3
Kanola (Brassica napus) PRG event MS11 merupakan kanola produk rekayasa genetik dari PT. BASF Indonesia. Kanola PRG event MS11 mengandung tiga gen sisipan yaitu bar, barnase dan barstar. Gen bar menyandi enzim phosphinothricin acetyltransferase (PAT/bar) yang menyebabkan toleransi terhadap herbisida amonium glufosinat. Gen barnase menyandi enzim ribonuklease yang membatasi ekspresi gen sehingga hasilnya adalah tanaman jantan yang steril. Gen barstar menyandi protein Barstar, suatu inhibitor protein Barnase.
Kanola PRG event MS11 telah memperoleh sertifikat aman pangan di 8 (delapan) negara yaitu Amerika Serikat (2017), Australia (2017), Selandia Baru (2017), Kanada (2018), Taiwan (2018), Jepang (2019), Korea (2019), dan Filipina (2019). Sertifikat aman pakan telah diperoleh di 6 (enam) negara yaitu Amerika Serikat (2017), Kanada (2018), Taiwan (2018), Jepang (2019), Korea (2019), dan Filipina (2019). Sedangkan sertifikat aman lingkungan telah diperoleh di 2 (dua) negara yaitu Amerika Serikat (2017) dan Australia (2018).
Pengkajian keamanan pangan kanola PRG event MS11 dilakukan berdasarkan Peraturan Badan POM 6 Tahun 2018 tentang Pengawasan Pangan Produk Rekayasa Genetik dan surat penugasan ketua Komisi Keamanan Hayati kepada Wakil Ketua Bidang Keamanan Pangan KKH PRG Nomor B-23/KKH PRG/02/2020 Tanggal 28 Februari 2020 Perihal Penugasan Pengkajian Keamanan Pangan Produk Rekayasa Genetik (PRG) Komoditas Kanola event MS11. TTKH PRG Bidang Keamanan Pangan telah melakukan pengkajian keamanan pangan kanola PRG event MS11 berdasarkan informasi genetik dan informasi keamanan pangan yang terdiri atas kesepadanan substansial, alergenisitas, dan toksisitas sebagaimana diuraikan di bawah ini.
II. Informasi Genetik II.1. Elemen Genetik
Kanola PRG event MS11 mengandung tiga gen sisipan yaitu bar, barnase dan barstar. Elemen genetik dari kaset gen sisipan pada kanola PRG event MS11 secara lengkap adalah sebagai berikut:
gen bar, merupakan sekuen yang menyandikan enzim phosphinothricin acetyltransferase (PAT/bar) yang memberikan sifat toleransi terhadap herbisida amonium glufosinat,
PssuAt, merupakan daerah promoter dari ribulose-1,5-biphosphate carboxylase sub-unit kecil yang aktif di semua jaringan hijau tanaman,
3'g7, merupakan terminator yang berupa ujung daerah 3’ UTR (UnTranslated Region) TL-DNA gen 7 dari gen octopine,
gen barnase, merupakan sekuen penyandi protein Barnase, yaitu ribonuklease ekstraseluler (extracellular ribonuclease) spesifik yang disekresikan oleh bakteri Lampiran. 1
I. Pendahuluan
Ringkasan Pengkajian Keamanan Pangan Kanola PRG Event MS11
4
berfungsi untuk sifat jantan steril (male sterility),
Pta29, merupakan promoter spesifik dari gen TA29 yang menyebabkan ekspresi gen terbatas hanya pada sel tapetum selama perkembangan antera,
3’barnase, merupakan terminator daerah 3’ UTR (UnTranslated Region) gen barnase Bacillus amyloliquefaciens,
Gen barstar, merupakan daerah penyandi protein Barstar yang merupakan penghambat protein Barnase,
Pnos, merupakan daerah promoter gen nopaline synthase (NOS). (Peeters, 2015)
II.2. Sumber Gen
Sumber gen sisipan kanola PRG event MS11, yaitu:
gen bar diisolasi dari bakteri Streptomyces hygroscopicus (Thompson et al., 1987),
PssuAt berasal dari gen ribulose-1,5-biphosphate carboxylase sub-unit kecil dari Arabidopsis thaliana,
3'g7 berasal dari gen octopine plasmid Ti Agrobacterium tumefaciens. (Dhaese et al., 1983),
gen barnase diisolasi dari Bacillus amyloliquefaciens (Hartley, 1988),
Pta29 berasal gen TA29 Nicotiana tabacum (tobacco) (Seurinck et al., 1990), 3’barnase, berasal dari gen barnase Bacillus amyloliquefaciens (Hartley, 1988), gen barstar, diisolasi dari Bacillus amyloliquefaciens (Hartley, 1988),
Pnos, berasal dari gen nopaline synthase dari Agrobacterium tumefaciens (Depicker et al., 1982).
II.3. Sistem Transformasi
Kanola PRG event MS11 dirakit melalui transformasi dengan perantara Agrobacterium tumefaciens strain C58C1Rlf menggunakan vektor pTCO113. Vektor pTCO113 tersebut membawa tiga kaset berisi gen bar, barnase, dan barstar. Gen bar, barnase, dan barstar dimasukkan ke dalam genom kanola dalam bentuk T-DNA tunggal. Eksplan untuk transformasi genetik berupa hipokotil kanola varietas N90-740 (Criel, 2008).
II.4. Stabilitas Genetik
Identifikasi jumlah kopi sisipan gen pada Kanola PRG event MS11 ditentukan dengan menggunakan analisis Southern blot. Pola pita yang ditunjukkan oleh kanola PRG event MS11 dengan semua enzim restriksi dan kombinasi probe yang digunakan menunjukkan indikasi penyisipan satu kopi. Kesimpulannya, hasil analisis Southern blot menunjukkan adanya sisipan tunggal T-DNA lengkap yang mengandung kaset gen bar, barnase dan barstar dalam kanola PRG event MS11. Penelitian juga dilakukan untuk mengkaji keberadaan sekuen backbone pada kanola PRG event MS11 menggunakan analisis Southern blot dan PCR. Hasil analisis menunjukkan tidak
5
ditemukan adanya sekuen backbone dari plasmid transformasi pTCO113 pada kanola PRG event MS11. Sementara itu, stabilitas gen sisipan telah dievaluasi melalui pengujian secara individual tanaman kanola PRG event MS11 dari lima generasi dengan analisis Southern blot. Hasil pengujian menunjukkan adanya stabilitas struktural gen sisipan pada kanola PRG event MS11 pada generasi T2, T3, F1, BC1 dan BC2, dan gen sisipan diwariskan mengikuti hukum Mendel (Peeters, 2016; Peeters, 2017).
Berdasarkan hasil kajian informasi genetik dapat disimpulkan bahwa:
1. Kanola PRG event MS11 mengandung satu kopi T-DNA lengkap yang berisi kaset gen bar, barnase dan barstar;
2. Kanola PRG event MS11 tidak mengandung sekuen backbone dari plasmid transformasi pTCO113; dan
3. T-DNA dalam kanola PRG event MS11 stabil sampai lima generasi yaitu generasi T2, T3, F1, BC1 dan BC2, dan diwariskan mengikuti hukum Mendel.
III. Informasi Keamanan Pangan III.1. Kesepadanan Substansial
Pengkajian kesepadanan substansial dari kanola PRG event MS11 dilakukan dengan menggunakan tanaman kanola PRG event MS11 dan tanaman kanola non PRG sebagai kontrol. Kanola ditanam dalam rancangan randomized complete block pada tahun 2014 di sembilan daerah di Kanada dan Amerika Serikat, yaitu di Saskatchewan, Kanada (2 lokasi); Alberta, Kanada; Manitoba, Kanada (3 lokasi); di North Dakota; Idaho; dan Washington, Amerika Serikat. Sebagian tanaman kanola diberi perlakukan herbisida glufosinat.
Setelah dipanen biji kanola dikirim ke Covance Laboratories Inc., Madison, Wisconsin, Amerika Serikat yang sudah menerapkan good laboratory practices (GLP) untuk dianalisis komposisinya. Analisis komposisi dilakukan terhadap biji kedelai untuk kadar proksimat (air, protein, lemak, abu, dan karbohidrat by-difference), ADF (acid detergent fiber), NDF (neutral detergent fiber), mineral (kalsium, natrium, kalium, magnesium, mangan, besi, tembaga, seng, dan fosfor), vitamin (-tokoferol, -tokoferol, -tokoferol, dan vitamin K), asam amino (alanin, arginin, asam aspartat, sistin, asam glutamat, glisin, histidin, isoleusin, leusin, lisin, fenilalanin, metionin, prolin, serin, treonin, triptofan, tirosin, dan valin), asam lemak (palmitat, palmitoleat, stearat, oleat, linoleat, linolenat, arakhidat, eikosenoat, eikosadienoat, behenat, erukat, lignoserat, dan nervonat), dan zat antigizi (glukosinolat asam fitat, sinapin, dan tanin) (Jeffries et al., 2017).
Hasil analisis komposisi menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan yang nyata di antara biji kanola PRG event MS11 dengan biji kanola non PRG, dan masuk ke dalam kisaran komposisi biji kanola komersial pada umumnya.
Berdasarkan hasil pengkajian kesepadanan substansial dapat disimpulkan bahwa biji kanola PRG event MS11 sepadan secara substansial dengan biji kanola non PRG.
6 III.2. Alergenisitas
Pengkajian alergenisitas terhadap protein PAT, Barnase dan Barstar yang diekspresikan pada kanola PRG event MS11 dilakukan melalui analisis bioinformatika, konsentrasi protein dan pengujian stabilitas protein yang meliputi stabilitas cerna dan stabilitas panas. Pengujian alergenisitas dilakukan di laboratorium yang telah menerapkan GLP.
III.2.1. Analisis Bioinformatika
Evaluasi kemiripan sekuen protein PAT, Barnase dan Barstar dengan protein alergen masing-masing dilakukan dengan menggunakan database protein alergen COMPARE (COMprehensive Protein Allergen Resource, www.comparedatabase.org) versi 2017 dan database AllergenOnline (www.allergenonline.org) versi 2016 dengan perangkat FASTA, serta pencarian kesamaan sekuen delapan atau lebih asam amino dengan sekuen protein dalam database menggunakan SeqMatchAll dari EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite) (Capt, 2017; Rascle, 2016a; 2016b).
Hasil analisis menunjukkan bahwa tidak ada kemiripan sekuen asam amino yang relevan secara biologis (35% atau lebih kesamaan asam amino di dalam sekuen yang mengandung 80 asam amino) antara sekuen protein PAT, Barnase dan Barstar dengan sekuen protein alergen. Selain itu, tidak ada kesamaan sekuen delapan asam amino atau lebih pada protein PAT, Barnase dan Barstar dengan sekuen asam amino protein alergen dalam database (Capt, 2017; Rascle, 2016a; 2016b).
III.2.2. Analisis Konsentrasi Protein
Konsentrasi protein PAT, Barnase dan Barstar pada kanola PRG event MS11 ditentukan menggunakan metode ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) (Dharmasri et al., 2016). Konsentrasi protein di dalam biji kanola PRG event MS11 ditemukan masing-masing sebesar 0,419–0,885 μg/g berat kering untuk protein PAT dan di bawah LOD (Limit of Detection = 0,00750 μg/g berat basah) untuk protein Barnase dan Barstar. Kandungan protein PAT, Barnase dan Barstar pada kanola sangat kecil, masing-masing sebesar 0,00032% dan kurang dari 3,8 × 10‾6 % dari protein total dalam biji kanola PRG event MS11 (Jeffries et al., 2017).
III.2.3. Analisis Stabilitas Protein
Protein PAT dan Barstar dihasilkan dalam jumlah yang sedikit oleh tanaman kanola PRG event MS11, sehingga untuk keperluan pengujian stabilitas protein digunakan protein yang diproduksi pada bakteri Escherichia coli. Kesetaraan protein PAT dan Barstar yang diproduksi di E. coli dengan protein yang diekspresikan di dalam tanaman kanola PRG event MS11 diuji dengan menggunakan metode SDS-PAGE,
7
Western blot, analisis sekuen N-terminal, analisis glikosilasi, analisis aktivitas enzimatik, dan analisis pemetaan massa peptida dengan LC/MS. Hasil analisis menunjukkan bahwa protein PAT dan Barstar yang dihasilkan oleh bakteri E. coli ekivalen dengan protein PAT dan Barstar yang dihasilkan oleh kanola PRG event MS11 (Vandermarliere, 2015; Criel, 2016).
Kesetaraan protein Barnase yang diproduksi di E. coli dengan protein yang diekspresikan di dalam tanaman kanola PRG event MS11 diuji dengan menggunakan metode SDS-PAGE, Western blot, analisis sekuen N-terminal, analisis glikosilasi, analisis aktivitas enzimatik, dan analisis pemetaan massa peptida dengan LC/MS. Hasil analisis menunjukkan bahwa protein Barnase yang dihasilkan oleh bakteri E. coli ekivalen dengan protein Barnase yang dihasilkan oleh kanola PRG event MS11 (Wierckx, 2013).
III.2.3.1. Analisis Stabilitas Cerna Protein
Analisis stabilitas cerna protein PAT, Barnase dan Barstar dilakukan melalui uji kecernaan menggunakan simulasi cairan lambung (Simulated Gastric Fluid - SGF) dan simulasi cairan usus (Simulated Intestinal Fluid - SIF) dalam rentang waktu 60 menit pada suhu 37°C. Hasil hidrolisis protein dievaluasi dengan menggunakan metode SDS-PAGE dan Western blot.
Evaluasi dengan SDS-PAGE dan Western blot menunjukkan bahwa tidak terdeteksi adanya pita protein utuh maupun fragmen-fragmennya setelah inkubasi dalam SGF dengan menggunakan pepsin pada pH 1,2 selama 30 detik, baik untuk protein PAT maupun untuk protein Barnase (Rascle, 2009a; Lautraite, 2012a; 2012c).
Evaluasi dengan SDS-PAGE dan Western blot juga menunjukkan bahwa setelah inkubasi dalam SIF dengan menggunakan pankreatin pada pH 7,5 selama 30 detik, tidak terdeteksi adanya pita protein utuh PAT maupun fragmen-fragmennya; protein Barnase terhidrolisis secara perlahan dalam waktu 60 menit; sedangkan protein Barstar maupun fragmen-fragmennya dapat terhidrolisis sempurna setelah inkubasi selama 10 menit dalam SIF (Rascle, 2009b; Lautraite, 2012b).
III.2.3.2. Analisis Stabilitas Panas Protein
Analisis pengaruh pemanasan terhadap stabilitas protein PAT yang diproduksi oleh E. coli dilakukan melalui pengujian aktivitas enzimatik. Aktivitas enzimatik dari protein PAT tidak berubah setelah pemanasan selama 30 menit pada suhu 25°C maupun 37°C, namun protein PAT kehilangan seluruh aktivitas enzimatiknya setelah pemanasan selama 30 menit pada suhu 55°C atau lebih (Serrano, 2016).
Analisis pengaruh pemanasan terhadap stabilitas protein Barnase dilakukan melalui evaluasi dengan SDS-PAGE dan Western blot. Hasil evaluasi menunjukkan bahwa setelah pemanasan selama 30 menit pada suhu 55°C atau lebih, protein Barnase
8
terhidrolisis menjadi dua atau lebih fragmen (Moore, 2012). Dengan demikian, protein Barnase tidak stabil terhadap pemanasan pada suhu 55°C atau lebih.
Pengaruh pemanasan terhadap protein Barnase juga dilakukan melalui uji aktivitas enzimatik. Aktivitas enzimatik dari Barnase tidak berubah setelah pemanasan selama 30 menit pada suhu 25°C dan 37°C. Barnase kehilangan sebagian aktivitasnya setelah pemanasan pada suhu 55°C dan 75°C, serta kehilangan seluruh aktivitas enzimatiknya setelah pemanasan selama 30 menit pada suhu 95°C(Serrano, 2014a).
Pengaruh pemanasan terhadap aktivitas protein Barstar sebagai inhibitor protein Barnase juga diuji. Barstar tetap aktif sebagai inhibitor Barnase setelah pemanasan selama 30 menit pada suhu 25°C, 37°C maupun 55°C. Barstar kehilangan sebagian aktivitasnya setelah pemanasan pada suhu 75°C, dan kehilangan seluruh aktivitasnya sebagai inhibitor Barnase setelah pemanasan selama 30 menit pada suhu 95°C (Serrano, 2014b).
Berdasarkan pengkajian alergenisitas yang meliputi analisis bioinformatika, konsentrasi protein, maupun analisis stabilitas cerna dan stabilitas panas protein, dapat disimpulkan bahwa protein PAT, Barnase, dan Barstar tidak menunjukkan adanya potensi menimbulkan alergi.
III.3. Toksisitas
Pengkajian toksisitas terhadap protein PAT, Barnase dan Barstar yang diekspresikan pada tanaman kanola PRG event MS11 dilakukan melalui analisis bioinformatika dan toksisitas oral akut yang dilakukan di laboratorium yang menerapkan GLP.
III.3.1. Analisis Bioinformatika
Analisis kemiripan sekuen protein PAT, Barnase dan Barstar dengan sekuen protein toksin dilakukan dengan perangkat FASTA dan BLOSUM50 menggunakan database sekuen protein yang terdapat dalam National Center for Biotechnology Information (NCBI) Entrez® Protein Database yang mengandung sekuen asam amino dari GenBank CDS translations, UniProtKB/Swiss-Prot, Protein Data Bank (PDB), Protein Information Resource (PIR) dan Protein Research Foundation/Protein Sequence Database (PRF/SEQDB), serta Bayer BCS 2017 dan 2016 Toxin Database. Hasil analisis menunjukkan bahwa tidak terdapat kemiripan sekuen asam amino antara protein PAT, Barnase dan Barstar dengan sekuen asam amino protein toksin dalam kedua database yang digunakan (Capt, 2017; Rascle, 2016a; 2016b).
9 III.3.2. Toksisitas Akut Protein
III.3.2.1. Toksisitas Akut Protein PAT
Pengujian toksisitas akut telah dilakukan terhadap protein PAT dan hasilnya telah dilaporkan. Protein PAT yang dihasilkan oleh tanaman kanola PRG event MS11 sangat sedikit, sehingga untuk keperluan pengujian toksisitas akut digunakan protein yang diproduksi pada bakteri E. coli. Kesetaraan protein PAT yang diproduksi pada bakteri E. coli dengan protein yang diekspresikan di dalam tanaman kanola PRG event MS11 diuji dengan menggunakan metode SDS-PAGE, Western blot, analisis sekuen N-terminal, analisis glikosilasi, analisis aktivitas enzimatik, dan analisis pemetaan massa peptida dengan LC/MS. Hasil analisis menunjukkan bahwa protein PAT yang dihasilkan oleh bakteri E. coli ekivalen dengan protein PAT yang dihasilkan oleh kanola PRG event MS11 (Blanck, 2014; Vandermarliere, 2015).
Bahan yang diuji berupa protein PAT batch number 1342_PATbar, dengan kemurnian sebesar 98%, yang disuspensikan dalam larutan penyangga fosfat (PBS) pH 7,3 yang mengandung 0,5% Tween 20; yang juga digunakan sebagai kontrol. Pengujian dilakukan dengan menggunakan mencit strain C57BL/6J jantan dan betina masing-masing 20 ekor, dengan berat badan 17,4 - 19,6 g (jantan) dan 13,7 - 15,7 g (betina), berumur sekitar 8 minggu, yang diperoleh dari Charles River Laboratories, Saint Germain sur l’Arbresle, Perancis.
Semua mencit diaklimatisasi selama 6 hari sebelum digunakan dalam pengujian, untuk menyesuaikan pada kondisi laboratorium. Mencit dibagi menjadi dua kelompok (kelompok kontrol dan kelompok perlakuan), yang masing-masing terdiri dari 10 ekor jantan dan 10 ekor betina. Mencit dipelihara secara individual di dalam kandang selama aklimatisasi dan pengujian berlangsung. Kandang ditempatkan dalam ruangan dengan suhu 20 – 24 oC dan kelembaban relatif 40 – 70 %, dengan pencahayaan 12 jam gelap dan 12 jam terang. Pakan berupa certified rodent pelleted and irradiated diet A04C-10, yang diperoleh dari SAFE (Scientific Animals Food and Engineering), Augy, Perancis dan air minum diberikan secara ad libitum.
Pengujian toksisitas akut protein PAT sebagai dosis tunggal dilakukan dengan cara cekokan yang dilakukan pada hari pertama perlakuan, diikuti dengan periode observasi selama 14 hari. Pemberian bahan uji dilakukan dengan menggunakan sonde lambung. Disain percobaan yang digunakan adalah sebagai berikut: kelompok 1 diberi cekokan larutan penyangga fosfat pH 7,3 sebagai kontrol; kelompok 2 diberi cekokan suspensi protein PAT dengan dosis 2000 mg/kg BB. Volume suspensi protein PAT maupun larutan penyangga fosfat yang diberikan adalah 20 ml/kg BB. Pemberian suspensi protein PAT dilakukan dua kali, masing-masing sebesar dosis 1000 mg/kg BB, dengan selang waktu 3 jam.
Pengamatan klinis dilakukan setiap hari selama pengujian berlangsung. Penimbangan berat badan dilakukan pada satu hari sebelum pemberian bahan uji dan kemudian dilakukan setiap minggu, dan penimbangan terakhir dilakukan sebelum mencit
10
dimatikan. Konsumsi pakan dihitung setiap minggu. Pada hari terakhir pengujian (hari ke-15) semua mencit di-eutanasia dengan isofluran, kemudian dilakukan pembedahan (necropsy) dan pemeriksaan anatomi makroskopis terhadap rongga perut dan rongga dada serta organ dan jaringan vital.
Hasil pengujian menunjukkan bahwa: (1) selama pengujian berlangsung tidak terdapat mencit yang mati maupun sakit, (2) tidak terdapat perbedaan antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol dalam hal berat badan, pertambahan berat badan, konsumsi pakan dan kondisi organ dalam, dan (3) tidak ditemukan adanya tanda-tanda kelainan klinis pada mencit akibat pemberian bahan uji.
Dari hasil pengujian toksisitas akut diketahui bahwa tidak terdapat efek toksik pada mencit akibat pemberian protein PAT sampai dosis 2000 mg/kg BB.
III.3.2.2. Toksisitas Akut Protein Barnase
Pengujian toksisitas akut telah dilakukan terhadap protein Barnase dan telah dilaporkan. Protein Barnase yang dihasilkan oleh tanaman kanola PRG event MS11 sangat sedikit, sehingga untuk keperluan pengujian stabilitas protein digunakan protein yang diproduksi pada bakteri E. coli. Kesetaraan protein Barnase yang diproduksi oleh E. coli dan yang diekspresikan di dalam tanaman kanola PRG event MS11 diuji dengan menggunakan metode SDS-PAGE, Western blot, analisis sekuen N-terminal, analisis glikosilasi, analisis aktivitas enzimatik, dan analisis pemetaan massa peptida dengan LC/MS. Hasil analisis menunjukkan bahwa protein Barnase yang dihasilkan oleh bakteri E. coli ekivalen dengan protein Barnase yang dihasilkan oleh kanola PRG event MS11 (Totis, 2014; Wierckx, 2013).
Bahan yang diuji berupa protein Barnase (batch number 1205_Barnase yang diproduksi dalam E. coli, dengan kemurnian sebesar 100 %). Bahan uji dalam bentuk ter-liofilisasi, kemudian diformulasi menjadi suspensi dengan konsentrasi 50 mg protein/ml pada hari sebelum dilakukan pencekokan, dengan cara disuspensikan
dalam larutan penyangga Na2CO3 50 mM pH 9,6, dikocok perlahan pada suhu 5 + 3 oC. Selanjutnya dihomogenisasi lagi dengan cara agitasi secara perlahan
sebelum pencekokan. Larutan penyangga Na2CO3 pH 9,6 digunakan juga sebagai kontrol.
Pengujian tersebut dilakukan dengan menggunakan mencit strain C57BL/6J jantan dan betina berumur sekitar 8 minggu, masing-masing 12 ekor dengan berat badan masing-masing antara 18,4 – 20,3 g (jantan) dan 13,6- 17,1 g (betina), yang diperoleh dari Charles River Laboratories, Saint Germain sur l’Arbresle, Perancis. Mencit diaklimatisasi selama 8 hari sebelum diberi perlakuan.
Mencit dibagi menjadi dua kelompok, masing-masing kelompok terdiri dari 6 ekor mencit jantan dan 6 ekor mencit betina. Mencit dipelihara secara individual di dalam kandang selama masa aklimatisasi dan pengujian berlangsung. Kandang ditempatkan dalam ruangan dengan suhu 20 – 24oC dan kelembaban relatif 40 – 70 %, dengan
11
pencahayaan 12 jam gelap dan 12 jam terang. Pakan berupa certified rodent pelleted and irradiated diet A04C-10, yang diperoleh dari SAFE (Scientific Animals Food and Engineering), Augy, Perancis, dan air minum diberikan secara ad libitum.
Pengujian toksisitas akut protein Barnase sebagai dosis tunggal dilakukan dengan cara cekokan yang dilakukan pada hari pertama perlakuan, diikuti dengan periode observasi selama 14 hari. Pemberian bahan uji dan kontrol dilakukan dengan menggunakan sonde lambung. Disain percobaan yang digunakan adalah sebagai berikut: kelompok 1 diberi cekokan larutan penyangga sebagai kontrol; dan kelompok 2 diberi cekokan suspensi protein Barnase dengan dosis 2000 mg/kg BB. Volume suspensi protein Barnase maupun larutan penyangga yang diberikan adalah 20 ml/kg BB. Pemberian suspensi protein Barnase dilakukan dua kali, masing-masing sebesar 1000 mg/kg BB, dengan selang waktu 3 jam. Semua mencit dipuasakan selama semalam sebelum dilakukan pencekokan.
Pengamatan klinis dilakukan setiap hari selama pengujian berlangsung. Penimbangan berat badan dilakukan pada hari pertama sebelum pemberian bahan uji dan kemudian dilakukan setiap minggu, dan penimbangan terakhir dilakukan sebelum mencit dimatikan. Konsumsi pakan dihitung setiap minggu. Pada hari terakhir pengujian (hari ke-15) semua mencit di-eutanasia dengan isofluran, kemudian dilakukan pembedahan (necropsy) dan pemeriksaan anatomi makroskopis terhadap rongga perut dan rongga dada serta organ dan jaringan vital.
Hasil pengujian menunjukkan bahwa: (1) selama pengujian berlangsung tidak terdapat mencit yang mati maupun sakit, (2) tidak terdapat perbedaan antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol dalam hal berat badan, pertambahan berat badan, dan kondisi organ dalam, dan (3) tidak ditemukan adanya tanda-tanda kelainan klinis pada mencit akibat pemberian bahan uji.
Dari hasil pengujian toksisitas akut diketahui bahwa tidak terdapat efek toksik pada mencit akibat pemberian protein Barnase sampai dosis 2000 mg/kg BB.
III.3.2.3. Toksisitas Akut Protein Barstar
Pengujian toksisitas akut yang dilakukan terhadap protein Barstar dan hasilnya telah dilaporkan. Protein Barstar yang dihasilkan oleh tanaman kanola PRG event MS11 sangat sedikit, sehingga untuk keperluan pengujian stabilitas protein digunakan protein yang diproduksi pada bakteri E. coli. Kesetaraan protein Barstar yang diproduksi oleh bakteri E. coli dengan yang diekspresikan di dalam tanaman kanola PRG event MS11 diuji dengan menggunakan metode SDS-PAGE, Western blot, analisis sekuen N-terminal, analisis glikosilasi, analisis aktivitas enzimatik, dan analisis pemetaan massa peptida dengan LC/MS. Hasil analisis menunjukkan bahwa protein Barstar yang dihasilkan oleh bakteri E. coli ekivalen dengan protein Barstar yang dihasilkan oleh kanola PRG event MS11 (Rascle, 2010; Criel, 2016).
12
Bahan yang diuji berupa protein Barstar batch number LB300909B*, dengan kemurnian sebesar 93 + 2 %. Sebagai kontrol digunakan bovine serum albumin (BSA batch number LB300909BSA, dengan kemurnian sebesar 98 %). Kedua macam protein tersebut dilarutkan dalam larutan penyangga (Na2CO3 50 mM, pH 9,6) untuk membentuk suspensi dengan konsentrasi sebesar 50 mg/ml, sesaat sebelum dilakukan pencekokan, dan ditaruh dalam tabung plastik tertutup rapat (air-tight) serta ditempatkan di atas es.
Pengujian tersebut dilakukan dengan menggunakan mencit strain Crl:OF1 betina berumur sekitar 7 minggu sebanyak 10 ekor dengan berat badan antara 23,5 - 26,8 g, yang diperoleh dari Charles River Laboratories, Saint Germain sur l’Arbresle, Perancis.
Pengujian toksisitas akut protein Barstar sebagai dosis tunggal dilakukan dengan cara cekokan yang dilakukan pada hari pertama perlakuan, diikuti dengan periode observasi selama 15 hari. Pemberian bahan uji dilakukan dengan menggunakan sonde lambung. Disain percobaan yang digunakan adalah sebagai berikut: kelompok 1 (5 ekor mencit) diberi cekokan suspensi protein BSA dengan dosis 1000 mg/kg BB; kelompok 2 (5 ekor mencit) diberi cekokan suspensi protein Barstar dengan dosis 1000 mg/kg BB. Volume suspensi protein BSA maupun protein Barstar yang diberikan adalah 20 ml/kg BB.
Pengamatan klinis dilakukan setiap hari selama pengujian berlangsung. Penimbangan berat badan dilakukan pada hari sebelum pemberian bahan uji dan kemudian dilakukan setiap minggu, dan penimbangan terakhir dilakukan sebelum mencit dimatikan. Konsumsi pakan dihitung setiap minggu. Pada hari terakhir pengujian (hari ke-16) semua mencit di-eutanasia dengan isofluran, kemudian dilakukan pembedahan (necropsy) dan pemeriksaan anatomi makroskopis terhadap rongga perut dan rongga dada serta organ dan jaringan vital.
Hasil pengujian menunjukkan bahwa: (1) selama pengujian berlangsung tidak terdapat mencit yang mati maupun sakit, (2) tidak terdapat perbedaan antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol dalam hal berat badan, pertambahan berat badan, konsumsi pakan dan kondisi organ dalam, dan (3) tidak ditemukan adanya tanda-tanda kelainan klinis pada mencit akibat pemberian bahan uji.
Dari hasil pengujian toksisitas akut diketahui bahwa tidak terdapat efek toksik pada mencit akibat pemberian protein Barstar sampai dosis 1000 mg/kg BB.
Berdasarkan hasil pengkajian toksisitas yang meliputi analisis bioinformatika dan toksisitas akut, dapat disimpulkan bahwa kanola PRG event MS11 termasuk ke dalam golongan bahan yang tidak toksik.
13 IV. Kesimpulan
Berdasarkan hasil pengkajian tentang informasi genetik, kesepadanan substansial, alergenisitas, dan toksisitas disimpulkan hal-hal sebagai berikut:
1. Kanola PRG event MS11 mengandung tiga gen sisipan yaitu bar, barnase dan barstar; tidak mengandung sekuen backbone dari plasmid transformasi pTCO113; T-DNA dalam kanola PRG event MS11 stabil sampai lima generasi, yaitu T2, T3, F1, BC1 dan BC2, dan diwariskan mengikuti hukum Mendel;
2. Kanola PRG event MS11 sepadan secara substansial dengan Kanola non PRG; tidak menunjukkan adanya potensi menimbulkan alergi; dan termasuk ke dalam bahan yang tidak bersifat toksik;
3. TTKH menilai bahwa Kanola PRG event MS11 yang diajukan adalah aman untuk dikonsumsi sebagai bahan pangan;
4. Apabila kemudian ditemukan data dan informasi baru yang tidak sesuai dengan data keamanan pangan yang diperoleh hingga saat ini, maka status keamanan pangan Kanola PRG event MS11 perlu dikaji ulang;
5. Apabila setelah ditetapkan aman pangan, kemudian Kanola PRG event MS11 terbukti menimbulkan dampak negatif terhadap kesehatan manusia maka pemohon wajib melakukan tindakan pengendalian dan penanggulangan, serta menarik Kanola PRG event MS11 dari peredaran;
6. Kanola PRG event MS11 tidak boleh digunakan sebagai pakan sampai memperoleh sertifikat aman pakan; dan
7. Kanola PRG event MS11 tidak boleh dibudidayakan sampai ditetapkan aman lingkungan.
V. Daftar Acuan
Bayer CropScience, 2012. Barnase protein produced in E. coli. Certificate of Analysis BBS11-008v1. Bayer CropScience N.V. Regulatory Science – Protein and Product Characterization. Technologiepark 38, B-9052 Gent, Belgium.
Bayer CropScience, 2012. Barstar protein produced in E. coli. Certificate of Analysis BBS11-009v1. Bayer CropScience N.V. Regulatory Science – Protein and Product Characterization. Technologiepark 38, B-9052 Gent, Belgium.
Blanck M, 2014. PAT/bar Protein: Acute Toxicity by Oral Gavage in Mice. Study Number: SA 13239, Study Report Number: SA 13239, Test Facility: Bayer S.A.S., Bayer CropScience 355, rue Dostoïevski CS 90153, Valbonne 06906, Sophia Antipolis Cedex, France.
Bushey, D.F., Bannon, G.A., Delaney, B.F. et al. 2014. Charactheristics and safety assessment of intractable proteins in genetically modified crops. Regul. Toxicol. Pharmacol. 69: 154–170
Capt, A. 2017. PAT/bar protein: Amino acid sequence homology search with known allergens and known toxins. Study Report No. TXTPS002. Bayer SAS Crop Science
14
Division, 355 rue Dostoïevski CS 90153, Valbonne 06906 Sophia Antipolis Cedex, France. Report Completed on April 11, 2017.
Criel. I. 2016. Comparability of the Barstar protein from MS11 Brassica napus plants with the recombinant protein batch 1340_Barstar. Study Report No. 15-RSLJS064. Bayer CropScience N.V. Innovation Center– Seed & Trait Safety, Technologiepark 38, B-9052 Gent, Belgium. Report Completed on February 29, 2016.
Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P. and Goodman, H.M. 1982. Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. Journal of Molecular andApplied Genetics 1(6):561-573.
Dhaese P., De Greve H., Gielen J., Seurinck L., Van Montagu M., Schell J. 1983. Identification of sequences involved in the polyadenylation of higher plant nuclear transcripts using Agrobacterium T-DNA genes as models. The EMBO journal, 2(3): 419-426.
Dharmasri, C., New, S, Kanobe, C. 2016. MS11 Brassica napus – Summary of Protein Expression Analyses of Field Samples Grown in Canada and the USA during 2014. Study Report No. 14-RSBBS028. Bayer CropScience LP, Seed & Trait Safety, 407 Davis Drive, Morrisville, NC USA 27560. Report Completed on March 2, 2016.
Hartley R.W. 1988. Barnase and barstar, expression of its cloned inhibitor permits expression of a cloned ribonuclease. Journal of Molecular Biology 202: 913-915. Jeffries, A.T., Dharmasri, C., Gillikin, N., and Su H. 2017. MS11 B. napus – Composition Analysis of Field Samples Grown in Canada and the USA during 2014. Bayer CropScience LP, 2 T.W. Alexander Drive, Research Triangle Park, NC 27709. Lautraite, S. 2012a. Barnase protein: in vitro digestibility study in human simulated gastric fluid at pH 1.2. Study Report No. SA 11361. Bayer SAS Crop Science Division, 355 rue Dostoïevski CS 90153, Valbonne 06906 Sophia Antipolis Cedex, France. Report Completed on April 25, 2012.
Lautraite, S. 2012b. Barnase protein: in vitro digestibility study in human simulated intestinal fluid. Study Report No. SA 11362. Bayer SAS Crop Science Division, 355 rue Dostoïevski CS 90153, Valbonne 06906 Sophia Antipolis Cedex, France. Report Completed on April 26, 2012.
Lautraite, S. 2012c. Barstar protein - In vitro digestibility study in human simulated gastric fluid at pH 1.2. Study Report No. SA 11358. Bayer SAS Crop Science Division, 355 rue Dostoïevski CS 90153, Valbonne 06906 Sophia Antipolis Cedex, France. Report Completed on April 25, 2012.
Moore, T. 2012. The Heat Stability of Microbially Produced Barnase Assessed by SDS-PAGE and Western Blot Analyses. Study Report No. 2-RSFET034. Bayer CropScience LP, Regulatory Science, 3500 Paramount Parkway, Morrisville, NC USA 27560. Report Completed on October 30, 2012.
Peeters, K., 2015. Description of Vector pTCO113. Study Number: BIO2-070_VectDescript_25. Test Facility: Bayer CropScience Technologiepark 38, 9052 Zwijnaarde, East Flanders, Gent, Belgium.
15
Peeters, K. 2016. Structural stability analysis of Brassica napus MS11. Study Number: 15-RSLJS017. Test Facility: Bayer CropScience N.V. – Innovation Center Seed & Trait Safety Technologiepark 38, Gent, Belgium.
Peeters, K. 2017. Detailed insert characterization and confirmation of the absence of vector backbone sequence in Brassica napus MS11 - Amended final report 1. Study Number: 14-RSLJS018. Test Facility: Bayer CropScience N.V. – Innovation Center Seed & Trait Safety Technologiepark 38, Gent, Belgium.
Rascle, J. B., 2010. Barstar Protein, Acute Toxicity by Oral Gavage in Mice. Testing Facility: Bayer CropScience, 355, rue Dostoievski, BP 153, 06903. Sophia Antipolis, Cedex, France. Sponsor: Bayer AG, Bayer CropScience, Alfred Nobel Str. 50, 40789 Monheim, Germany.
Rascle, J. B. 2009a. PAT/bar protein: in vitro digestibility study in human simulated gastric fluid. Study Report No. SA 09045. Bayer SAS Crop Science Division, 355 rue Dostoïevski CS 90153, Valbonne 06906 Sophia Antipolis Cedex, France. Report Completed on June 5, 2009.
Rascle, J. B. 2009b. PAT/bar protein: in vitro digestibility study in human simulated intestinal fluid. Study Report No. SA 09046. Bayer SAS Crop Science Division, 355 rue Dostoïevski CS 90153, Valbonne 06906 Sophia Antipolis Cedex, France. Report Completed on June 12, 2009; amended on June 28, 2016.
Rascle, J. B. 2016a. Barnase protein - Amino acid sequence homology search with known allergens and known toxins. Study Report No. TXFEN016. Bayer SAS Crop Science Division, 355 rue Dostoïevski CS 90153, Valbonne 06906 Sophia Antipolis Cedex, France. Report Completed on June 12, 2009; amended on April 11, 2016. Rascle, J. B. 2016b. Barstar protein - Amino acid sequence homology search with known allergens and known toxins. Study Report No. TXGWN016. Bayer SAS Crop Science Division, 355 rue Dostoïevski CS 90153, Valbonne 06906 Sophia Antipolis Cedex, France. Report Completed on June 12, 2009; amended on April 11, 2016. Serrano, H. 2014a. The effect of temperature on microbially-produced Barnase assessed by the Barnase quantitative activity assay. Study Report No. 14-RSFEN015. Bayer Crop Science LP, Seed & Trait Safety, 407 Davis Drive, Morrisville, NC USA 27560. Report Completed on July 01, 2014.
Serrano, H. 2014b. The effect of temperature on microbially-produced Barstar assessed by the Barstar quantitative activity assay. Study Report No. 14-RSGWN014. Bayer Crop Science LP, Seed & Trait Safety, 407 Davis Drive, Morrisville, NC USA 27560. Report Completed on July 02, 2014.
Serrano, H. 2016. The effect of temperature on PAT/bar as assessed by the PAT quantitative activity assay. Study Report No. 16-RSTPS004. Bayer Crop Science LP, Seed & Trait Safety, 407 Davis Drive, Morrisville, NC USA 27560. Report Completed on May 16, 2016.
Seurinck J., Truettner J., Goldberg R.B. 1990. The nucleotide sequence of an anther-specific gene. Nucleic Acids Research 18: 3403.
16
Thompson, C. J., Movva, N. R., Tizard, R., Crameri, R., Davies, J. E., Lauwereys, M., and Botterman, J. 1987. Characterization of the herbicide-resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus. The EMBO Journal, 6 (9): 2519-2523.
Totis, M., 2014. Barnase Protein. Acute Toxicity Study by Oral Gavage in Mice. Study Number: SA 14025. Test Facility: Bayer S.A.S., Bayer CropScience, 355, rue Dostoïevski, CS 90153, Valbonne, 06906 Sophia Antipolis Cedex, France.
Vandermarliere, N. 2015. Characterization of plant produced PAT/bar protein purified from MS11 Brassica napus plants (batch 1520_PATbar (MS11)) and comparability with the recombinant protein batch 1215_PATbar. Study Report No. 5-RSLJS020. Bayer CropScience N.V. Innovation Center– Seed & Trait Safety, Technologiepark 38, B-9052 Gent, Belgium. Report Completed on December 17, 2015.
Wierckx, A. 2013. Characterization of the recombinant Barnase protein batch no 1205_ Barnase. Study Report No. BBS12-036. Test Facility: Bayer CropScience N.V. – Innovation Center Seed & Trait Safety Protein and Product Characterization Technologiepark 38 B-9052 Gent, Belgium.
