3
rekayasa genetik dari PT. BASF Indonesia, yang mengandung satu gen sisipan yaitu gen bar yang mengekspresikan protein phosphinothricin acetyltransferase (PAT) dan memberikan toleransi terhadap herbisida amonium glufosinat.
Kapas PRG event LLCotton25 telah memperoleh sertifikat aman pangan di 14 (empat belas) negara yaitu Amerika Serikat (2003), Kanada (2004), Jepang (2004), Korea (2005), Meksiko (2006), Australia (2006), Selandia Baru (2006), Brazil (2008), Uni Eropa (2008), Afrika Selatan (2011), Cina (2015), Malaysia (2018), Filipina (2018), dan Taiwan (2020). Sertifikat aman pakan telah diperoleh di 12 (dua belas) negara yaitu Amerika Serikat (2003), Kanada (2004), Jepang (2006), Kolombia (2008), Uni Eropa (2008), Korea (2008), Brazil (2008), Afrika Selatan (2011), Cina (2015), Malaysia (2018), Filipina (2018), dan Taiwan (2020). Sedangkan sertifikat aman lingkungan telah diperoleh di 2 (dua) negara yaitu dan Amerika Serikat (2003) dan Brazil (2008).
Pengkajian keamanan pangan Kapas PRG event LLCotton25 dilakukan berdasarkan Peraturan Badan POM 6 Tahun 2018 tentang Pengawasan Pangan Produk Rekayasa Genetik dan surat penugasan ketua Komisi Keamanan Hayati kepada Wakil Ketua Bidang Keamanan Pangan KKH PRG Nomor B-32/KKH PRG/03/2020 Tanggal 11 Maret 2020 Perihal Penugasan Pengkajian Keamanan Pangan Kapas Produk Rekayasa Genetik (PRG) event LLCotton25. TTKH PRG Bidang Keamanan Pangan telah melakukan pengkajian keamanan pangan Kapas PRG event LLCotton25 berdasarkan informasi genetik dan informasi keamanan pangan yang terdiri atas kesepadanan substansial, alergenisitas, dan toksisitas sebagaimana diuraikan di bawah ini.
II. Informasi Genetik II.1. Elemen Genetik
Kapas PRG event LLCotton25 mengandung satu gen sisipan yaitu gen bar yang mengekspresikan protein phosphinothricin acetyltransferase (PAT) dan memberikan toleransi terhadap herbisida amonium glufosinat. Gen sisipan bar tersebut dikendalikan oleh promoter 35S CaMV dan terminator nos (Peeters, 2015).
II.2. Sumber Gen
Gen sisipan kapas PRG event LLCotton25, yaitu gen bar diisolasi dari DNA genom Streptomyces hygroscopicus. Gen bar diregulasi oleh promoter 35S yang berasal dari cauliflower mosaic virus (CaMV) dan terminator nos 3’ yang diisolasi dari gen nopaline synthase dari T-DNA pTiT37. Kaset gen yang ditransfer ke tanaman dilambangkan Lampiran. 1
I. Pendahuluan
Kapas (Gossypium hirsutum) PRG event LLCotton25 merupakan kapas produk Ringkasan Pengkajian Keamanan Pangan
4
sebagai P35S-bar-3'nos dan dimasukkan ke dalam vektor pGSV71 (Thompson et al., 1987; Odell et al., 1985; Depicker et al., 1982).
II.3. Sistem Transformasi
Kapas PRG event LLCotton25 dirakit melalui metode transformasi dengan perantara Agrobacterium tumefaciens pada varietas Coker 312 (C312) menggunakan vektor biner pGSV71. Eksplan ditumbuhkan bersama kultur A. tumefaciens strain C58C1Rif yang membawa vektor pGSV71. Tunas transgenik yang terbentuk dipindahkan ke rumah kaca, diuji lebih lanjut toleransinya terhadap amonium glufosinat, dibiarkan berbunga dan menghasilkan biji (Zambryski, 1992; De Beuckeleer dan van der Klis, 2003).
II.4. Stabilitas Genetik
Hibridisasi Southern blot menggunakan DNA genomik kapas PRG event LLCotton25 dan probe P35S, bar, 3'nos dan T-DNA, menunjukkan adanya satu fragmen integrasi T-DNA. Hasil ini mengindikasikan adanya integrasi satu salinan gen sisipan pada genom Kapas PRG event LLCotton25.
Tidak adanya sekuen backbone pada kapas PRG event LLCotton25 dibuktikan melalui analisis Southern blot menggunakan empat probe yang mencakup sekuen backbone lengkap. DNA genom diisolasi dari tanaman kapas PRG event LLCotton25 dan dari varietas non-PRG Coker312. Tidak ada fragmen hibridisasi yang diperoleh dengan probe backbone yang digunakan. Hasil ini menunjukkan bahwa tidak ada sekuen backbone pada kapas PRG event LLCotton25 (Habex, 2015).
Untuk membuktikan kestabilan kapas PRG event LLCotton25, analisis Southern blot dilakukan pada generasi yang berbeda. Hasil yang diperoleh menunjukkan kestabilan kapas PRG event LLCotton25 pada generasi yang berbeda, yaitu generasi T4, T5, T6 dan BC3F3, dan gen sisipan diwariskan mengikuti hukum Mendel (Aerts, 2015).
Berdasarkan hasil kajian informasi genetik dapat disimpulkan bahwa: 1. Kapas PRG event LLCotton25 mengandung satu kopi sisipan gen bar;
2. Kapas PRG event LLCotton25 tidak mengandung sekuen backbone dari plasmid transformasi pGSV71; dan
3. T-DNA dalam Kapas PRG event LLCotton25 stabil sampai empat generasi, yaitu generasi T4, T5, T6 dan BC3F3 dan diwariskan mengikuti hukum Mendel.
III. Informasi Keamanan Pangan III.1. Kesepadanan Substansial
Pengkajian kesepadanan substansial dari kapas PRG event LLCotton25 dilakukan dengan menggunakan tanaman kapas PRG event LLCotton25 dan tanaman kapas
5
non PRG sebagai kontrol. Kapas ditanam dalam rancangan randomized complete block di 15 lokasi di Amerika Serikat. Pada tahun 2000 kapas ditanam di lokasi: Wavne, North Carolina; Washington, Mississippi; Crittenden, Arkansas; Stoddard, Missouri; Washington, Mississippi; dan Wharton, Texas. Pada tahun 2001 kapas ditanam di lokasi: Tift, Georgia; Crittenden, Arkansas; Drew, Arkansas; Tate, Mississippi; Washington, Mississippi; Washington, Mississippi; Wharton, Texas; Waller, Texas; dan Uvalde, Texas. Sebagian tanaman diberi perlakuan herbisida glifosat.
Setelah dipanen biji kapas dikirim ke laboratorium Woodson-Tenent Laboratories, Des Moines, Iowa, dan Covance Laboratories Inc., Madison, Wisconsin Amerika Serikat yang sudah menerapkan GLP (Good Laboratory Practices) untuk dianalisis komposisinya. Biji kapas dianalisis komposisinya termasuk kadar air, protein, lemak, abu, dan karbohidrat (dihitung by-difference), serat kasar, ADF (acid detergent fiber) dan NDF (neutral detergent fiber), mineral (kalium, kalsium, magnesium, besi, seng, dan fosfor), vitamin E (α-tokoferol, -tokoferol, -tokoferol, dan -tokoferol,), asam amino (alanin, arginin, asam aspartat, sistin, asam glutamat, glisin, histidin, isoleusin, leusin, lisin, fenilalanin, metionin, prolin, serin, treonin, triptofan, tirosin, dan valin), asam lemak (miristat, palmitat, palmitoleat, stearat, oleat, linoleat, linolenat, arakhidat, behenat, dan lignoserat), dan zat antigizi (gosipol dan asam fitat) dan metabolit sekunder lainnya (asam dihidrosterkulat, asam sterkulat, dan asam malvalat) (Oberdörfer, 2006).
Hasil analisis komposisi menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan yang nyata di antara biji kapas PRG event LLCotton25 dengan biji kapas non PRG, dan masuk ke dalam kisaran komposisi biji kapas komersial pada umumnya.
Berdasarkan hasil pengkajian kesepadanan substansial dapat disimpulkan bahwa biji kapas PRG event LLCotton25 sepadan secara substansial dengan biji kapas non-PRG.
III.2. Alergenisitas
Pengkajian alergenisitas terhadap protein PAT yang diekspresikan pada kapas PRG event LLCotton25 dilakukan melalui analisis bioinformatika, konsentrasi protein, dan pengujian stabilitas protein yang meliputi stabilitas cerna dan stabilitas panas. Pengujian alergenisitas dilakukan di laboratorium yang telah menerapkan GLP.
III.2.1. Analisis Bioinformatika
Evaluasi kemiripan sekuen protein PAT dengan protein alergen dilakukan menggunakan database protein alergen FARRP (Food Allergy Research and Resource Program) AllergenOnline Database versi 2017 dengan perangkat FASTA, serta pencarian kesamaan sekuen delapan atau lebih asam amino dengan sekuen protein dalam database menggunakan SeqMatchAll dari EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite).
6
Hasil analisis menunjukkan tidak terdapat kemiripan sekuen asam amino yang relevan secara biologis (35% atau lebih kesamaan asam amino di dalam peptida yang mengandung 80 asam amino) antara sekuen protein PAT dengan sekuen protein alergen. Selain itu, tidak ada kesamaan sekuen delapan asam amino atau lebih pada protein PAT dengan sekuen asam amino protein alergen dalam database (Capt, 2017).
III.2.2. Analisis Konsentrasi Protein
Konsentrasi protein PAT pada kapas PRG event LLCotton25 ditentukan menggunakan metode ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay). Konsentrasi protein PAT dalam biji kapas PRG event LLCotton25 yang telah diproses (delinted cottonseed) ditemukan sebesar 121 μg/g berat kering. Kandungan protein PAT pada kapas sangat kecil, yaitu sebesar 0,05% dari protein total dalam biji kapas PRG event LLCotton25 (Kowite dan Currier, 2002; Rattemeyer-Matschurat, 2006).
III.2.3. Analisis Stabilitas Protein
Protein PAT dihasilkan dalam jumlah yang sedikit oleh tanaman kapas PRG event LLCotton25, sehingga untuk keperluan pengujian stabilitas protein digunakan protein yang diproduksi pada bakteri Escherichia coli. Kesetaraan protein PAT yang diproduksi di E. coli dengan protein yang diekspresikan di dalam tanaman kapas PRG event LLCotton25 diuji dengan menggunakan metode SDS-PAGE, uji immunoreaktivitas dengan Western blot, analisis sekuen N-terminal, analisis glikosilasi dan analisis aktivitas enzimatik. Hasil analisis menunjukkan bahwa protein PAT yang dihasilkan oleh bakteri E. coli ekivalen dengan protein PAT yang dihasilkan oleh kapas PRG event LLCotton25 (Hérouet et al., 2005; Bayer CropScience CoA BBS13-046v2, 2013).
III.2.3.1. Analisis Stabilitas Cerna Protein
Analisis stabilitas cerna protein PAT dilakukan melalui uji kecernaan menggunakan simulasi cairan lambung (Simulated Gastric Fluid - SGF) dan simulasi cairan usus (Simulated Intestinal Fluid - SIF) selama 60 menit pada suhu 37°C. Hasil hidrolisis protein dievaluasi dengan menggunakan metode SDS- PAGE dan Western blot.
Evaluasi dengan SDS-PAGE dan Western blot menunjukkan bahwa setelah inkubasi selama 30 detik dalam SGF dengan menggunakan pepsin pada pH 1,2, tidak terdeteksi adanya pita protein PAT maupun fragmen-fragmennya (Rascle, 2009a). Demikian pula setelah inkubasi selama 5 menit dalam SIF dengan menggunakan pankreatin pada pH 7,5, lebih dari 90% protein PAT telah terhidrolisis, sedangkan setelah inkubasi selama 10 menit dalam SIF, protein PAT maupun fragmen-fragmennya dapat terhidrolisis sempurna (Rascle, 2009b).
7 III.2.3.2. Analisis Stabilitas Panas Protein
Analisis pengaruh pemanasan terhadap stabilitas protein PAT yang diproduksi oleh E. coli dilakukan melalui pengujian aktivitas enzimatik. Aktivitas enzimatik protein PAT tidak berubah setelah pemanasan selama 30 menit pada suhu 25°C maupun 37°C, namun protein PAT kehilangan seluruh aktivitas enzimatiknya setelah pemanasan selama 30 menit pada suhu 55°C atau lebih (Serrano, 2016).
Berdasarkan pengkajian alergenisitas yang meliputi analisis bioinformatika, konsentrasi protein, maupun analisis stabilitas cerna dan stabilitas panas protein, dapat disimpulkan bahwa protein PAT tidak menunjukkan adanya potensi menimbulkan alergi.
III.3. Toksisitas
Pengkajian toksisitas terhadap protein PAT yang diekspresikan pada kapas PRG event LLCotton25 dilakukan melalui analisis bioinformatika dan toksisitas oral akut yang dilakukan di laboratorium yang menerapkan GLP.
III.3.1. Analisis Bioinformatika
Analisis kemiripan sekuen protein PAT dengan sekuen protein toksin dilakukan dengan perangkat FASTA dan BLOSUM50 menggunakan database sekuen protein yang terdapat dalam National Center for Biotechnology Information (NCBI) Entrez® Protein Database yang mengandung sekuen asam amino dari GenBank CDS translations, UniProtKB/Swiss-Prot, Protein Data Bank (PDB), Protein Information Resource (PIR) dan Protein Research Foundation/Protein Sequence Database (PRF/SEQDB), serta Bayer BCS 2017 Toxin Database. Hasil analisis menunjukkan bahwa tidak terdapat kemiripan sekuen asam amino protein PAT dengan sekuen asam amino protein toksin dalam kedua database yang digunakan (Capt, 2017).
III.3.2 Toksisitas Akut Protein
Pengujian toksisitas akut telah dilakukan terhadap protein PAT dan hasilnya telah dilaporkan. Protein PAT yang dihasilkan oleh tanaman kapas PRG event LLCotton25 sangat sedikit, sehingga untuk keperluan pengujian toksisitas akut digunakan protein yang diproduksi pada bakteri E. coli. Kesetaraan protein PAT yang diproduksi di E. coli dengan protein yang diekspresikan di dalam tanaman kapas PRG event LLCotton25 diuji dengan menggunakan metode SDS-PAGE, uji immunoreaktivitas dengan Western blot, analisis sekuen N-terminal, analisis glikosilasi dan analisis aktivitas enzimatik. Hasil analisis menunjukkan bahwa protein PAT yang dihasilkan oleh bakteri E. coli ekivalen dengan protein PAT yang dihasilkan oleh kapas PRG event LLCotton25. (Blanck, 2014; Hérouet et al., 2005; Bayer CropScience CoA BBS13-046v2, 2013)
8
Bahan yang diuji berupa protein PAT, batch number 1342_PATbar, yang disuspensikan dalam larutan penyangga fosfat (PBS) pH 7,3 yang mengandung 0,5% Tween 20. Larutan penyangga fosfat tersebut juga digunakan sebagai kontrol. Pengujian dilakukan dengan menggunakan mencit strain C57BL/6J jantan dan betina masing-masing 20 ekor, dengan berat badan sekitar 17,4 - 19,6 g (jantan) dan 13,7- 15,7 g (betina), berumur sekitar 8 minggu, yang diperoleh dari Charles River Laboratories, Saint Germain sur l’Arbresle, Perancis.
Semua mencit diaklimatisasi selama 6 hari sebelum digunakan dalam pengujian, untuk menyesuaikan pada kondisi laboratorium. Mencit dibagi menjadi dua kelompok (kelompok kontrol dan kelompok perlakuan), yang masing-masing terdiri dari 10 ekor jantan dan 10 ekor betina. Mencit dipelihara secara individual di dalam kandang stainless steel selama masa aklimatisasi dan pengujian berlangsung. Kandang ditempatkan dalam ruangan dengan suhu 20 – 24 oC dan kelembaban relatif 40 –
70%, dengan pencahayaan 12 jam gelap dan 12 jam terang. Pakan berupa certified rodent pelleted and irradiated diet A04C-10, yang diperoleh dari SAFE (Scientific Animals Food and Engineering), Augy, Perancis, dan air minum diberikan secara ad libitum.
Pengujian toksisitas akut protein PAT sebagai dosis tunggal dilakukan dengan cara cekokan yang dilakukan pada hari pertama perlakuan, diikuti dengan periode observasi selama 14 hari. Pemberian bahan uji dilakukan dengan menggunakan sonde lambung. Disain percobaan yang digunakan adalah sebagai berikut: kelompok 1 diberi cekokan larutan penyangga fosfat (PBS) pH 7,3 sebagai kontrol; kelompok 2 diberi cekokan suspensi protein PAT dengan dosis 2000 mg/kg BB. Volume suspensi protein PAT maupun larutan penyangga fosfat yang diberikan adalah 20 ml/kg BB. Pemberian suspensi protein PAT dilakukan dua kali, masing-masing sebesar 1000 mg/kg, dengan selang waktu 3 jam.
Pengamatan klinis dilakukan setiap hari selama pengujian berlangsung. Penimbangan berat badan dilakukan pada hari pertama sebelum pemberian bahan uji dan kemudian dilakukan setiap minggu, dan penimbangan terakhir dilakukan sebelum mencit dimatikan. Konsumsi pakan dihitung setiap minggu. Pada hari terakhir pengujian (hari ke-15) semua mencit di-eutanasia dengan isofluran, kemudian dilakukan pembedahan (necropsy) dan pemeriksaan anatomi makroskopis terhadap rongga perut dan rongga dada serta organ dan jaringan vital.
Hasil pengujian menunjukkan bahwa: (1) selama pengujian berlangsung tidak terdapat mencit yang mati maupun sakit, (2) tidak terdapat perbedaan antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol dalam hal berat badan, pertambahan berat badan, konsumsi pakan dan kondisi organ dalam, dan (3) tidak ditemukan adanya tanda-tanda kelainan klinis pada mencit akibat pemberian bahan uji.
Dari hasil pengujian toksisitas akut diketahui bahwa tidak terdapat efek toksik pada mencit akibat pemberian protein PAT sampai dosis 2000 mg/kg BB.
9
Berdasarkan hasil pengkajian toksisitas yang meliputi analisis bioinformatika dan toksisitas akut, dapat disimpulkan bahwa kapas PRG event LLCotton25 termasuk ke dalam golongan bahan yang tidak toksik.
IV. Kesimpulan
Berdasarkan hasil pengkajian tentang informasi genetik, kesepadanan substansial, alergenisitas, dan toksisitas disimpulkan hal-hal sebagai berikut:
1. Kapas PRG event LLCotton25 mengandung satu kopi sisipan gen bar; tidak mengandung sekuen backbone dari plasmid transformasi pGSV71; T-DNA dalam kapas PRG event LLCotton25 stabil sampai empat generasi, yaitu generasi T4, T5, T6 dan BC3F3 dan diwariskan mengikuti hukum Mendel;
2. Kapas PRG event LLCotton25 sepadan secara substansial dengan Kapas non PRG; tidak menunjukkan adanya potensi menimbulkan alergi; dan termasuk ke dalam bahan yang tidak bersifat toksik;
3. TTKH menilai bahwa Kapas PRG event LLCotton25 yang diajukan adalah aman untuk dikonsumsi sebagai bahan pangan;
4. Apabila kemudian ditemukan data dan informasi baru yang tidak sesuai dengan data keamanan pangan yang diperoleh hingga saat ini, maka status keamanan pangan Kapas PRG event LLCotton25 perlu dikaji ulang;
5. Apabila setelah ditetapkan aman pangan, kemudian Kapas PRG event LLCotton25 terbukti menimbulkan dampak negatif terhadap kesehatan manusia maka pemohon wajib melakukan tindakan pengendalian dan penanggulangan, serta menarik Kapas PRG event LLCotton25 dari peredaran;
6. Kapas PRG event LLCotton25 tidak boleh digunakan sebagai pakan sampai memperoleh sertifikat aman pakan; dan
7. Kapas PRG event LLCotton25 tidak boleh dibudidayakan sampai ditetapkan aman lingkungan.
V. Daftar Acuan
Aerts, M 2015. Molecular demonstration of the stability of Gossypium hirsutum transformation event LL25 in different backgrounds and over different generations, Study Number: LL25 – Structural stability in different backgrounds and generations v2, Test Facility: Bayer CropScience N.V.- Innovation Center Seed & Trait Safety Protein and Product Characterization Technologiepark 38, B-9052 Gent, Belgium.
Bayer CropScience, 2013. PAT/bar protein. Certificate of Analysis BBS13-046v2. Bayer CropScience N.V. Regulatory Science–Protein and Product Characterization. Technologiepark 38, B-9052 Gent, Belgium.
Blanck M, 2014. PAT/bar Protein: Acute Toxicity by Oral Gavage in Mice. Study Number: SA 13239, Study Report Number: SA 13239, Test Facility: Bayer S.A.S., Bayer CropScience 355, rue Dostoïevski CS 90153, Valbonne 06906, Sophia Antipolis Cedex, France.
10
Capt, A. 2017. PAT/bar protein: Amino acid sequence homology search with known allergens and known toxins. Study Report No. TXTPS002. Bayer SAS Crop Science Division, 355 rue Dostoïevski CS 90153, Valbonne 06906 Sophia Antipolis Cedex, France. Report Completed on April 11, 2017.
De Beuckeleer and van der Klis., 2003. Summary document Molecular Characterization of Glufosinate-tolerant cotton transformation event LLCotton25. Testing Facility: Bayer BioScience N.V. Molecular & Biochemical Analytical Services Jozef Plateaustraat 22 B-9000 Gent, Belgium.
Belgium Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P. and Goodman, H.M. 1982. Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. Journal of Molecular andApplied Genetics 1(6):561-573.
Esdaile, D.J. 2002. Phosphinothricin acetyltransferase (PAT) bar Gene Product In Vitro Digestibility Study in Simulated Intestinal Fluid. Study Report No. SA 02174. Bayer SAS Crop Science Division 355, rue Dostoïevski CS 90153, Valbonne 06906 Sophia Antipolis Cedex, France. Report Completed on October 9, 2002.
Habex V., 2015. Demonstration of the absence of vector backbone sequences in Gossypium hirsutum transformation event LL25. Study Number: LL25 - Absence vector backbone v2. Testing Facility: Bayer CropScience N.V.- Innovation Center Seed & Trait Safety Protein and Product Characterization Technologiepark 38, B-9052 Gent, Belgium.
Hérouet, C., Esdaile, D. J., Mallyon, B. A., Debruyne, E., Schulz, A., Currier, T., Hendrickx, K., van der Klis, R.-J., dan Rouan, D. 2005. Safety evaluation of the phosphinothricin acetyltransferase proteins encoded by the pat and bar sequences that confer tolerance to glufosinate ammonium herbicide in transgenic plants. Regul. Toxicol. Pharmacol. 41: 134‒149.
Hérouet-Guicheney, C. 2006. Phosphinothricin Acetyltransferase (PAT) Protein bar Gene Product: Overall Amino Acid Sequence Homology Search with Known Toxins and Allergens. Study Report SA 06001. Bayer SAS Crop Science Division, 355 rue Dostoïevski CS 90153, Valbonne 06906 Sophia Antipolis Cedex, France.
Kowite, W.J. dan Currier, T.C. 2002. PAT protein content in processed agricultural commodities of transgenic cotton event LL25, USA, 2000. Study Report No. BK00B003. Bayer CropScience, Biotechnology Support Department 2T. W. Alexander Drive, Research Triangle Park, NC 27709, USA. Report Completed on July 17, 2002. Oberdörfer, R. 2006. Amendment to the Nutritional Impact Assessment Report on LibertyLink® Cotton Transformation Event LLCotton25 (02 B 005). Bayer CropScience GmbH, Molecular & Biochemical Analytical Services, 65926 Frankfurt, Germany.
Odell, J.T., Nagy, F. and Chua, N.-H. (1985) Identification of DNA sequences required for actuivity of the Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter. Nature 313:810-812.
Peeters, K., 2015. Description of Vector pGSV71. Study Number: BIO3-047_VectDescript_51. Test Facility: Bayer CropScience.
11
Rascle, J. B. 2009a. PAT/bar protein: in vitro digestibility study in human simulated gastric fluid. Study Report No. SA 09045. Bayer SAS Crop Science Division, 355 rue Dostoïevski CS 90153, Valbonne 06906 Sophia Antipolis Cedex, France. Report Completed on June 5, 2009.
Rascle, J. B. 2009b. PAT/bar protein: in vitro digestibility study in human simulated intestinal fluid. Study Report No. SA 09046. Bayer SAS Crop Science Division, 355 rue Dostoïevski CS 90153, Valbonne 06906 Sophia Antipolis Cedex, France. Report Completed on June 12, 2009; amended on June 28, 2016.
Rattemeyer-Matschurat, V. 2006. Analysis of substantial equivalence of transgenic and non-transgenic cotton by means of T-test for mean differences: LLCotton25 versus Coker 312. Statistical report based on Study Report No. BK00B002 and BK01B005. Biometrie + Statistik, Birkenallee 7, D-31691 Helpsen for Bayer CropScience, Industriepark Höchst, D-65926 Frankfurt/Main, Germany. Report Completed on March 24, 2006.
Rouquié, D. 2002. Phosphinothricin acetyltransferase (PAT) bar Gene Product In Vitro Digestibility Study in Simulated Gastric Fluid. Study Report No. SA 02173. Bayer SAS Crop Science Division 355, rue Dostoïevski CS 90153, Valbonne 06906 Sophia Antipolis Cedex, France. Report Completed on June 26, 2002.
Serrano, H. 2016. The effect of temperature on PAT/bar as assessed by the PAT quantitative activity assay. Study Report No. 16-RSTPS004. Bayer Crop Science LP, Seed & Trait Safety, 407 Davis Drive, Morrisville, NC USA 27560. Report Completed on May 16, 2016.
Thompson, C. J., Movva, N. R., Tizard, R., Crameri, R., Davies, J. E., Lauwereys, M., Botterman, J. 1987. Characterization of the herbicide-resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus. The EMBO Journal, 6 (9): 2519-2523.
Van der Klis, R-J. 2003. Equivalence between the Phosphinothricin acetyl transferase (PAT) enzymes produced in cotton (G. hirsutum) and bacteria (E. coli). Bayer BioScience N.V., Molecular and Biochemical Analytical services, Protein characterisation, Nazerethsesteenweg 77, B-9800 Astene-Deinze, Belgium.
Zambryski, P. 1992. Chronicles from the Agrobacterium-plant cell DNA transfer story. Ann. Rev. Plant Mol.Biol. 43:465-490.
