BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis Rancangan Penelitian
Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah gabungan antara
metode non eksperimental dan metode eksperimental. Metode non
eksperimental yaitu melakukan determinasi tanaman serai dan cengkih,
destilasi daun cengkih dan serai, identifikasi kandungan senyawa kimia dalam
minyak atsiri serai dan cengkih dengan menggunakan GC-MS. Metode
eksperimental yaitu melakukan uji potensi minyak atsiri serai dan cengkih
sebagai pengawet daging ayam berdasarkan aktivitasnya sebagai
menghambat pertumbuhan bakteri dengan menggunakan perbandingan
konsentrasi minyak atsiri serai dan cengkih.
B. Variabel Penelitian
1. Variabel bebas
Variabel bebas dari penelitian ini adalah perbandingan konsentrasi minyak
atsiri serai dan cengkih dan waktu penyimpanan daging ayam.
2. Variabel tergantung
Variabel tergantung dari penelitian ini adalah absorbansi sampel yang
dikultur pada media NB dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang
gelombang 600 nm, dan pengamatan organoleptis sampel daging ayam.
3. Variabel terkendali
Variabel terkendali dari penelitian ini adalah proses pengerjaan aseptis,
sterilisasi, media kultur, suhu penyimpanan, waktu destilasi, preparasi
sampel.
C. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan selama 5 bulan. Proses pengerjaan determinasi
tanaman cengkih dan serai dilakukan di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan
Fakultas Biologi Universitas Jendral Soedirman Purwokerto, destilasi minyak
Treatment Fakultas Teknik Kimia Universitas Muhammadiyah Purwokerto
(UMP), identifikasi kandungan senyawa minyak atsiri serai dan cengkih
dilakukan di Laboratorium Microinstrument Terpadu UMP, dan uji potensi
minyak atsiri serai dan cengkih sebagai pengawet makanan dilakukan di
Laboratorium Bioprocess Fakultas Teknik Kimia UMP.
D. Alat dan Bahan
1. Alat
Alat yang digunakan pada penelitian ini yaitu timbangan analitik
(Shimadzu), dandang uap destilasi, mikropipet (Socorex), GCMS-QP2010
SE dengan SH-Rxi-5Sil MS (Shimadzu), LAF/Laminar Air Flow
(Mascotte model LH-S), Spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu UV-1240),
pH meter, autoklaf, oven (Memmert)dan alat-alat gelas (Pyrex).
2. Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini yaitu simplisia batang
dan daun serai, simplisia daun cengkih, akuades, natrium sulfat anhidrat,
n-heksan, daging ayam segar, formalin, dimetil solfoksida (DMSO),
natrium benzoat, media Nutrient Broth (NB) dan alkohol.
E. Cara Penelitian
1. Pengumpulan Tanaman
Daun cengkih yang dipakai diambil dari daerah Pemalang, Jawa
Tengah. Serai (aerial parts) yang digunakan diambil dari daerah Sokaraja,
Banyumas, Jawa Tengah.
2. Determinasi Tanaman
Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Taksonomi
Tumbuhan Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto
mengunakan buku acuan “Flora of Java” Volume III (Backer dan Bakhuizen Van Den Brink, 1968).
3. Penyiapan Simplisia
Sampel yang telah dikumpulkan, dilakukan pengeringan di bawah
4. Pengambilan Minyak Atsiri (Destilasi)
Pengambilan minyak atsiri serai dan cengkih dilakukan dengan
metode destilasi uap dan air. Simplisia serai dan cengkih masing-masing
dimasukkan ke dalam dandang uap berbeda yang telah diisi dengan
akuades. Proses destilasi berlangsung selama 5-6 jam. Minyak yang
didapat yang masih tercampur dengan air dipisahkan dengan Na2SO4
anhidrat sebanyak 10% dari cairan. Minyak yang telah dipisahkan,
disaring dan disimpan dalam botol vial dalam lemari pendingin suhu
rendah 5±2oC dalam botol kaca dibungkus aluminium foil (Oliveira et al.,
2013).
5. Identifikasi Kandungan Kimia Minyak Atsiri (GC-MS)
Minyak atsiri dianalisis dengan menggunakan GCMS-QP2010 SE
dengan SH-Rxi-5Sil MS, dilengkapi dengan kolom HP-5 5%
fenilmetilsiloksan ukuran 30 m x 0,25 mmID x 0,25 µm df. Suhu oven
diprogram dari suhu 50oC selama 2 menit, lalu dinaikkan sampai 100oC
dengan laju 2oC/menit, dan langsung dinaikkan lagi sampai 2800C dengan
laju 5oC/menit dan ditahan sampai 10 menit. Gas pembawa berupa gas
helium dengan laju alir sebesar 1ml/menit. Rasio injeksinya yaitu 1:50 dan
voltasi ionisasi yaitu 70 eV. Suhu injektor dan deterktor masing-masing
280oC dan 230oC. Volume minyak atsiri atau sampel yang diinjeksi
sebanyak 1µL 10000 ppm dengan n-heksan sebagai pelarutnya. Waktu
tunggu pembacaan pelarut selama 2 menit dan analisis satu sampel
berlangsung selama 73 menit. Identifikasi konstituen dari spektrum massa
dibandingkan dengan library Wiley 9.0 (Adam, 2001).
6. Uji Potensi minyak atsiri serai dan cengkih sebagai bahan pengawet
daging ayam
a. Pembuatan media NB
Melarutkan 4 g NB dalam 500 mL akuades, diaduk dan
dipanaskan di atas hot plate sampai homogen, lalu tutup rapat dengan
aluminium foil. Kemudian dilakukan sterilisasi basah (Pratiwi, 2008).
Alat yang digunakan disterilkan dengan metode sterilisasi
kering menggunakan oven bersuhu 170oC selama 1 jam (Pratiwi,
2008). Alat yang digunakan dicuci dan dibungkus rapat baru
dimasukkan ke dalam oven.
c. Sterilisasi bahan
Bahan yang digunakan disterilkan dengan metode sterilisasi
basah menggunakan autoklaf 121 0C 1 atm selama 20 menit (Pratiwi,
2008). Bahan diletakkan dalam wadah yang sesuai dan ditutup rapat
dengan aluminium foil, lalu di masukkan ke dalam autoklaf.
d. Persiapan daging ayam
Daging ayam segar diperoleh dari pasar
Tambaksogra-Purwokerto, Jawa Tengah. Daging ayam segar dipotong dadu kecil
(1cm x 1cm x 1cm), kemudian dicuci dengan akuades steril.
e. Persiapan kelompok perlakuan
Penelitian ini menggunakan 9 kelompok perlakuan.
Masing-masing kelompok perlakuan disiapkan dalam volume 500 mL.
Terdapat 3 kelompok yang menggunakan kombinasi minyak atsiri
dengan perbandingan minyak atsiri serai dengan cengkih sebesar
0.2:2, 1:1, dan 2:0.2 %. Dan terdapat 2 kelompok perlakuan dengan
minyak atsiri tunggal konsentrasi 1%. Sebagai kontrol positif
digunakan formalin 10% dan Na benzoat 0.12%. Sebagai kontrol
negatif yaitu DMSO dan air steril.
Sejumlah volume minyak atsiri tertentu dipipet, ditambah
DMSO dengan volume yang sama dan ditambahkan akuades steril
sampai 500 mL. Formalin diambil 50 mL dan ditambahkan akuades
steril sampai 500 mL. Na benzoat ditimbang 0.6 g dan dilarutkan
dengan akuades steril sampai 500 mL. Diambil DMSO 5 mL dan
ditambahkan dengan akuades steril sampai 500 mL. Air steril
disiapkan dalam wadah sebanyak 500 mL (tabel 3.1). Perlakuan
Tabel 3.1. Jumlah pemipetan cairan kelompok perlakuan
Pengawetan daging ayam dengan cara memasukkan potongan
daging ayam yang telah dicuci bersih ke dalam 9 kelompok perlakuan
selama 1 menit dan dibantu dengan pengadukan. Setiap 6 potong
daging ayam dipindahkan ke dalam gelas steril untuk dilakukan
penyimpanan pada hari ke-0, 3, 6, 9, 12 dan 15. Semua disimpan di
dalam lemari pendingin (2-70C), kecuali untuk penyimpanan hari
ke-0.
f. Pengamatan potensi minyak atsiri serai dan cengkih sebagai pengawet
alami pada daging ayam
Setiap waktu penyimpanan dilakukan pengamatan. Pengamatan
tersebut ada 2 aspek, yaitu pengamatan secara organoleptis dan
absorbansi bakteri pada media NB.
1) Organoleptis
Pengamatan uji organoleptis pada sampel daging ayam
yang telah diawetkan dengan kelompok perlakuan. Uji dilakukan
dengan diambil sampel potongan daging ayam kemudian diamati
keberadaan lendir, tekstur, bau dan warna (Andayani et al., 2014).
Perhitungan absorbansi bakteri diambil dari sampel daging
ayam yang telah diawetkan dengan kelompok perlakuan. Diambil
1 potong daging ayam dan dimasukkan dalam erlenmeyer yang
berisi 25 mL media NB steril. Homogenkan campuran tersebut
selama 1 menit. Diambil 1 mL cairan yang telah homogen dan
tuangkan pada tabung reaksi yang berisi 9 mL media NB steril.
Tabung reaksi diinkubasi pada suhu 37 0C. Ukur absorbansi media
setelah 24 jam dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang
gelombang 600 nm. Sebagai blanko digunakan media NB steril.
Perlakuan dilakukan replikasi sebanyak 3x dan semua dalam
keadaan aseptis (De Oliveira et al., 2013; Rialita, 2014).
F. Analisis Data
Analisis deskriptif dilakukan untuk deskripsi data hasil organoleptis
sampel daging ayam hasil penyimpanan. Sedangkan data hasil absorbansi
diolah secara statistik. Sebelum dianalisis harus dilakukan uji homogenitas
dan normalitas. Data yang tidak homogen dan tidak normal, kemudian
dianalisis secara non-parametrik menggunakan metode Kruskal-Wallis. Jika
terdapat perbedaan yang signifikan maka dilanjutkan analisis Post Hoc
menggunakan tes Mann-Whitney untuk mengetahui perbedaan antar
kelompok perlakuan, bermakna (p <0.05) atau tidak bermakna (p>0.05)
