3 Lampiran 1
RINGKASAN PENGKAJIAN KEAMANAN PAKAN JAGUNG PRG EVENT MZIR098
I. PENDAHULUAN
Jagung PRG event MZIR098 merupakan jagung produk rekayasa genetik dari perusahaan multinasional PT Syngenta Seed Indonesia yang dikembangkan untuk memperoleh jagung yang memiliki sifat tahan terhadap hama jagung dalam ordo Koleoptera, yaitu penggerek akar jagung (Western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera), dan toleransi terhadap herbisida glufosinate-ammonium. Jagung PRG event MZIR098 mengandung tiga gen sisipan, yaitu ecry3.1Ab, mcry3A, dan pat-08.
Jagung PRG event MZIR098 telah memperoleh sertifikat aman pangan di 9 (sembilan) negara, yaitu Amerika Serikat, Kanada, Australia, dan Selandia Baru (2016), Jepang (2017), Brasil dan Malaysia (2018), dan Taiwan dan Indonesia (2019). Indonesia memberikan sertifikat aman pangan pada Jagung PRG event MZIR098 ini berdasarkan SK Kepala Badan POM No. HK.04.1.51.04.19.1409 Tahun 2019.
Jagung PRG event MZIR098 telah mendapatkan sertifikat aman pakan di 6 (enam) negara, yaitu Amerika Serikat dan Kanada (2016), dan Brasil, Kolumbia, Jepang, dan Malaysia (2018).
Jagung PRG event MZIR098 juga telah mendapatkan sertifikat aman lingkungan di 3 (tiga) negara, yaitu Amerika Serikat, Kanada, dan Jepang (2016).
Berdasarkan Peraturan Menteri Pertanian No. 36/Permentan/LB.070/8/2016 Tahun 2016 tentang Pengkajian Keamanan Pakan PRG dan Keputusan Kepala Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian No. 466.2/Kpts/OT.210/H/11/2016 Tahun 2016 tentang Pedoman Teknis Tata Cara dan Mekanisme Pengkajian Keamanan Pakan PRG, TTKH Bidang Keamanan Pakan PRG telah melakukan pengkajian keamanan pakan Jagung PRG event MZIR098 berdasarkan informasi genetik dan informasi keamanan pakan sebagaimana diuraikan berikut ini.
II. INFORMASI GENETIK II.1 Elemen Genetik
Jagung PRG event MZIR098 merupakan jagung PRG hasil rakitan molecular stacked yang mengandung tiga gen sisipan, yaitu ecry3.1Ab, mcry3A, dan pat-08. Promotor yang digunakan untuk setiap gen berturut-turut adalah promotor Ubi1-18, CMP-04, dan 35S-04. Terminator untuk gen mcry3A adalah NOS-20, sedangkan untuk gen ecry3.1Ab dan pat 08 adalah NOS-05-01. Gen mcry3A menyandi protein mCry3A yang bertanggung jawab dalam ketahanan terhadap hama jagung dalam ordo Koleoptera, yaitu penggerek akar jagung (Western corn rootworm, D. virgifera virgifera).
Gen ecry3.1Ab menyandi protein eCry3.1Ab juga bertanggung jawab dalam ketahanan terhadap hama penggerek akar jagung (D. virgifera virgifera).
4
Gen pat-08 menyandi enzim phosphinothricin acetyltransferase (PAT) untuk toleransi terhadap herbisida glufosinate-ammonium, dan juga digunakan sebagai marka seleksi dalam proses transformasi.
II.2 Sumber Gen Sisipan
Sumber gen sisipan Jagung PRG event MZIR098, yaitu:
1. Gen mcry3A merupakan hasil modifikasi dari gen cry3A yang berasal dari bakteri Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (Sekar et al., 1987; Chen dan Stacy, 2007). Promotor Ubi1-18 berasal dari tanaman jagung (Zea mays), sedangkan terminator NOS-20 berasal dari Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., 1983; Christensen et al., 1992).
2. Gen ecry3.1Ab merupakan gen fusi antara gen mcry3A yang berasal dari B. thuringiensis subsp. tenebrionis dan gen cry1Ab yang berasal dari B. thuringiensis subsp. kurstaki strain D-1 (Geiser et al., D-1986; Murray et al., D-1989; Koziel et al., D-1997; Walters et al., 20D-10). Promotor CMP-04 berasal dari Cestrum yellow leaf curling virus, sedangkan terminator NOS-05-01 berasal dari A. tumefaciens (Bevan et al., 1983; Hohn et al., 2007).
3. Gen pat-08 berasal dari Streptomyces viridochromogenes strain Tü494 (Wohlleben et al., 1988). Promotor 35S-04 berasal dari Cauliflower mosaic virus, sedangkan terminator NOS-05-01 berasal dari bakteri A. tumefaciens (Bevan et al., 1983; Odell et al., 1985).
II.3 Sistem Transformasi
Jagung PRG event MZIR098 dirakit melalui sistem transformasi menggunakan eksplan embrio muda (immature embryo) yang dimediasi A. tumefaciens strain LBA4404, menggunakan plasmid transformasi pSYN17629 yang mengandung kaset ecry3.1Ab, mcry3A, dan pat-08 (Komari et al., 1996; Negrotto et al., 2000). Keberadaan gen eCry3.1Ab, mcry3A, dan pat-08 pada plantlet dan tidak adanya gen resisten spectinomycine (spec) yang berada pada vektor backbone diuji dengan Taqman PCR (Ingham et al., 2001). Tanaman yang positif membawa gen eCry3.1Ab, mcry3A, dan pat-08, serta tidak membawa gen spec ditransfer ke rumah kaca untuk diperbanyak.
II.4 Stabilitas Genetik
Hasil analisis real-time PCR Jagung PRG event MZIR098 menunjukkan bahwa T-DNA stabil sampai lima generasi selfing (F5) dan F1 hibrida (Lee 2016). Data analisis Southern blot menunjukkan
bahwa Jagung PRG event MZIR098 mengandung satu kopi ecry3.1Ab, mcry3A, dan pat-08. Selain itu, melalui analisis Southern blot juga ditemukan bahwa tidak terdeteksi sekuen backbone dari plasmid transformasi pSYN17629.
Berdasarkan hasil kajian informasi genetik dapat disimpulkan bahwa:
1. Jagung PRG event MZIR098 mengandung satu kopi sisipan T-DNA yang berisi kaset gen mcry3A, ecry3.1Ab, dan pat-08.
2. Jagung PRG event MZIR098 tidak mengandung sekuen backbone dari plasmid transformasi pSYN17629.
3. T-DNA dalam Jagung PRG event MZIR098 stabil sampai lima generasi (F5) dan F1 hibrida,
5 III. INFORMASI KEAMANAN PAKAN
III.1 Kesepadanan Substansial
Kesepadanan substansial tanaman Jagung PRG event MZIR098, meliputi biji jagung dan hijauan tanaman jagung, telah dianalisis dengan dibandingkan terhadap induknya (near-isogenic) sebagai kontrol dan enam galur referensi non-PRG. Sampel yang diuji diambil dari delapan lokasi tanam di Amerika Serikat, yang sudah menerapkan Good Laboratory Practices (GLP), yaitu Richland, Iowa; York, Nebraska; Seymour, Illinois; Bagley, Iowa; Larned, Kansas; Stewardson, Illinois; Wyoming, Illinois; Germansville, Pennsylvania.
Laporan kesepadanan substansial mengacu pada laporan Juba (2015). Analisis kuantitatif pada hijauan tanaman jagung terdiri atas analisis proksimat (kadar air, protein, lemak, abu, dan karbohidrat), komponen serat, dan mineral (kalsium dan fosfor). Analisis pada biji jagung terdiri atas analisis proksimat (kadar air, protein, lemak, abu, karbohidrat, dan pati), komponen serat, mineral (kalsium, tembaga, besi, magnesium, manganese, fosfor, potassium, selenium, sodium, dan zinc), vitamin (A, B1, B2, B3, B6, B9, dan E), profil asam amino (alanin, arginin, asam aspartat,
sistin, asam glutamat, glisin, histidin, isoleusin, leusin, lisin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, tirosin, dan valin), profil asam lemak (kaprilat, kaprat, laurat, miristat, miristolat, pentadekanoat, pentadekenoat, palmitat, palmitoleat, heptadekanoat, heptadekenoat, stearat, oleat, linoleat, gamalinolenat, linolenat, arakhidat, eikosenoat, eikosadienoat, eikosatrienoat, arakhidonat, dan behenat), metabolit sekunder (asam ferulat, furfural, inositol, dan asam p-kumarat), dan zat antinutrisi (asam fitat, rafinosa, dan inhibitor tripsin).
Hasil analisis hijauan tanaman Jagung PRG event MZIR098 untuk proksimat, komponen serat, dan mineral, dan biji Jagung PRG event MZIR098 untuk proksimat, komponen serat, mineral, vitamin, asam amino, asam lemak, metabolit sekunder, dan zat antinutrisi tidak berbeda dengan kontrol dan berada dalam kisaran referensi atau basis data ILSI (ILSI, 2014).
Berdasarkan pengkajian kesepadanan substansial dapat disimpulkan bahwa Jagung PRG event MZIR098 sepadan dengan jagung non-PRG.
III.2 Toksisitas
Uji toksisitas dilakukan melalui studi bioinformatika, uji kecernaan in vitro, dan toksisitas akut pada mencit.
III.2.1 Studi bioinformatika toksisitas protein eCry3.1Ab, mCry3A, dan PAT
Kajian toksisitas protein eCry3.1Ab, mCry3A, dan PAT secara bioinformatik dilakukan dengan menganalisis kemiripan sekuen asam amino masing-masing protein tersebut terhadap sekuen asam amino yang terdapat dalam basis data National Center for Biotechnology Information (NCBI, 2016) dan basis data toksin Syngenta (Bailey, 2016; Bauman, 2016) yang diketahui sebagai toksin atau toksin putatif (putative toxin). Analisis dilakukan dengan menggunakan metode Basic Local Alignment Search Tools for Protein (BLASTP) (Altschul et al., 1997). Nilai ambang batas untuk kriteria signifikan untuk kedua basis data ditetapkan <1,010-5.
Berdasarkan basis data NCBI, BLASTP dengan query eCry3.1Ab menghasilkan 1.000 sekuen dengan kesamaan signifikan, namun tidak ada sekuen yang berpotensi sebagai toksin. Demikian pula, hasil BLASTP terhadap basis data toksin Syngenta menunjukkan bahwa tidak ada sekuen yang memiliki kesamaan yang memiliki relevansi biologis.
6
Hasil yang serupa diperoleh ketika menggunakan protein mCry3A. Dengan menggunakan basis data NCBI, BLASTP menghasilkan 1.000 sekuen dengan kesamaan signifikan, namun tidak ada sekuen yang berpotensi sebagai toksin. Demikian pula, hasil BLASTP terhadap basis data toksin Syngenta, dari sekuen yang memiliki kesamaan, tidak ada yang memiliki relevansi biologis.
Evaluasi toksisitas PAT menggunakan BLASTP terhadap basis data NCBI menghasilkan 1.000 sekuen dengan kesamaan signifikan, namun tidak ada sekuen yang berpotensi sebagai toksin. Demikian pula, hasil BLASTP terhadap basis data toksin Syngenta, sekuen PAT tidak memiliki kesamaan yang signifikan dengan sekuen toksin yang telah dikenal atau toksin putatif.
III.2.2 Uji kecernaan in vitro protein eCry3.1Ab, mCry3A, dan PAT
Uji kecernaan in vitro protein eCry3.1Ab, mCry3A, dan PAT dilakukan mengikuti prosedur simulated mammalian gastric fluid (SGF) yang mengandung pepsin dan prosedur simulated mammalian intestinal fluid (SIF) yang mengandung pankreatin. Setiap uji diikuti dengan analisis SDS-PAGE dan Western blot.
Pada uji kecernaan in vitro dengan prosedur SGF, protein eCry3.1Ab diproduksi dari sistem ekspresi pada bakteri E. coli dengan kandungan sebesar 89,6%. Protein eCry3.1Ab tercerna pada SGF kurang dari 30 detik yang terdeteksi melalui elektroforesis SDS-PAGE. Demikian juga, tidak ada protein eCry3.1Ab yang terdeteksi pada hasil Western blot (Song, 2010). Pengujian kecernaan in vitro untuk mCry3A dilakukan dengan menggunakan materi uji berupa protein rekombinan MCRY3A-0102 yang diproduksi dari bakteri E. coli yang mengandung protein mCry3A dengan tingkat kemurnian 90,3% (Syngenta Seeds, Inc., 2003). Hasil uji menunjukkan bahwa protein mCry3A tercerna dalam 2 menit dari analisis SDS-PAGE diikuti dengan Western blot (Joseph dan Graser, 2005). Uji kecernaan in vitro protein PAT dilakukan dengan menggunakan materi uji berupa protein rekombinan yang diproduksi dari bakteri E. coli yang mengandung protein PAT dengan tingkat kemurnian 85,9%. Hasil uji menunjukkan bahwa protein PAT tercerna kurang dari 1 menit dari analisis SDS-PAGE dan Western blot (Song dan Lentz, 2012).
Pada uji in vitro dengan prosedur SIF, protein eCry3.1Ab dari rekombinan E. coli tercerna dalam 1 menit dari analisis SDS PAGE dan Western blot (Seastrum, 2010). Protein mCry3A yang terkandung pada MCRY3A-0102 dan MCRY3A-SF-0106 tercerna secara cepat dan tidak terdeteksi setelah 5 menit dari analisis SDS PAGE dan Western blot (Song dan Graser, 2006). Protein PAT tercerna kurang dari 5 menit dan tidak terdeteksi dari analisis SDS PAGE atau Western blot (Song dan Winslow, 2010).
Berdasarkan uji kecernaan in vitro melalui SGF dan SIF dapat disimpulkan bahwa protein yang terkandung pada Jagung PRG event MZIR098 tercerna cepat pada lambung dan usus mamalia seperti jagung non-PRG.
III.2.3 Uji toksisitas oral akut protein eCry3.1Ab, mCry3A, dan PAT III.2.3.1 Protein eCry3.1Ab
Uji toksisitas oral akut terhadap protein eCry3.1Ab dilakukan dengan menggunakan protein rekombinan eCry3.1Ab yang diproduksi dari bakteri E. coli dengan tingkat kemurnian 89,6%, yang telah diuji sebelumnya secara biokimia dan fungsional sepadan dengan protein eCry3.1Ab yang dihasilkan dari tanaman Jagung PRG event MZIR098 (Syngenta Seed, Inc., 2015). Pengujian toksisitas ini dilakukan dengan menggunakan mencit strain Crl:CD-1 (ICR) berumur 49 hari
7
berasal dari Charles River Laboratories, Inc., Raleigh, NC, AS yang terlebih dahulu diadaptasikan selama 17 hari dan dipelihara sesuai standar The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
Kelompok perlakuan dan kontrol masing-masing terdiri atas 5 ekor mencit jantan dan 5 ekor mencit betina. Mencit pada kelompok perlakuan diberi cekokan protein dengan dosis tunggal 2.232 mg/kg BB materi uji yang dilarutkan dalam CMC 0,5 % atau setara dengan 2.000 mg/kg BB bahan aktif protein eCry3.1Ab (OECD, 2001). Untuk mencit pada kelompok kontrol diberi cekokan larutan CMC 0,5% dengan volume cekokan yang sama (pada kelompok perlakuan) yaitu 10 ml/kg BB. Pengamatan pada mencit dilakukan setiap hari terhadap gejala klinis, jumlah konsumsi pakan, dan berat badan. Pada hari ke-14, semua mencit diterminasi dengan karbondioksida dan dilakukan nekropsi untuk pemeriksaan patologi anatomi secara makroskopik dan mikroskopik. Hasil pengamatan selama 14 hari menunjukkan semua mencit pada kelompok perlakuan dan kontrol mampu bertahan (tidak ada kematian), tidak ditemukan kelainan klinis, tidak ada pengaruh berat badan dan jumlah konsumsi pakan dari pemberian protein eCry3.1Ab. Dari pemeriksaan patologi secara makroskopik dan mikroskopik juga tidak ditemukan adanya perbedaan antara mencit pada kelompok perlakuan dan kontrol (Korgaonkar, 2009).
Dari hasil uji toksisitas tersebut dapat disimpulkan bahwa protein eCry3.1Ab tidak bersifat toksik. III.2.3.2 Protein mCry3A
Uji toksisitas oral akut terhadap protein mCry3A dilakukan dengan menggunakan materi uji berupa protein rekombinan MCRY3A-0102 yang diproduksi dari bakteri E. coli yang mengandung protein mCry3A dengan tingkat kemurnian 90,3% (Syngenta Seeds, Inc., 2003). Pengujian toksisitas oral akut ini dilakukan di Laboratorium Central Toxicology Laboratory Alderley Park, Macclesfield, Cheshire, UK yang menerapkan GLP. Percobaan ini menggunakan 20 ekor mencit strain APfCD1 berumur sekitar 8–9 minggu berasal dari Rodent Breeding Unit, Alderley Park,
Macclesfield, Cheshire, UK yang diadaptasikan minimal selama 5 hari sebelum perlakuan. Setiap kelompok perlakuan dan kontrol terdiri atas 10 ekor mencit, yaitu 5 ekor jantan dan 5 ekor betina (Johnson, 2003).
Mencit pada kelompok perlakuan dipuasakan selama 3,5 jam sebelum diberi cekokan dosis tunggal 2.632 mg materi uji/kg BB mencit (ekuivalen dengan 2.377 mg protein mCry3A/kg BB). Mencit pada kelompok kontrol diberi cekokan berupa larutan aqueous methylcellulose 1% (w/v). Pengamatan dilakukan selama 14 hari terhadap gejala klinis, jumlah konsumsi pakan, dan berat badan. Pada akhir percobaan, semua mencit diterminasi dengan halothane dan dilakukan nekropsi untuk pemeriksaan makroskopik dan mikroskopik. Hasil pengujian menunjukkan tidak terdapat kelainan klinis, kematian pada mencit, perbedaan berat badan, dan perbedaan konsumsi pakan antara kelompok perlakuan dan kontrol, serta tidak ada kelainan pada organ mencit yang diberi perlakuan protein mCry3A.
Berdasarkan hasil uji toksisitas tersebut dapat disimpulkan bahwa protein mCry3A tidak bersifat toksik.
III.2.3.3 Protein PAT
Uji toksisitas oral akut terhadap protein PAT dilakukan dengan menggunakan materi uji berupa protein rekombinan PAT yang diproduksi dari bakteri E. coli yang mengandung protein PAT dengan tingkat kemurnian 85,9% (w/v). Percobaan toksisitas oral akut dilakukan dengan menggunakan 20 ekor mencit strain Crl:CD-1 (ICR) yang berasal dari Charles River Laboratories,
8
Inc., Portage, MI, AS. Mencit berumur sekitar 52 hari dan diadaptasikan selama 18 hari sebelum perlakuan sesuai standar The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
Kelompok perlakuan yang terdiri atas 5 ekor mencit jantan dan 5 ekor mencit betina diberi cekokan protein PAT dengan dosis tunggal sebesar 2.000 mg/kg BB (setara dengan 2.328 mg materi uji/kg BB). Sementara, mencit pada kelompok kontrol diberi cekokan berupa larutan CMC 0,1% dengan dosis 10 ml/kg BB. Pengamatan dilakukan selama 14 hari terhadap adanya gejala klinis pada mencit, perubahan berat badan, jumlah pakan yang dikonsumsi, dan kematian. Pada hari terakhir percobaan, semua mencit diterminasi dan dilakukan nekropsi untuk pemeriksaan patologi anatomi secara makroskopik dan mikroskopik.
Hasil pengamatan menunjukkan tidak terdapat kelainan klinis, kematian pada mencit, perbedaan berat badan, dan perbedaan konsumsi pakan antara kelompok perlakuan dan kontrol, serta dari pemeriksaan postmortem tidak ditemukan adanya kelainan pada organ tertentu yang berhubungan dengan efek toksisitas dari protein PAT (Hosako, 2013).
Berdasarkan hasil uji toksisitas tersebut dapat disimpulkan bahwa protein PAT tidak bersifat toksik.
III.3 Studi Pakan
Studi pakan dilakukan untuk mengetahui pengaruh pemberian ransum yang mengandung biji Jagung PRG event MZIR098 dibanding dengan biji jagung non-PRG terhadap performa ayam broiler.
Pengujian ini dilakukan selama 42 hari menggunakan 600 ekor ayam broiler berasal dari Sanderson Farms Hatchery, Kinston, NC, AS. Sebanyak 300 ekor ayam jantan dan 300 ekor ayam betina dibagi menjadi 5 kelompok perlakuan masing-masing diberi ransum yang berbeda, yaitu (1) ransum mengandung biji jagung PRG event MZIR098; (2) ransum mengandung biji jagung non-PRG near isogenic; (3) ransum mengandung biji jagung non-PRG (referen 1); (4) ransum mengandung biji jagung non-PRG (referen 2); (5) ransum mengandung biji jagung non-PRG (referen 3). Penyusunan formula ransum untuk tiga tahap pertumbuhan ayam (starter, grower, dan finisher) disesuaikan dengan standar yang direkomendasikan oleh Nutritional Requirements of Poultry (NRC, 1994). Penggunaan biji jagung (event MZIR098, PRG near isogenic, dan non-PRG) yang dicampurkan pada ransum, yaitu 43,0% untuk masa starter, 46,8% untuk masa grower, dan 56,8% untuk masa finisher. Pengamatan dilakukan terhadap konsumsi dan konversi pakan, bobot badan akhir, daya hidup, dan berat karkas ayam broiler. Hasil yang diperoleh menunjukkan tidak ada perbedaan nyata pada performa ayam broiler antara kelompok yang diberi pakan mengandung biji Jagung PRG event MZIR098, biji jagung non-PRG near isogenic, dan biji jagung non-PRG (Stafford, 2017).
Dapat disimpulkan bahwa pakan yang mengandung biji Jagung PRG event MZIR098 tidak mempunyai dampak negatif terhadap ayam broiler.
IV. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil pengkajian tentang informasi genetik, kesepadanan substansial, dan toksisitas disimpulkan hal-hal sebagai berikut:
1. Jagung PRG event MZIR098 mengandung satu kopi sisipan T-DNA yang berisi kaset gen mcry3A, ecry3.1Ab, dan pat-08, tidak mengandung sekuen backbone dari plasmid
9
transformasi pSYN17629, dan stabil sampai lima generasi selfing (F5) dan F1 hibrida, serta
diwariskan mengikuti hukum Mendel.
2. Jagung PRG event MZIR098 sepadan secara substansial dengan jagung non-PRG dan tidak bersifat toksik.
3. TTKH Bidang Keamanan Pakan PRG menilai bahwa Jagung PRG event MZIR098 yang diajukan adalah aman untuk dikonsumsi sebagai bahan pakan dan pakan.
4. Apabila di kemudian hari ditemukan data dan informasi baru yang tidak sesuai dengan data keamanan pakan yang diperoleh hingga saat ini, status keamanan pakan Jagung PRG event MZIR098 perlu dikaji ulang.
5. Apabila setelah ditetapkan aman pakan, kemudian Jagung PRG event MZIR098 terbukti menimbulkan dampak negatif terhadap kesehatan hewan, pemohon wajib melakukan tindakan pengendalian dan penanggulangan, serta menarik Jagung PRG event MZIR098 dari peredaran.
6. Jagung PRG event MZIR098 tidak boleh dibudidayakan sampai ditetapkan aman lingkungan. DAFTAR PUSTAKA
Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., and Lipman, D.J. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acid Research, 25:3389–3402.
Bailey, K. 2016. eCry3.1Ab: Assessment of amino acid sequence similarity to known or putative toxin. Report number: SSB-128-16 A3. Syngenta Crop Protection, LLC, 3054 East Cornwallis Road, Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA.
Bauman, P.A. 2016. PAT (pat): Assessment of amino acid sequence similarity to known or putative toxin. Report number: SSB-108-16 A1. Syngenta Crop Protection, LLC, 3054 East Cornwallis Road, Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA.
Bevan, M., Barnes, W.M., and Chilton, M.D. 1983. Structure and transcription of the nopaline synthase gene region of T-DNA. Nucleic Acids Research, 11:369–385.
Cade, R. 2015a. Mendelian inheritance analysis of event MZIR098 maize, final report amendment 1. Report number: TK0117487 A1; Task number: TK0117487. Syngenta Crop Protection, LLC, 3054 East Cornwallis Road Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA.
Cade, R. 2015b. Plasmid pSYN17629, plasmid lineage analysis and sequence assessment. Report number: TK0117490 A1; Task number: TK0117490. Syngenta Crop Protection, LLC, 3054 East Cornwallis Road Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA.
Chen, E. and Stacy, C. 2007. Modified Cry3A toxins and nucleic acid sequences coding therefor. Syngenta Participations Ag, Assignee. US Patent number: 7,030,295 B2. Washington, D.C.: US Patent Office.
Christensen, A.H., Sharrock, R.A., and Quail, P.H. 1992. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Molecular Biology, 18:675–689.
Geiser, M., Schweizer, S., and Grimm, C. 1986. The hypervariable region in the genes coding for entomopathogenic crystal proteins of Bacillus thuringiensis: nucleotide sequence of the kurhd1 gene of subsp. kurstaki HD-1. Gene, 48:109–118.
Hohn, T., Stavolone, L., De Haan, P., Ligon, H., and Kononova, M. 2007. Cestrum yellow leaf curling virus promoters. Syngenta Participations AG, Asignee. US Patent number: 7,166,770. Washington D.C.: US Patent Office.
Hosako, H. 2013. PAT: acute oral (gavage) toxicity study in mice with a 14-day observation period. Company Report. Performing laboratory: WIL Research, 1407. George Road, Ashland, OH 44805-8946, USA. Laboratory project ID: Report number: WIL-639181; Study
10
number: WIL-639181; Task number: TK0117267. Syngenta Seeds, Inc., 3054 East Cornwallis Road, PO Box 12257, Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA.
ILSI. 2014. International Life Sciences Institute crop composition database. V.5.0. [Online] Available from: https://www. Cropcomposition.org;search parameters: crop type=”CORN_Field”, tissue type=”FORAGE” or “GRAIN”, crop year=”All”, country = “All”, and regions =”All” (Accessed 6 October 2014).
Ingham, D.J., Beer, S., Money, S., and Hansen, G. 2001. Quantitative real-time PCR assay for determining trangene copy number in transformed plants. BioTechniques, 31:132–140. Johnson, I. 2003. Acute oral toxicity study of modified Cry3a protein (MCRY3A-0102) in the
mouse. Company Report. Performing laboratory: Central Toxicology Laboratory, Alderley Park, Macclesfield, Cheshire, UK, SK10 4TJ. Laboratory Project ID: CTL/AM7301/Regulatory/Report Study number: AM7301. Syngenta Seeds, Inc., Field Crops, NAFTA, PO Box 12257, Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA.
Joseph, R. and Graser, G. 2005. In vitro digestibilty of modified Cry3A protein (MCRY3A-0102 and IAPMIR604-0103) under simulated mammalian gastric conditions. Report number: SSB-029-03A1. Syngenta, USA.
Juba, N. 2015. Compositional analysis of forage and grain from MZIR908 maize treated with trait-specific herbicide grown during 2013 in the USA. Report number: TK0117452_SR_01. Syngenta Seeds, Inc., 3054 East Cornwallis Road, PO Box 12257, Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA.
Komari, T., Hiei, Y., Saito, Y., Murai, N., and Kumashiro, T. 1996. Vectors carrying two separate TDNAs for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection markers. The Plant Journal, 10:165–174. Korgaonkar, C.K. 2009. eCry3.1Ab-0208, single-dose oral (gavage) toxicity study in mice with a
14-day observation period. Company Report. Performing laboratory: WIL Research Laboratories, LLC, 1407 George Road Ashland, OH 44805-8946, USA. Laboratory project ID: Report number: WIL-639031; Study number: WIL-639031; Task number: T008660-07. Syngenta Crop Protection, Inc., 410 Swing Road Greensboro, NC 27409, USA.
Koziel, M.G., Desai, N.M., Lewis, K.S., Kramer, V.C., Warren, G.W., Evola, S.V., Crossland, L.D., Wright, M.S., Merlin, E.J., Launis, K.L., Rothstein, S.J., Bowman, C.G., Dawson, J.L., Dunder, E.M., Pace, G.M., and Suttie, J.L. 1997. Synthetic DNA sequence having enhanced insecticidal activity in maize. Ciba-Geigy, Assignee. US Patent number: 5,625,136. Washington, D.C.: US Patent Office.
Lee, T.J. 2016. Event MZIR098 maize, genetic stability analysis of F2, F3, F4, F5, and F1
generations. Final Report Amendment 2 replaces MRID number: 497067-05; Report number: TK0117501 A2; Task number: TK0117501. Syngenta Crop Protection, LLC, 3054 East Cornwallis Road 410 Swing Road, PO Box 12257 Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA.
Murray, E.E., Lotzer, J., and Eberle, M. 1989. Codon usage in plant genes. Nucleic Acids Research, 17:477–498.
NCBI. 2016. Entrez protein database. National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA [Online] Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/ entrez?db=protein (Accessed March 2016).
Negrotto, D., Jolley, M., Beer, S., Wenck, A.R., and Hansen, G. 2000. The use of phosphomannose-isomerase as a selectable marker to recover transgenic corn plants (Zea mays L.) via Agrobacterium transformation. Plant Cell Reports, 19:798–803.
NRC. 1994. Nutritional requirements of poultry. Ninth revised edition. National Academy Press, Washington, D.C., USA.
Odell, J.T., Nagy, F., and Chua, N.H. 1985. Identification of DNA sequences required for the activity of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature, 313:810–812.
11
OECD. 2001. OECD guideline test guideline 420 acute oral toxicity: fixed dose procedure. http://iccvam.niehs.nih.gov/SuppDocs/FedDocs/OECD/OECD_GL420.pdf.
Seastrum, L. 2010. In vitro digestibilty of eCry3.1Ab protein as contained in test substance ECRY3.1Ab-0208 under simulated mammalian intestinal conditions. Report number: SSB-015-09 AI. Syngenta Biotechnology, Inc., USA.
Sekar, V., Thompson, D.V., Maroney, M.J., Bookland, R.G., and Adang, M.J. 1987. Molecular cloning and characterization of the insecticidal crystal protein gene of Bacillus thuringiensis var. tenebrionis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 84:7036–7040.
Song, S. 2010. In vitro digestibilty of eCry3.1Ab protein under simulated mammalian gastric conditions. Report number: TK0028111. Syngenta, USA.
Song, S. and Graser, G. 2006. In vitro digestibilty of modified Cry3A protein from test substances MCRY3A-0102 and MCRY3A-SF-0106 under simulated mammalian intestinal conditions. Report number: SSB-169-06. Syngenta Biotechnology, Inc., 3054 East Cornwallis Road, PO Box 12257 Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA.
Song, S. and Lentz, E. 2012. In vitro digestibilty of phosphinothricin acetyltransferase (PAT) protein under simulated mammalian gastric conditions. Report number: TK0062551. Syngenta, USA.
Song, S. and Winslow, S. 2010. In vitro digestibilty of phosphinothricin acetyltransferase (PAT) protein under simulated mammalian Intestinal conditions. Syngenta Seeds, Inc., 3054 East Cornwallis Road, PO Box 12257, Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA.
Stafford, J.M. 2017. Evaluation of the MZIR098 transgenic maize grain in a broiler chicken feeding study. Final Report. Report number: 1781.4145; Study number: 1781.4145; Task number: TK0253663. Syngenta Crop Protection, LLC, 410 Swing Road, PO Box 18300, Greensboro, NC 27419-8300, USA.
Syngenta Seeds, Inc. 2003. Characterization of modified Cry3A test substance MCRY3A-0102 and certificate of analysis. Syngenta Seeds Biotechnology Report number: SSB-025-03. Syngenta Seeds, Inc., 3054 East Cornwallis Road, PO Box 12257, Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA.
Syngenta Seeds, Inc. 2015. Comparison of eCry3.1Ab and mCry3A proteins produced in recombinant Escherichia coli with eCry3.1Ab and mCry3A proteins produced in event MZIR098 derived maize plants. Syngenta Seeds Biotechnology Report number: TK0117480. Syngenta Seeds, Inc., 3054 East Cornwallis Road, PO Box 12257, Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA.
Walters, F.S., deFontes, C.M., Hart, H., Warren, G.W., and Chen, J.S. 2010. Lepidopteran-active variable-region sequence imparts coleopteran activity in eCry3.1Ab, an engineered Bacillus thuringiensis hybrid insecticidal protein. Applied and Environmental Microbiology, 76:3082– 3088.
Wohlleben, W., Arnold, W., Broer, I., Hillemann, D., Strauch, E., and Pühler, A. 1988. Nucleotide sequence of the phosphinothricin N-acetyltransferase gene from Streptomyces viridochromogenes Tü494 and its expression in Nicotiana tabacum. Gene, 70:25–37.
