LAPORAN LENGKAP PRAKTIKUM
GENETIKA DAN BIOLOGI MOLEKULER
(ELEKTROFORESIS DNA
(SDS-PAGE)
)
Disusun oleh:
NAMA : LASINRANG ADITIA NIM : 60300112034
KELAS : BIOLOGI A KELOMPOK : V (Lima)
LABORATORIUM BIOLOGI
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
LEMBAR PENGESAHAN
Laporan lengkap praktikum Genetika dan Biologi Molekuler dengan judul
“Elektroforesis DNA (SDS-PAGE)” yang disusun oleh:
Nama : Lasinrang Aditia Nim : 60300112034 Kelas : Biologi A Kelmpok : V (lima)
Telah diperiksa oleh Kordinator Asisten / Asisten dan dinyatakan diterima.
Samata-Gowa, Desember 2014
Kordinator Asisten Asisten
(Muhammad Alamsyah) (Risnawati) 60300110 60300111059
Mengetahui, Dosen Penanggung Jawab
A. Tujuan Praktikum
Adapun tujuan dilakukannya praktikum ini adalah untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengkarakterisasi, dan purifikasi dari molekul DNA atau RNA dengan elektroforesis SDS-PAGE.
B. Dasar Teori
Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikel-partikel listrik. Elektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik (titik isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari molekul. Molekul terlarut dalam medan listrik bergerak atau migrasi dengan kecepatan yang ditentukan oleh rasio muatan dan massa. Sebagai contoh jika dua molekul mempunyai massa dan bentuk yang sama, molekul dengan muatan lebih besar akan bergerak lebih cepat ke elektrode. Bila arus listrik dialirkan pada suatu medium penyangga yang telah berisi protein plasma maka komponen-komponen protein tersebut akan mulai bermigrasi. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer (Magdeldin, 2012).
Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode). Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatannya sehingga pergerakan molekul-molekul tersebut pada suatu fase diam (stationary phase) dalam sebuah medan listrik akan berbeda-beda. Oleh karena partikel sol bermuatan listrik, maka partikel ini akan bergerak dalam medan listrik. Kemampuan perpindahan pergerakan muatan molekul tersebut menuju ke arah kutub yang berlawanan merupakan suatu parameter kecepatan dalam proses elektroforesis yang dinyatakan sebagai mobilitas elektroforetik (Lisdiyanti, 1997). Teknik elektroforesis dapat dibedakan menjadi dua cara, yaitu : elektroforesis larutan dan elektroforesis daerah. Pada teknik elektroforesis larutan, larutan penyangga yang mengandung makro-molekul ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan dialiri arus listrik. Kecepatan migrasi dari makro-molekul diukur dengan jalan melihat terjadinya pemisahan dari molekul (terlihat seperti pita) di dalam pelarut. Sedangkan teknik elektroforesis daerah adalah menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi sebagai media penunjang yang berisi (diberi) larutan penyangga. Media penunjang yang biasa dipakai adalah gel agarose, gel pati, dan kertas sellulose poliasetat (David, 2009).
C. Waktu dan Tempat
Adapun waktu dan tempat dilaksanakannya praktikum ini adalah sebagai berikut:
Hari/tanggal : Senin/15 Desember 2014 Waktu : 08.00-10.00 WITA
Tempat : Laboratorium Genetika dan Molekuler Lantai II Fakultas Sains dan Teknologi
D. Alat dan Bahan
a. Alat
Adapun alat yang digunakan pada percobaan ini yaitu beaker glass (10, 250, 500, dan 1000 ml), sarung tangan, spatula, batang pengaduk, gelas ukur, erlenmeyer, aluminium foil, pipet ukur, pipet, timbangan digital, mikropipet, sentrifuge, refrigator, pH meter, eppendorf, masker, power supply, plakon, perangkat elektroforesis SDS-PAGE dan kamera digital.
b. Bahan
Adapun bahan yang digunakan pada percobaan ini yaitu ekstrak antigen OMP, amonium persulfat (APS), akrilamid, aquadest steril, bis-akrilamid, SDS, Tris base, TEMED, glysin, b-mercapetanol, metanol, NaCl, asam asetat glasial, bromofenol biru, gliserol, coomassie briliant blue R-250 (CBB R250), marker protein, dan Tris-HCL.
E. Cara Kerja
Adapun cara kerja pada percobaan ini yaitu: 1. Persiapan Gel
Membersihkan plat kaca dengan aquadest dan etanol (70%)
Menyusun lempeng kaca serta spacer dan menutup celah diantaranya menggunakan agar 2% secukupnya
Menyiapkan gel poliakkrilimide-SDS 10%
Menuang campuran gel pemisah ke dalam ruang antara lempeng kaca dan meneteskan isobutanol dan
2. Persiapan sampel-sampel protein
Setelah gel pemisah berpolimerisasi, menuangkan campuran gel penumpuk di atasnya dan menyiapkan
sisir plastik (pembentuk sumur sampel)
Setelah gel penumpuk berpolimerisasi, lepaskan sisir dari bagian atas dan klem serta spacer bagian bawah
Letakkan lempeng kaca yang berisi gel secara vertikal pada alat elektroforesis dan klem. Isi tempat dapar dengan dapar elektroda. Singkirkan gelembung udara
pada bagian bawah gel
Memakai sarung tangan dan teknik-teknik keselamatan laboratorium
Memasukkan semua tab ung ke dalam waterbath selama 5 menit setelah itu mensentrifuse semua tabung
selama 3 menit dengan kecepatan 14.000 rpm Menyiapkan 3 tabung mikrosentrifus dan menandainya, menambanhkan 450 ml buffer sampel
dan 250 ml b-merkaptoetanol ke setiap tabung tersebut. Transfer 50 ml sampel protein ke
masing-masing tabung
3. Loading and Running the Gel
4. Pewarnaan Gel
F. Hasil Pengamatan
Adapun hasil yang diperoleh dari pengamatan yaitu sebagai berikut ini:
No Gambar Keterangan
1. Mengencerkan buffer dengan konsentrasi tertentu. Memasukkan 10 ml sampel protein ke dalam sumur
Hubungkan alat elektroforesis dengan power supply. Jalankan elektroforesis selama 4 jam
Setelah waktu untuk menjalankan pemisahan protein selesai, matikan power supply dan melepaskan kabel
dari elektroforesis
Mengangkat spacer pada kedua sisi lempeng kaca, kemudian pisahkan lempeng kaca dari gel
Memindahkan ke tempat pencui dan mengganti larutan pencuci beberapa kali hingga warna latar memudar dan pita-pita protein terlihat jelas dan terakhir menfoto
2. Menambahkan agarosa.
3. Malarutkan agarosa.
4. Mendinginkan larutan.
5. Mempersiapkan cetakan gel agarosa.
6. Menuang larutan ke dalam cetakan.
8. Menyiapkan alat elektroforesis.
9. Memasukkan sampel ke dalam sumur gel agarosa.
10. Memasang tutup pengaman.
11. Menghubungkan alat elektroforesis ke
Power supply dan menjalankannya.
12.
Melepaskan semua kabel dari alat elektroforesis dan membuka penutup
pengaman.
13.
Memasukkan gel hasil elektroforesis ke dalam suatu wadah yang berisi
14. Menambahkan Ethidium Bromida (EtBr) ke dalam wadah tersebut.
15.
Menggoyangkan wadah hingga seluruh EtBr tercampur dengan
larutan.
16. Mendiamkan selama 5-10 menit.
17. Menyiapkan sinar UV-Transilluminator.
18.
Mengangkat gel ke atas UV-Transilluminator. Meletakkan dengan
19.
Meletakkan kamera di atas hood. Memotret fragmen DNA hasil elektroforesis tanpa menggunakan
flash pada kamera.
20 Hasil dari pewarnaan gel.
G. Pembahasan
Elektroforesis merupakan metode analisis fisika berdasarkan kecepatan migrasi partikel bermuatan yang terlarut atau terdispersi, dalam larutan elektrolit dibawah medan listrik. Prinsip pemisahan dengan elektroforesis gel adalah pemisahan suatu molekul organik dari campurannya melalui suatu gel dalam suatu medan listrik. Pemisahan terjadi tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran.
molekul yang diinginkan dari matriksnya yang tidak dapat dilakukan oleh prosedur lainnya, seperti sentrifugasi gradient.
Metode standar yang digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi dan memurnikan fragmen DNA adalah elektroforesis gel agorose. Teknik ini sederhana, cepat terbentuk, dan mampu memisahkan campuran potongan DNA sesuai dengan ukurannya secara akurat, dibanding dengan densitas gradient sentrifugasi. Agarosa yang disaring dari ganggang laut merupakan polimer dengan dasar struktur D-alaktosa dan 3,6 –anhidro L-galaktosa. DNA dari 200 basa sampai 50 kilo basa dapat dipisahkan dengan gel agarosa dengan berbagai konsentrasi agarosa. Gel agarosa biasanya dilakukan dalam konfigurasi horizontal dalam kekuatan medan listrik dan arah tetap.
mendeteksi adanya DNA dengan menggunakan etidium bromide, suatu senyawa berfluoresensi yang biasanya digunakan untuk mendeteksi DNA pada gel agarosa atau poliakrilamid. Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR,memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran,lalu dapat disequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan,antara lain membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom, DNA finger printing, mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik atau penyakit tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di tingkat molekular, mengetahui variasi genetik dalam populasi natural di alam, menentukan atau mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA, RNA, protein dan aktivitas enzimatik, menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR, mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu, dan menentukan jumlah fragmen DNA yang dikloning dalam rekombinan plasmid DNA.
H. Kesimpulan
DAFTAR PUSTAKA
David G. Watson. 2009. Analisis Farmasi. Jakarta : EGC
Lisdiyanti. Polymerase Chain Reaction: Cara Mudah Memperbanyak DNA. Bogor: Warta Biotek, 1997.
Magdeldin, Sameh. Gel Electrophoresis-Principles and Basics. Rijeka: InTech Publisher, 2012.
