DETEKSI SEROLOGI BEAN COMMON MOSAIC (BCMV)
DARI BENIH KACANG PANJANG (Vigna sinensis)
KOMERSIL DAN PETANI DI BALI
TRISNA AGUNG PHABIOLA, SP.,MSi
PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI
FAKULTAS PERTANIAN
DAFTAR ISI
DAFTAR ISI
BAB I. PENDAHULUAN ... 1
1.1 Latar Belakang ... 1
1.2 Tujuan Kusus ... 2
1.3 Manfaat Penelitian ... 2
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ... 2
2.1 Budidaya Tanaman Kacang Panjang ... 2
2.2 Hama dan Penyakit pada Tanaman Kacang Panjang ... 3
2.3 Virus BCMV ... 3
2.4 Deteksi BCMV... 5
BAB III. METODE PENELITIAN ... 6
3.1 Bahan dan Alat ... 6
3.2 Perbanyakan Inokulum BCMV ... 6
3.3 Penanaman Tanaman Uji ... 7
3.4 Inokulasi BCMV pada Lima Varietas Kacang Panjang ... 7
3.5 Pengamatan Gejala ... 7
3.6 Konfirmasi Infeksi Virus Melalui Pengujian Serologi ... 8
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 8
BAB V. KESIMPULAN ... 11
BAB I. PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Kacang panjang (Vigna sinensis L.) merupakan salah satu jenis tanaman yang sering ditemui di pasar tradisiaonal atau swalayan, menempati urutan ke -8 dari 20 jenis sayuran yang dikonsumsi di Indonesia (Karsono 1997). Kacang panjang sebagai sumber vitamin dan mineral menjadi salah satu manfaat dalam upaya peningkatan gizi masyarakat. Kacang panjang banyak mengandung vitamin A dan vitamin C serta mengandung mineral terutama pada polong muda. Biji kacang panjang mengandung protein, lemak, dan karbohidrat, sehingga kacang panjang merupakan sumber protein nabati yang baik bagi manusia (Haryanto dkk., 1999).
Luas panen kacang panjang pada tahun 2011 mengalami penurunan menjadi 456.254 ton (BPS, 2012). Terjadinya fluktuasi kualitas dan kuantitas produksi dapat disebabkan oleh beberapa hal, salah satunya adalah penyakit tanaman, yang ditemui pada tanaman kacang panjang adalah penyakit mosaik yang disebabkan oleh beberapa jenis virus yang berasosiasi, diantaranya Bean common mosaic virus (BCMV), Cowpea aphid
born mosaic virus (CABMV) dan Cucumber mosaic cucumovirus (CMV) (Damayanti
dkk., 2009).
Salah satu penyakit penting pada tanaman kacang panjang yaitu penyakit dengan gejala mosaik yang disebabkan oleh BCMV yang baru-baru ini ditemukan pada pertanaman kacang panjang di daerah Bali. Infeksi BCMV menyebabkan kerugian sebesar 65.87% (Kuswanto dkk., 2007) dan BCMV dilaporkan sebagai salah satu penyebab mosaik kuning kacang panjang yang menginfeksi secara tunggal ataupun bersama CMV di Jawa Barat (Damayanti dkk., 2009).
Virus BCMV merupakan virus yang tergolong kedalam genus potivirus (400-800 nm)yang mempunyai kisaran inang yang cukup luas, dapat ditularkan oleh kutu daun secara non persisten (Sutic et al., 1999), dan bersifat tular benih (Udayashankar et al., 2010).Beberapa tanaman yang menjadi inang Potyvirus yaitu Capsicum frutescens, Capsicum annuum, Solanum tuberosum, Lycopersicon esculentum, Solanum melongena, Datura stramonium, Nicotiana spp, dan Chenopodium spp (Green et al., 1999). Namun infeksi BCMV pada tanaman lain selain kacang panjang belum banyak yang meneliti .
(Setyastuti, 2008). Pengendalian yang dapat dilakukan terhadap BCMV yaitu dengan pergiliran tanaman , mengendalikan vektor penyebab penyakit (kutu daun), dan dapat dilakukan dengan mencabut tanaman kacang panjang yang terinfeksi BCMV kemudian dibakar. Meskipun sudah dilakukan pengendalian terhadap BCMV , virus ini masih bertahan, karena virus ini memiliki inang alternatif. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui kisaran inang alternatif dari BCMV.
1.2. Tujuan Khusus
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui respon lima varietas kacang panjang (Vigna sinensis L.) yaitu KPK, Aura, Pusaka Hijau, Panah Merah dan benih petani terhadap infeksi BCMV dan mengetahui variasi gejala yang muncul.
1.3. Manfaat Penelitian
Manfaat yang diharapkan dari penelitian ini adalah pengetahuan dasar dalam menyusun strategi pengendalian penyakit mosaik dengan mengetahui berbagai respon tanaman kacang panjang yang sering digunakan oleh petani sehingga dapat digunakan varietas tahan.
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Budidaya Tanaman Kacang Panjang
Kacang panjang termasuk dalarn divisi Spermatophyta, kelas Angiospermae, subkelas Dicotyledonae, ordo Rosales, famili Leguminosae, genus Vigna, spesies Vigna
sinensis L. Budi daya kacang panjang dapat dilakukan di dataran rendah maupun dataran
panjang adalah penyulaman, penyiangan, penyiraman, pemangkasan cabang, dan pemupukan.Tanaman kacang panjang mulai berbunga pada umur 30 hari setelah tanam dan pemanenan polong kacang panjang dapat dilakukan setelah tanaman berumur 45 hari (Susila, 2005).
2.2 Hama dan Penyakit pada Tanaman Kacang Panjang
Kendala utama pada budidaya tanaman kacang panjang adalah adanya gangguan dari hama dan penyakit. Hama penting yang dilaporkan menyerang kacang panjang antara lain, tungau merah Tetranychus bimaculatus (Acarina: Tetranychidae), kutu kebul
Bemisia tabaci (Hemiptera : Aleyrodidae), penggerek polong Riptortus linearis
(Hemiptera: Alydidae), dan kutu daun Aphis craccivora (Hemiptera : Aphididae). Upaya yang banyak dilakukan untuk mengendalikan hama-hama tersebut adalah dengan melakukan pergiliran tanaman, melakukan pengendalian secara biologi dengan menggunakan musuh alaminya yaitu kumbang Scymnus sp. (Anwar dkk., 2005).
Penyakit yang menyerang tanaman kacang panjang diantaranya layu cendawan (Fusarium sp.), antraknosa (Colletotricum lindemuthianum), puru akar (Meloidogyne sp.), penyakit sapu (Cowpea Witches-broom Virus/Cowpea Stunt Virus), layu bakteri (Pseudomonas solanacearum) dan penyakit mosaik yang disebabkan oleh Bean common
mosaic potyvirus (BCMV), Bean yellow mosaic potyvirus (BYMV) dan Cowpea aphid
borne mosaic potyvirus (CABMV) (Anwar dkk.,2005).
2.3 Virus BCMV
BCMV termasuk ke dalam familia Potyviridae dan genus Potyvirus. Potyvirus merupakan kelompok virus tumbuhan terbesar yang diketahui saat ini (Agrios, 2005). Partikel BCMV mempunyai panjang 720 – 770 nm dan lebar 12 – 15 nm. Partikel virusnya terdiri dari 95% protein dan 5% RNA utas tunggal. Kestabilan virus dalam sap tanaman tergantung dari strain virus dan waktu infeksinya. Virus ini mempunyai titik panas inaktivasi 50 – 60oC (CABI, 2007). Potyvirus mempunyai partikel berbentuk batang lentur dan mengandung genom monopartit berupa RNA (ribonucleic acid) untai tunggal yang terdiri dari 9830 nukleotida (Nicolas and Laliberte, 1992).
pada nukleotida ke 9525- 9589 dari ujung 3’ genom Potyvirus dan diikuti oleh sikuen poliadenilasi (poly A) (Gambar 2.1).
Genom Potyvirus diekspresikan melalui translasi poliprotein dari genom virus. Poliprotein mengalami pemotongan menjadi protein fungsional dan struktural sesuai dengan gen yang disandikannya yang terjadi di dalam sitoplasma. Selama dan sesudah translasi terjadi pemotongan poliprotein oleh protease yang berasal dari ekspresi dari genom Potyvirus. Poliprotein yang diekspresikan oleh genom virus diproses menjadi 10 protein fungsional oleh tiga jenis enzim proteinase yang dihasilkan oleh virus itu sendiri (Hull, 2002).
BCMV dapat ditularkan secara mekanis melalui beberapa spesies kutu daun secara non persisten dan melalui benih. Adapun beberapa spesies kutu daun yang dapat menjadi vektor BCMV antara lain Aphis gossypii, A. craccivora, A. medicanigis, A.
rumicis, Hyalopterus atriplicis, Macrosiphum ambrosiae, M. pisi dan M. solanifolii
(Morales & Bos, 1988). Kutu daun menularkan virus ini secara non persisten, dimana kutu daun mendapat virus dengan mengisap tanaman yang terinfeksi hanya dengan waktu beberapa detik, kemudian kutu daun akan menularkan virus dengan cepat, setelah itu dia akan kehilangan virus dan tidak mampu lagi menularkan virus. virus ini juga ditularkan melalui penggunaan alat budidaya yang tidak steril sehingga ketika melukai tanaman lain dapat terinfeksi virus (Millah, 2007).
Tanaman yang terinfeksi secara sistemik menunjukkan gejala daun dengan pola mosaik, daun menggulung dan malformasi daun pada daun-daun muda. Secara umum tanaman yang diinokulasi dengan virus biasanya gejala akan muncul pada 7-10 hari setelah inokulasi (Djikstra & De Jager, 1998). Kisaran inang dari BCMV yaitu kalopogonium/kacang asu (Jawa) (Calopogonium mucuniodes), kacang ercis (Pisum
sativum), buncis (Phaseolus vulgaris L.) dan kacang tolo (Vigna unguiculata) (CABI,
2007). Pengendalian BCMV dapat dilakukan dengan menggunakan beberapa ekstrak tanaman. BCMV dilaporkan dapat ditekan dengan menggunakan ekstrak bunga
Clerodendrum japonicum (bunga pagoda), Mirabilis jalapa (bunga pukul empat), dan
Andrographis paniculata (sambiloto). Ekstrak bunga pagoda dan ekstrak bunga pukul
lain yang dapat dilakukan yaitu dengan menggunakan benih sehat, menghilangkan tanaman terinfeksi, menggunakan varietas tahan, dan penyemprotan insektisida untuk mengendalikan serangga vektor (Saleh, 1997).
2.4 Deteksi BCMV
Deteksi BCMV dapat dilakukan berdasarkan karakter biologi dan molekuler. Deteksi berdasarkan karakter biologi dapat dilakukan melalui pengujian kisaran inang dan tanaman indikator. Sedangkan deteksi menggunakan karakter molekuler umumnya dilakukan dengan dua cara yaitu berdasarkan sifat asam nukleat dengan PCR (Polymerase chain reaction)/RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase chain
reaction) dan berdasarkan sifat protein dengan uji serologi yaitu DIBA (Dot
Immunobinding assay) dan ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) (Foster and
Taylor, 1998).
Deteksi berdasarkan karakter biologi yaitu dengan pengujian kisaran inang dan tanaman indikator yaitu dilakukan dengan mengamati gejala penyakit yang muncul. Namun pengamatan terhadap gejala saja tidak cukup untuk menditeksi virus pada tanaman, karena beberapa virus dapat menimbulkan gejala yang sama pada tanaman yang sama, satu virus dapat menghasilkan variasi gejala tergantung strain virusnya. Selain itu suatu virus dapat menimbulkan gejala yang berbeda pada tanaman yang berbeda. Kondisi lingkungan dan iklim dapat berpengaruh terhadap tipe gejala yang muncul (Hull, 2002). Oleh karena itu perlu dilakukan cara mendeteksi virus secara akurat. Deteksi yang umum digunakan yaitu deteksi secara serologi yaitu dengan uji ELISA.
merupakan bagian dari antigen yang dapat dikenali oleh antibody atau bagian dari antigen yang dapat berinteraksi dengan antibody (Crowther, 1996).
ELISA memiliki 2 metode, yaitu direct ELISA (ELISA langsung) salah satunya adalah DAS-ELISA (direct double antibody sandwich), dan indirect ELISA (ELISA tidak langsung). Perbedaan metode ELISA tersebut yaitu pada direct ELISA enzim konjugat terdapat pada molekul immunoglobulin pertama yang langsung bereaksi dengan antigen. Sedangkan pada metode indirect ELISA enzim konjugat terdapat pada molekul immunoglobulin kedua yang bereaksi dengan antivirus. Untuk metode DAS-ELISA dalam satu sumuran plat terdapat dua antibody yang mengapit antigen yang berada ditengah (Crowther, 1996)
Beberapa kelebihan ELISA dibandingkan dengan uji serologi yang lain yaitu konsentrasi virus yang diperlukan untuk pendeteksian sangat rendah, antiserum yang diperlukan sedikit, sehingga sesuai untuk pengujian sampel skala besar dan hasil pengujiannya bersifat kuantitatif (Dijkstra and De jagger, 1998)
BAB III. METODE PENELITIAN
3.1 Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini berupa reagen DAS-ELISA, polybag, tanah subur, arang sekam, bufer fosfat, kapas steril, daun tanaman kacang panjang yang telah terinfeksi BCMV, tanaman uji yaitu tanaman kacang panjang komersial dengan jenis Panah Merah, KPK, Aura, Pusaka hijau dan benih petani.
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu mortar, timbangan digital, gunting, pinset, gelas ukur, erlenmeyer, pipet mikro, lemari es, kamera digital, kotak keranjang pembibitan (tray), plate Elisa, ELISA reider, dan alat tulis.
3.2 Perbanyakan Inokulum BCMV
3.3 Penanaman Tanaman Uji
Bibit tanaman uji ditanam dalam polybag yang berukuran 10 x 10 x 10 cm yang berisi campuran tanah dan arang sekam dengan perbandingan 1:2. Setiap polybag ditanami 3 benih kacang panjang dengan kedalaman 2 cm. Pada umur satu MST, dilakukan penyiangan dan pemilihan satu bibit terbaik untuk tahapan selanjutnya.Pemeliharan tanaman dilakukan dengan menyiram tanaman setiap hari hingga siap untuk pengujian respon ketahanan terhadap BCMV.
3.4. Inokulasi BCMV pada Lima Varietas Kacang Panjang
Inokulasi dilakukan secara mekanis menggunakan cairan perasan tanaman (sap) sakit. Sap dibuat dari daun tanaman yang terinfeksi BCMV. Daun yang terinfeksi digerus sebanyak 1 gr sampai halus didalam mortar dimana sebelumnya ditambahkan bufer fosfat (0.01M; pH 7.0) dengan perbandingan 1:5. Daun tanaman kacang panjang yang akan diinokulasi sebelumnya ditaburi dengan carborundum (600 mesh). Sap dioleskan pada permukaan daun dengan menggunakan kapas steril dimulai dari bagian pangkal daun ke ujung secara searah dengan tidak mengulangi pada daerah yang sama. Setelah pengolesan sap selesai, daun tanaman disiram dengan air mengalir untuk membersihkan sisa-sisa sap yang masih melekat. Tanaman yang sudah diinokulasi dipelihara dan dirawat sampai muncul gejala.
3.5 Pengamatan Gejala
Pengamatan secara kualitatif dilakukan dengan mengamati gejala yang muncul dari tanaman kacang panjang. Pengamatan dilakukan setiap hari selama dua bulan setelah dilakukan inokulasi. Pengamatan gejala dan lamanya masa inkubasi dilakukan selama 30 hari setelah inokulasi. Masing- masing tanaman uji terdiri atas 10 ulangan. Pengamatan persentase gejala timbul dihitung berdasarkan rumus berikut: (Zadocks & Schein, 1979).
Jumlah tanaman bergejala virus
Persentase tanaman bergejala virus =--- X 100% Populasi tanaman
3.6 Konfirmasi Infeksi Virus Melalui Pengujian Serologi.
Untuk mengkonfirmasi infeksi virus pada jaringan tanaman cabai dilakukan melalui uji ELISA sebagai berikut: Sebanyak 0,5 ul antiserum terhadap virus TMV, CMV dan ChiVMV (Agdia, USA) di campurkan ke dalam 100 ul coating buffer (0.1 g magnesium klorid, 0,2 g sodium azid, dan 97 ml dietanolamin dilarutkan dalam 1000 ml dengan ph akhir 9,8) dan dimasukkan ke plat mikrotiter sebanyak 100 ul tiap sumuran plat kemudian diinkubasikan pada suhu 37ºC selama 2 jam atau -4ºC selama semalam. Selanjutnya plat mikrotiter dicuci sebanyak 6 kali dengan bafer PBST 1X (8 g sodium klorid, 1,15 g sodium fosfat dibasic, 0,2 g potassium fosfat monobasic, dan 0,5 g tween-20 yang dilarutkan dalam 1 l air dengan pH 7,4). Sebanyak 0,1 g jaringan daun pisang bergejala dilumatkan dengan mortar dalam 1 ml general extract buffer ( 1,3 g sodium sulfite, 20 g polyvinylpyrolidone, 0,2 g sodium azide, 2 g powdered egg (chiken) albumin, dan 20 g tween-20 yang dilarutkan ke dalam 1 l PBST 1X dengan pH 7,4. Cairan perasan (sap) yang dihasilkan diambil sebanyak 100 ul kemudian dimasukkan ke dalam sumuran plat mikrotiter dan kemudian diinkubasikan selama waktu seperti tahap sebelumnya. Selanjutnya plat mikrotiter dicuci lagi sebanyak 6 kali dengan PBST 1X. Setelah dicuci dengan bufer PBST 1X, pada sumuran yang sama diisi 100 ul enzim konjugat yang sudah diencerkan dengan buffer ECI (2 g bovine serum albumin, 20 g
polyvinylpyrrolidone, dan 0,2 g sodium azide yang dilarutkan dalam 1 l PBST 1X dan ph
7,4) dan diinkubasi pada 37ºC selama 2 jam. Setelah pencucian, sumuran kemudian ditambah 100 ul larutan PNP (1 mg/ml p-nitrophenyl phosphate dalam 10%
triethanolamine, pH 9,8) dan diinkubasi sampai muncul warna kuning (+ 30 menit). Nilai
absorban diukur pada 405 nm dengan ELISA Reader.
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
Tabel 1. Hasil inokulasi mekanik BCMV pada beberapa varieatas kacang panjang.
Kejadian Penyakit adalah proporsi tanaman bergejala/tanaman yang diinokulasi
m = mosaik
f = malpormasi
Rata-rata nilai absorbansi (405 nm) sampel beberapa jenis kacang panjang yang biasa ditanam petani di Bali yang sebelumnya diinokulasi dengan sumber inokulum yang menginfeksi kacang panjang di lapangan dengan gejala vein banding mosaic pada reaksi ELISA dengan menggunakan antiserum Potyvirus
Kontrol negative 0.144 0.137 0.141
Bufer 0.058 0.056 0.058
Kontrol positif 0.346 0.342 0.344
Keterangan: Reaksi ELISA adalah positif apabila nilai absorbansi sampel sama dengan 2x atau lebih besar dari nilai absorbansi control negatif atau buffer.
Konsentrasi BCMV dipresentasikan oleh nilai absorban hasil uji ELISA relatif tinggi pada semua varietas kacang panjang yang diinokulasi. Hal ini menandakan bahwa semua varietas kacang panjang memberikan keleluasaan BCMV untuk bereplikasi optimal, tidak ada satupun varieatas yang mempunyai sifat ketahanan berupa penghambatan replikasi virus.
(HIS) yaitu pada varietas panah merah, sedangkan gejala paling lama munculnya pada varietas KPK (Tabel 1). Perbedaan masa inkubasi dapat disebabkan oleh sifat dan kecepatan perkembangan virus dalam jaringan serta tingkat kerentanan tanaman terhadap infeksi virus.Masa inkubasi erat kaitannya dengan kemampuan virus menyebar dari tempat inokulasi ke bagian tanaman lainnya dan kemudian menunjukkan gejala. Virus mampu menyebar ke bagian tanaman yang masih muda dengan cepat karena tanaman muda belum memiliki system pertahanan yang kuat terhadap infeksi virus.
Kejadian Penyakit pada lima varietas mencapai 70-100 % (Tabel 1). Tingginya kejadian penyakit tersebut menunjukkan bahwa kelima varietas kacang panjang tidak tahan terhadap infeksi BCMV. Hasil penelitian ini memastikan bahwa varietas kacang panjang yang dibudidayakan di Bali sangat rentan terhadap BCMV. Hasil ini menjadi salah satu faktor terjadinya epidemi penyakit mosaik vein banding di daerah ini.
(a) (b) (c)
(d)
Gambar 5.1 Gejala serangan BCMV pada tanaman kacang panjang. (A) mosaik ringan; (B) mosaik sedang; (C) mosaik berat dan daun mengecil; (D) malformasi daun dan pengerdilan tanaman; (E) daun tanaman sehat (Susetio, 2014). Menurut Matthews (1991) factor genetic inang mempengaruhi tipe gejala tanaman yang terinfeksi, sedangkan Agrios (2005) berpendapat bahwa factor genetic tidak hanya mempengaruhi tipe gejala tetapi juga variasi dalam kerentanan terhadap pathogen yang disebabkan perbedaan jenis dan jumlah gen yang mengatur ketahanan pada setiap jenis varietas.
BAB V. KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA
Agrios, GN. 1997. Plant Pathology. Ed ke-4. New York:Academic Press Agrios, GN. 2005. Plant Pathology. Ed ke-5. New York:Academic Press
Anwar, A, Sudarsono, S. Ilyas, 2005. Indonesian Vegetable Seeds: Current Condition and Prospects in Business of Vegetable seeds. Bul Agron 33: 38-47.
Bos, L.1994. Pengantar Virology Tumbuhan. Penerjemah Triharso. Gajah Mada University Press.
Bos, L. 1990. Pengantar virology tumbuhan. Triharso, Penerjemah.Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. Terjemahan dari: Introduction to Plant Virology. [BPS] Badan Pusat Statistik, 2012. Produksi sayuran di Indonesia. Jakarta [ID]: Badan
Pusat Tersedia pada: http://www.bps.go.id /tab_sub/view.php.
CABI [Central of Agricultural and Biosciences International]. 2005. Corp Protection Compendium. CAB International, Wallingford.
Damayanti, T.A.,O.J. Alibi, R.A., Naidu, dan A. Rauf. 2009. Severe Outbreak of a Yellow Mosaic Disease on the Yard Long Bean in Bogor, West Java. Hayati
Journal of Biosciences 16: 78-82.
Djikstra, J. and De Jegger. 1998. Practical Plant Virology: protocol and Exercise. Boston: Springer.
Fraser, R.S.S. 1998. The Genetic of Plant Virus Interaction Implication for Plant Breeding. Euphytica 63:175-185.
Gibbs A.J., and B.D. Harrison. 1976. Plant Virology: The Principles. London: Edwad Arnold.
Matthews, R.E.F. 1992. Fundamentals of plant virology.Academic Press Inc. San Diego. 403p
Matthews, R.E.F. 2002. Plant Virologi.4thEd.Academic Press. San Francisco.
Morales, F.J., and Bos L. 1988.Bean Common Mosaic Virus.Description of Plant Viruses 37.
Setyastuti, L. 2008. Tingkat Ketahanan Sembilan Kultivar Kacang Panjang terhadap Infeksi Bean Common Mosaic Virus (BCMV). [skripsi]. Bogor: Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Suryadi, Luthfy, Y. Kusandriani, dan Gunawan. 2003. Karakteristik dan Deskripsi Plasma Nutfah Kacang Panjang. Buletin Plasma Nutfah 9(1): 1-10.
Susila, A.D. 2005. Panduan Budidaya Tanaman Sayuran. Bogor: IPB Press. Sutic, D.D., R.E. Ford, and M.T. Tosic. 1999. Handbook of Plant Virus Diseases.
CRC Press: 174-176.
Udayashankar, A.C., S.C. Nayaka, H.B. Kumar, C.N. Mortensen, H.S. Shetty, and H.S. Prakash. 2010. Establishing Inoculum Threshold Levels for Bean Common
Mosaic Virus Strain Blackeye Cowpea Mosaic Infection in Cowpea Seed. African Journal of Biotechnology. 9(53):8958-8969.
Walkey David, G.A. 1991. Applied Plant Virology.Ed ke-2. London: Chapman and Hall.
