat Isolat Bacillus sp.
terhadap Bakteri Indikator
Enam isolat Bacillus sp. penghasil antimikrob dari penelitian sebelumnya di verifikasi daya hambatnya terhadap V.
harveyi, E. coli, dan S. aureus dengan menggunakan metode cawan sebar. Tahap ini dilakukan untuk mengetahui bahwa isolat yang digunakan ialah isolat Bacillus sp. yang menghasilkan antimikrob. Keenam isolat (mm)
koloni diameter
(mm) koloni diameter - (mm) zona diameter IP=
3
Bacillus sp. yang diuji masih menunjukkan aktivitas penghambatan dengan membentuk zona bening terhadap ketiga bakteri indikator.
Besarnya daya hambat Bacillus sp.
LTW54, LTW4, LTS36, LTC13, LTC8, dan LTS40 terhadap ketiga bakteri indikator ditunjukkan pada Tabel 1. Kisaran IP isolat Bacillus sp. yang diuji pada V. harveyi, E.
coli, dan S. aureus secara berurutan pada kisaran 0.46-1.88, 0.37-2.30, dan 2.50-3.86.
Isolat LTS 40 memiliki IP terbesar terhadap V.
harveyi yaitu 1.88, isolat LTW54 memiliki IP terbesar terhadap E. coli yaitu 2.30, sedangkan IP terbesar terhadap S. aureus ditunjukkan oleh isolat LTC13 sebesar 3.86. Isolat LTS40, LTW54, dan LTC13 juga memiliki IP tiga terbesar terhadap V. harveyi yaitu 1.88, 1.00, dan 1.30.
Uji Morfologi dan Fisiologi Isolat
Semua isolat Bacillus sp. bersifat Gram positif, berbentuk batang pendek hingga batang sedang dengan penataan tunggal, dan membentuk endospora (Lampiran 1 dan 2).
Endospora yang dimiliki isolat-isolat Bacillus sp. berbentuk bulat dengan posisi terminal kecuali isolat LTC8 dengan posisi endospora di sentral.
Uji fisiologi dilakukan dengan menggunakan MicrogenTM GN-ID A+B Panel dan uji pati secara manual, setelah diinkubasi selama semalam maka didapatkan hasil seperti pada Tabel 2. Keenam isolat Bacillus sp. yang diuji menunjukkan hasil positif terhadap uji nitrat, Voges Proskauer (VP), pati, glukosa (kecuali LTS40), sukrosa (kecuali LTC13), O- nitrophenyl-β-D-galaktopiranosa (ONPG) (kecuali LTW4), dan gelatin (kecuali LTW54). Sedangkan uji-uji fisiologi seperti ornitin, H2S, xilosa, indol, urease, sitrat, Triptopan deaminase (TDA), malonat, ramnosa, laktosa, dan rafinosa menunjukkan hasil negatif untuk semua isolat.
Isolasi, Amplifikasi, dan Visualisasi DNA Genom
Isolasi DNA genom isolat-isolat Bacillus sp. dengan menggunakan metode Lazo dapat dilakukan dengan baik, yang dibuktikan dengan terbentuknya satu pita untuk tiap DNA genom isolat-isolat Bacillus sp. setelah dielektroforesis dan diamati di atas UV transluminator.
Amplifikasi gen 16S rRNA dari keenam isolat Bacillus sp. dengan menggunakan primer universal 63f dan 1387r yang spesifik untuk prokariot dapat dilakukan. Hasil amplifikasi pada gel elekroforesis yang diamati di atas UV transluminator memperlihatkan adanya pita DNA penyandi gen 16S rRNA dengan ukuran ~1.3 kb setelah dibandingkan dengan DNA marker (1 kb DNA ladder) (Gambar 1).
M: marker 1 kb DNA ladder
Sumur 1: LTC13 Sumur 4: LTW54 Sumur 2: LTS36 Sumur 5: LTS40 Sumur 3: LTS4 Sumur 6: LTC8
Gambar 1 Hasil elektroforesis dari amplifikasi gen 16S rRNA menunjukkan pita DNA berukuran ~1.3 kb.
Sekuensing DNA
Hasil amplifikasi gen 16S rRNA kemudian disekuen untuk mengetahui urutan nukleotidanya. Hasil sekuen gen 16S rRNA tiap isolat kemudian dianalisis similaritasnya dengan data di GenBank menggunakan program BLAST-N (Basic Local Alignment Search Tool-Nucleotida) (Lampiran 3).
Berdasarkan analisis program BLAST-N diketahui homologi spesies dari isolat yang diuji.
Empat isolat yaitu LTW4, LTC13, LTS40, dan LTW54 memiliki kemiripan 98- 99% dengan Bacillus subtilis sedangkan dua isolat lainnya yaitu LTS36 dan LTC8 memiliki kemiripan 98-99% dengan Bacillus sp. (Tabel 3). Hasil sekuen keenam isolat tersebut termasuk ke dalam kingdom:
Bacteria, filum: Firmicutes, kelas: Bacilli, ordo: Bacillales, dan famili: Bacillaceae.
2.0 kb 1 2 3 4 5 6 M
4.0 kb 10.0 kb
3.0 kb
1.5 kb 6.0 kb
4
Tabel 1 Indeks penghambatan isolat Bacillus sp. penghasil antimikrob terhadap bakteri indikator dengan metode cawan sebar
Keterangan: Ø = Diameter
IP = Indeks Penghambatan
Tabel 2 Ciri-ciri fisiologi isolat-isolat Bacillus sp.
Tabel 3 Hasil analisis sekuen gen 16S rRNA dengan menggunakan program BLAST-N Aktivitas penghambatan terhadap Isolat Vibrio harveyi Escherichia coli Staphylococcus aureus
Ø koloni (mm)
Ø zona bening
(mm) IP Ø koloni
(mm)
Ø zona bening
(mm) IP Ø koloni
(mm)
Ø zona bening
(mm) IP LTW54 2.5 5.0 1.0 2.3 7.7 2.3 7.0 25.3 2.6
LTW4 2.0 3.5 0.7 5.7 9.3 0.6 5.7 24.0 3.2 LTS36 2.2 4.2 0.9 2.0 6.0 2.0 4.3 20.3 3.7 LTC13 2.8 6.5 1.3 2.8 5.2 0.8 3.5 17.0 3.8
LTC8 2.5 3.7 0.5 4.0 5.5 0.3 3.0 14.3 3.7 LTS40 1.3 3.8 1.9 4.0 7.7 0.9 7.3 25.7 2.5
Uji Isolat Bacillus sp.
biokimia LTW54 LTW4 LTS36 LTC13 LTC8 LTS40 Nitrat + + + + + +
Lisin - - - - + - Ornitin - - -
H2S - - -
Glukosa + + + + + - Manitol + - + - + +
Xilosa - - - ONPG + - + + + + Indol - - - Urease - - - VP + + + + + + Sitrat - - - TDA - - - Gelatin - + + + + + Malonat - - - Inositol + - + - + + Sorbitol + - + - - + Rhamnosa - - - Sukrosa + + + - + + Laktosa - - - Arabinosa - - - + Adonitol - - - + Raffinosa - - - Salisin + - - - Arginin - - + - - + Pati + + + + + +
Isolat Spesies Bacillus homolog % identitas No.akses
LTW4 Bacillus subtilis galur SA3 99% EU124386.1
LTC13 Bacillus subtilis galur HU75 99% EF101719.1
LTS36 Bacillus sp. 12-059 99% EU635727.1
LTS40 Bacillus subtilis galur TPR02 98% EU373397.1 LTW54 Bacillus subtilis galur HU60 98% EF101710.1
LTC8 Bacillus sp. YIM KMY 7 98% DQ358645.1
5
Analisis Filogenetik
Data sekuen gen 16S rRNA dari keenam isolat kemudian dibandingkan dengan beberapa data sekuen gen 16S rRNA dari beberapa spesies Bacillus lainnya seperti B.
subtilis galur 168, B. megaterium galur TS IW 36, dan B. coagulans galur NRIC 1530. Hasil perbandingan sekuen ini kemudian divisualisasikan dalam bentuk pohon filogenetik yang dapat menunjukkan
kekerabatan (Gambar 2). Semua isolat Bacillus sp. yang diuji berada satu kelompok dengan B. subtilis galur 168 termasuk isolat LTS36 dan LTC8 yang berdasarkan hasil BLAST-N merupakan Bacillus sp. Skala 0.01 menunjukan jarak evolusi pada panjang cabang, sedangkan angka pada cabang menunjukkan nilai bootstrap.
Gambar 2 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen gen 16S rRNA dari isolat-isolat Bacillus sp.
yang dibandingkan dengan sekuen gen 16S rRNA dari beberapa spesies Bacillus lainnya.
PEMBAHASAN
Verifikasi daya hambat isolat-isolat Bacillus sp. terhadap bakteri indikator V.
harveyi, E. coli, dan S. aureus dilakukan untuk membuktikan bahwa isolat-isolat yang digunakan memiliki aktivitas penghambatan antimikrob terutama terhadap bakteri target V.
harveyi. Vibrio harveyi adalah bakteri yang banyak dijumpai di perairan, berpendar atau tidak berpendar, dan bersifat patogen oportunistik (Farmer & Hickman-Brenner 1992). Infeksi oleh bakteri luminesen dapat menyebabkan penyakit yang membuat inang yang terinfeksi menjadi lemah dan mati (Hisbi et al. 2000).
Bakteri E. coli dan S. aureus digunakan sebagai bakteri indikator untuk melihat kisaran spektrum dari zat antimikrob yang dihasilkan oleh isolat-isolat Bacillus sp.
Suparnika (2007) menyatakan bahwa E. coli dan S. aureus merupakan bakteri indikator standar yang sering digunakan dalam pengujian bakteri penghasil antimikrob.
Antimikrob yang dihasilkan oleh isolat-isolat
Bacillus sp. memiliki spektrum yang luas, ini dibuktikan dengan terbentuknya zona bening pada ketiga bakteri indikator. Pada umumnya bakteriosin lebih efektif menghambat galur- galur bakteri yang berkerabat dekat dengan bakteri penghasil bakteriosin (Jack et al.
1995).
Besarnya IP hasil verifikasi dengan data penelitian Isramilda (2007) dan Lestari (2008) menunjukkan beberapa perubahan yang mungkin disebabkan oleh menurunnya atau meningkatnya aktivitas antimikrob dan faktor- faktor eksternal. Isramilda (2007) dan Lestari (2008) melaporkan IP terbesar terhadap V.
harveyi dan E. coli ditunjukkan oleh isolat LTS40 sedangkan hasil verifikasi menunjukkan IP terbesar terhadap V. harveyi dan E. coli secara berurutan ditunjukkan oleh isolat LTS40 dan LTW54. Menurut Suparnika (2007), LTC8 menghasilkan IP terbesar terhadap S. aureus sedangkan berdasarkan hasil verifikasi IP terbesar dibentuk oleh isolat LTC13.
Genus Bacillus masuk ke dalam famili Bacillaceae. Semua genus dalam famili Bacillaceae memiliki kemampuan membentuk endospora di dalam sel vegetatifnya.
Isolat LTC13 Isolat LTS40
Isolat LTS36 Isolat LTW4
Isolat LTC8 Isolat LTW54 Bacillus subtilis galur 168
Bacillus megaterium galur TS IW 36 Bacillus coagulans galur NRIC 1530
100
70 80
64 62
0.01
6
Endospora adalah struktur berdinding tebal, sangat refraktif, dan hanya mengandung sedikit air sehingga resisten terhadap cekaman fisik (panas, kekeringan, UV) ataupun kimia (desinfektan, antibiotik, asam, dan basa) (Black 1999). Sifat endospora yang sangat resisten terhadap berbagai cekaman dan kondisi lingkungan dapat dijadikan bahan pertimbangan dalam mempermudah distribusi suatu produk yang berasal dari mikroorganisme hidup. Genus Bacillus memiliki endospora berbentuk oval dan kadang-kadang bundar atau silinder (Holt et al. 1994). Bacillus subtilis memiliki endospora berbentuk oval terletak di sentral atau sub-terminal dengan sporangium yang menggelembung (Slepecky 1992).
Bacillus sp. merupakan bakteri Gram positif, berbentuk batang tunggal atau rantai, motil dengan flagel, bersifat aerob atau anaerob fakultatif, kemoorganotrof dengan metabolisme fermentatif dan respiratif.
Kemampuan fisiologi sangat beragam antara lain peka terhadap panas, pH, dan salinitas, uji katalase dan VP positif, mampu mereduksi nitrat, dan menghidrolisis pati (Holt et al.
1994).
Nilai positif pada uji nitrat menunjukkan bahwa isolat dapat mereduksi nitrat (NO3-) menjadi nitrit (NO2-) dengan menggunakan enzim nitrat reduktase. Kemampuan isolat Bacillus sp. dalam menghasilkan senyawa yang tidak bersifat asam atau produk akhir netral seperti asetilmetil karbinol dari asam organik (asam piruvat) sebagai hasil fermentasi glukosa ditunjukkan dengan hasil VP positif.
Kemampuan isolat dalam menghidrolisis makromolekul menjadi mikromolekul ditunjukkan oleh uji pati dan uji gelatin yang bernilai positif. Uji pati positif menujukkan kemampuan isolat dalam menghidrolisis pati yang merupakan polisakarida menjadi sakarida yang lebih sederhana dengan menggunakan enzim amilase, sedangkan uji gelatin positif menunjukkan bahwa isolat dapat menghidrolisis gelatin yang merupakan protein berukuran besar menjadi polipeptida dan kemudian menjadi asam amino dengan menggunakan enzim proteolitik ekstraseluler berupa gelatinase.
Uji glukosa dan sukrosa positif menunjukkan kemampuan isolat Bacillus sp.
dalam melakukan fermentasi karbohidrat dan menghasilkan produk akhir berupa asam. Uji ONPG dilakukan untuk mengetahui kemampuan isolat dalam memproduksi enzim ß-galaktosidase yang dapat menghidrolisis
substrat ONPG yang mengandung laktosa dan bersifat kromogenik, hasil positif akan mengubah warna media yang tidak berwarna menjadi kuning.
Bacillus subtilis dapat tumbuh pada media bergaram minimal, menggunakan glukosa sebagai sumber karbon (Ebbole &
Zalkin 1987), dan dapat menguraikan sukrosa karena B. subtilis dapat memproduksi ß,D- fruktofuranosidase, sukrase, dan levansukrase setelah diinduksi oleh sukrosa (Klier &
Rapoport 1988). Norris et al. (1981), menggambarkan kunci identifikasi genus Bacillus bahwa spesies yang dapat memproduksi katalase, uji VP positif, tidak dapat tumbuh pada keadaan anaerobik, dan dapat menghidrolisis pati adalah spesies B.
subtillis.
Analisis sekuan gen 16S rRNA menunjukkan keenam isolat memiliki kemiripan terdekat dengan Bacillus sp. dan B.
subtilis pada DataBank. Sedangkan berdasarkan analisis pohon filogenetik terlihat bahwa keenam isolat berada pada satu kelompok yang sama, termasuk isolat LTC8 dan LTC13 yang memiliki kemiripan dengan Bacillus sp. Hal ini dapat membuktikan bahwa kedua isolat tersebut dapat digolongkan ke dalam spesies B. subtilis. Analisis gen 16S rRNA dengan sekuen oligonukleotida adalah cara yang efektif untuk mengetahui taksonomi Bacillus dan dapat dihubungan secara langsung dengan data filogenetik (Fox et al.
1977).
Pada pohon filogenetik juga dapat dilihat bahwa keenam isolat memiliki kekerabatan yang dekat dengan B. subtilis galur 168. Galur 168 ini sering digunakan sebagai model dalam mempelajari genetika genus Bacillus dan salah satu dari bakteri berbentuk batang yang dapat menerima DNA dari lingkungan secara alami (Hemphiil & Whiteley 1975).
Bakteriosin subtilosin pertama kali diisolasi dari B. subtilis galur 168 tipe liar (Babasaki et al. 1985).
Bacillus subtilis merupakan salah satu anggota genus Bacillus yang diketahui mampu memproduksi berbagai macam zat antimikrob, mampu memproduksi lebih dari 24 antibiotik dengan berbagai struktur dan bakteriosin.
Bakteriosin yang banyak diproduksi oleh B.
subtilis ialah subtilin, ericin, mersacidin, sublancin, dan subtilosin A (Stein et al. 2004;
Stein 2005). Spesies ini juga mampu memproduksi berbagai macam enzim ekstraseluler seperti protease, lipase, amilase, nuklease, dan fosfatase (Slepecky 1992) sehingga dapat digunakan sebagai agen
7
bioremidiasi bahan organik di perairan. Agen bioremidiasi yang baik yaitu dapat memperbanyak diri dengan cepat dan memiliki kemampuan enzimatik yang baik (Antony & Philip 2006). Bacillus subtilis diketahui tidak bersifat patogen baik terhadap tumbuhan, hewan, dan manusia karena memiliki virulensi dan toksisitas yang rendah (Claus & Berkeley 1986). Selain itu B. subtilis juga dapat bertahan pada kondisi yang tidak menguntungkan dengan membentuk endospora dan mampu hidup secara anaerobik dengan kehadiran glukosa dan nitrat (Claus &
Berkeley 1986; Slepecky 1992).
SIMPULAN
Keenam isolat penghasil bakteriosin asal tambak udang mampu menghambat pertumbuhan V. harveyi, E. coli dan S. aureus.
Isolat LTS 40 memiliki IP paling besar terhadap V. harveyi, isolat LTW54 memiliki IP paling besar terhadap E. coli, sedangkan IP terbesar terhadap S. aureus ditunjukkan oleh isolat LTC13. Keenam isolat Bacillus sp.
memiliki kemampuan dalam mereduksi nitrat, menghasilkan asetilmetil karbinol dari fermentasi glukosa, menghidrolisis pati dan gelatin, memfermentasi glukosa dan sukrosa, dan memproduksi ß-galaktosidase.
Isolat LTW4, LTC13, LTS40, dan LTW54 memiliki kemiripan 98-99% dengan Bacillus subtilis sedangkan isolat LTS36 dan LTC8 memiliki kemiripan 98-99% dengan Bacillus sp. Kekerabatan antara keenam isolat pada pohon filogenetik berada pada satu kelompok dan sekerabat dengan B. subtilis galur 168.
DAFTAR PUSTAKA
Atlas RM, Bartha R. 1998. Microbial Ecology Fundamentals and Applications. Ed ke-4. California: Benjamin.
Antony SP, Philip R. 2006. Bioremediation in shrimp culture systems [editorial].
World Fish Center Quarterly 29:62- 66.
Babasaki K, Takao T, Shimonishi Y, Kurahashi K. 1985. Subtilosin A, a new antibiotic peptide produced by Bacillus subtilis 168: isolation, structural analysis, and biogenesis. J Biochem 98:585-603.
Black JG. 1999. Microbiology Principles and Exploration. Ed ke-4. New York:
John Wiley & Sons.
Brock JA, Lightner DV. 1990. Diseases of Crustacea. Di dalam: Kinne O, editor. Diseases of Marine Animals.
Volume ke-3. Hamburg: Biologische Anstalt Helgoland.
Claus D, Berkeley RCW. 1986. Genus Bacillus. Di dalam: Sneath PHA et al., editor. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Volume ke- 2. Baltimore: Lippincott Willians &
Wilkins. hlm 1105-1139.
Dahuri R. 2003. Prospek investasi dan bisnis di sektor kelautan. Bogor: Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan IPB.
Ebbole DJ, Zalkin H. 1987. Cloning and characterization of a 12-gene cluster from Bacillus subtilis encoding nine enzymes for de novo purine nucleotide syntesis. J Biol Chem 262:8274-8287.
Farmer III JJ, Hickmann-Brenner FW. 1992.
The genera Vibrio and Photobacterium. Di dalam: Balows A, Trupper HG, Dworkin M, Harder W, Schleifer KH, editor. The Prokaryotes. Ed ke-2. New York:
Springer-Verlag. hlm 2952-3011.
Fox GE, Pechan KR, Woese CR. 1977.
Comparative cataloging of 16s ribosomal ribonucleic acid:
molecular approach to prokaryotic systematics. J Syst Bacteriol 27:4-57.
Hadioetomo RS. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama.
Hemphill HE, Whiteley HR. 1975.
Bacteriophages of Bacillus subtilis.
Bacteriol 39:257-315.
Hisbi D et al. 2000. Characterization of Vibrio and related bacteria associated with shrimp Penaeus monodon larvae in Indonesia. Asian Fish Sci 13: 57-64.
Holt JG, Kreig NR, Sneath PHA, Stanley JT, Williams ST. 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Ed ke-9. Baltimore: Lippincott Willians
& Wilkins.
Isramilda. 2007. Karakterisasi zat antimikrob penghambat pertumbuhan Vibrio harveyi dan Escherichia coli dari Bacillus sp. asal tambak udang [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Jack RW, Tagg JR, Ray B. 1995. Bacteriocin of Gram positive bacteria. Microbiol Rev 59:171-200.
8
Klier AF, Rapoport. 1988. Genetics and regulation of carbohydrate catabolism in Bacillus. Ann Rev Microbiol 42:65-95.
Lavilla-Pitogo CR, Leano EM, Paner MG.
1998. Mortalities of pond-cultured juvenile shrimp Penaeus monodon associated with dominance of luminescent vibrios in the rearing environment. Aquaculture 164:337- 349.
Lazo GR, Roffey R, Gabriel DW. 1987.
Conservation of plasmid DNA sequences and pathovar identification of strain Xanthomonas campestris.
Pytopathology 77: 1461-1467.
Lestari D. 2008. Isolasi dan seleksi Bacillus sp. untuk biokontrol pada tambak udang [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Marchesi JR et al. 1998. Design and evaluation of useful bacterium specific PCR primer that amplify genes coding for bacterial 16S- rRNA. Appl Environ Microbiol 64:795-799.
Mohney LL, Lightner DV. 1990.
Bioencapsulation of therapeutic quantities of the antibacterial Pomet 30 in the nematode Panagrellas redivivus and in nauplii of Artemia salina. J World Aquacult Soc 21:186- 191.
Moriarty DJW. 1999. Disease control in shrimp aquaculture with probiotic bacteria. Di dalam : Bell CR, Brylinsky M, Johnson GP, editor.
Microbial Biosystem : New Frontier.
Proceeding of the 8th International Symposium on Microbial Ecology;
Halifax, 9-14 Agustus 1998. Halifax:
Atlantic Canada Society for Microbial Ecology. hlm 237-343.
Muliani, Suwanto A, Hala Y. 2003. Isolasi dan karakterisasi bakteri asal laut Sulawesi untuk biokontrol penyakit vibriosis pada larva udang windu (Penaeus monodon Fab.). Hayati 10:6-11.
Norris JR, Berkeley RCW, Logan NA, O’Donnell. 1981. The Genera Bacillus and Sporalactobacillus. Di dalam: Balows A, Trupper HG, Dworkin M, Harder W, Schleifer KH, editor. The Prokaryotes. Ed ke- 2. New York: Springer-Verlag. hlm 1711-1742.
Sakai M. 1999. Current research status of fish immunostimulants. Aquaculture 172:
63-92.
Slepecky RA, Henphill HR. 1992. The Genus Bacillus-nonmedical. Di dalam:
Balows A, Trupper HG, Dworkin M, Harder W, Schleifer KH, editor. The Prokaryotes. Ed ke-2. New York:
Springer-Verlag. hlm 1663-1696.
Stein T, Dusterhus S, Stroh A, Entian KD.
2004. Subtilosin production by two Bacillus subtilis subspecies and variance of the sbo-alb cluster. Appl Environ Microbiol 70:2349-2353.
Stein T. 2005. Bacillus subtilis antibiotics:
structures, syntheses and specific functions. Mol Microbiol 56:845–
857.
Suparnika I. 2007. Aktivitas antimikrob Bacillus sp. yang diisolasi dari tambak udang [skripsi]. Bogor:
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. 2007.
MEGA4: Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Mol Biol Evol 24:1596–
1599.
Torkar KG, Matijasic BB. 2003. Partial characterization of bacteriocins produced by Bacillus cereus isolate from milk and milk products. Food Technol I 41:655-671.
Vandenberghe et al. 1999. Vibrios associated with Litopenaeus vannamei larvae, postlarvae, broodstock, and hatchery probionts. Appl Environ Microbiol 65:2592–2597.
Verschuere L, Geert R, Patrick S, Willy V.
2000. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture [ulas balik]. J Microbiol Mol Biol Rev 64:655-671.
9
LAMPIRAN
10
Lampiran 1 Karakteristik morfologi sel, pewarnaan Gram, dan endospora isolat-isolat Bacillus sp.
Isolat Bentuk dan Pewarnaan Endospora
penataan sel Gram Bentuk Posisi
LTW 54 basil, tunggal + bulat terminal
LTW 4 basil, tunggal + bulat terminal
LTS 36 basil, tunggal + bulat terminal
LTC 13 basil, tunggal + bulat terminal
LTC 8 basil, tunggal + bulat sentral
LTS 40 basil, tunggal + bulat terminal
11
Lampiran 2 Hasil pewarnaan Gram dan endospora isolat-isolat Bacillus sp.
Pewarnaan Gram
LTW4 LTC8
LTC13 LTS36
LTS40 LTW54
10 µm
10 µm 10 µm
10 µm 10 µm
10 µm
12
Lampiran 2 (Lanjutan) Pewarnaan endospora
LTW4 LTC8
LTC13 LTS36
LTS40 LTW54
10 µm
10 µm
10 µm 10 µm
10 µm 10 µm
13
Lampiran 3 Hasil sekuen gen 16S rRNA dan BLAST-N isolat-isolat Bacillus sp.
A) Urutan nukleotida hasil sekuen gen 16S rRNA isolat LTW4
B) Hasil BLAST-N sekuen gen 16S rRNA parsial dengan data GenBank isolat LTW4
14
Lampiran 3 (Lanjutan)
A) Urutan nukleotida hasil sekuen gen 16S rRNA isolat isolat LTC13
B) Hasil BLAST-N sekuen gen 16S rRNA parsial dengan data GenBank isolat LTC13
15
Lampiran 3 (Lanjutan)
A) Urutan nukleotida hasil sekuen gen 16S rRNA isolat LTS36
B) Hasil BLAST-N sekuen gen 16S rRNA parsial dengan data GenBank isolat LTS36
16
Lampiran 3 (Lanjutan)
A) Urutan nukleotida hasil sekuen gen 16S rRNA isolat LTS40
B) Hasil BLAST-N sekuen gen 16S rRNA parsial dengan data GenBank isolat LTS40
17
Lampiran 3 (Lanjutan)
A) Urutan nukleotida hasil sekuen gen 16S rRNA isolat LTW54
B) Hasil BLAST-N sekuen gen 16S rRNA parsial dengan data GenBank isolat LTW54
18
Lampiran 3 (Lanjutan)
A) Urutan nukleotida hasil sekuen gen 16S rRNA isolat LTC8
B) Hasil BLAST-N sekuen gen 16S rRNA parsial dengan data GenBank isolat LTC8
