AMPLIFIKASI DAN KARAKTERISASI IN SILICO DAERAH
PENGAPIT UJUNG 5’ GEN APETALA1 KAKAO
(Theobroma cacao L.)
ELLEN MAIDIA DJATMIKO
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010
ABSTRAK
ELLEN MAIDIA DJATMIKO. Amplifikasi dan Karakterisasi In Silico Daerah
Pengapit Ujung 5‘ Gen APETALA1 Kakao (Theobroma cacao L.). Dibimbing
oleh EMAN KUSTAMAN dan DJOKO SANTOSO.
Kakao merupakan salah satu komoditas ekspor Indonesia yang penting
meskipun produktivitas tanaman kakao di Indonesia masih tergolong rendah.
Salah satu penyebabnya adalah panjangnya masa tanaman belum menghasilkan.
Usaha untuk meningkatkan produktivitas tanaman kakao mendorong studi
molekuler gen-gen pembungaan pada tanaman kakao. Pada Arabidopsis
dilaporkan APETALA1 (AP1) merupakan gen yang mengontrol transisi
pembungaan dan pembentukan sepal dan petal. Penelitian ini bertujuan untuk
mengamplifikasi daerah pengapit ujung 5’ gen APETALA1 dari kakao
(Theobroma cacao L) dan menganalisis sifat promoter hasil amplifikasi.
Amplifikasi daerah pengapit ujung 5’ gen APETALA1 dengan teknik Thermal
Asymmetric Interlaced-PCR (TAIL-PCR) menunjukkan pasangan primer spesifik
dan primer acak yang digunakan berhasil mengamplifikasi daerah pengapit ujung
5’ gen APETALA1. Selanjutnya hasil amplifikasi ditransformasi ke dalam sel
kompeten E. coli XL-1 Blue dengan vektor pGEM-T Easy. Hasil analisis
bioinformatika dengan program penganalisis promoter online softberry
menunjukkan tidak ditemukannya kotak TATA/enhanser pada sekuen dan sekuen
mengandung 11 motif fungsional promoter tanaman. Analisis lebih lanjut
mengindikasikan bahwa sekuen hasil amplifikasi merupakan promoter dari jenis
ABSTRACT
ELLEN MAIDIA DJATMIKO. Amplification and In Silico Characterization
5’-Flanking Regions APETALA1 gene from Cacao (Theobroma cacao L.). Under the
direction of EMAN KUSTAMAN and DJOKO SANTOSO.
Cacao is one of important export comodities in Indonesia but its
productivity is still in low category. The long juvenile phase is one of the cause of
low productivity of cacao plantations. The effort to increase productivity drives on
cacao studies of molecular flowering gene. In Arabidopsis, APETALA1 functions
in earlier developmental stages in determination of the floral meristem identity
and one of flowering identity genes that determines the formation of sepal and
petal tissues. The purposes of the research are to amplify 5’-flanking regions
APETALA1 gene from cacao (Theobroma cacao L.) and analyse its promoter
characteristic. Amplification of 5’-flanking regions APETALA1 gene using
Thermal Asymmetric Interlaced-PCR (TAIL-PCR) technique shows that spesific
primer and arbitrary primer pairs can amplify the flanking region. Futhermore this
fragment were transformed at competent cell E. Coli XL-1 Blue by using
pGEM-T Easy vector. pGEM-The result of bioinformatic analysis using online promoter analysis
software softberry shows undiscovered TATA box/enhancer on the amplified
sequence and it contains 11 motifs of plant functional promoter element. Further
analysis indicated that the amplified sequence belong to TATA-less promoter
group with core motif microsatellite (CG)
n.AMPLIFIKASI DAN KARAKTERISASI IN SILICO DAERAH
PENGAPIT UJUNG 5‘ GEN APETALA1
KAKAO (Theobroma cacao L.)
ELLEN MAIDIA DJATMIKO
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh
Sarjana Sains pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010
Judul Skripsi : Amplifikasi dan Karakterisasi In Silico Daerah Pengapit Ujung 5’
Gen APETALA1 Kakao (Theobroma cacao L.)
Nama
: Ellen Maidia Djatmiko
NIM
: G84051010
Disetujui
Komisi Pembimbing
Ir. Eman Kustaman
Dr. Djoko Santoso
Ketua
Anggota
Diketahui
Dr. Ir. I Made Artika, M. App. Sc
Ketua Departemen Biokimia
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT karena berkat rahmat
dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan penelitian dengan judul
Amplifikasi dan Karakterisasi In Silico Daerah Pengapit Ujung 5’ Gen
APETALA1 pada Kakao (Theobroma cacao L.) Kegiatan penelitian dilakukan di
Laboratorium Biologi Molekuler dan Rekayasa Genetika, Balai Penelitian
Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI) dari bulan Maret hingga November
2009.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah
membantu dalam penyelesaian penelitian ini, terutama kepada Ir. Eman Kustaman
selaku pembimbing utama, Dr. Djoko Santoso selaku pembimbing kedua dan Dr.
Darmono Taniwiryono, M.Sc. sebagai Kepala BPBPI. Ucapan terimakasih juga
penulis sampaikan pada papa, mama dan adik-adikku (Taqin, Diman, Aman) atas
semua doa, dukungan, dan bimbingan yang sangat berarti bagi penulis. Penulis
juga berterima kasih kepada Teh Nina, Teh Herti, Teh Riana, Teh Rini, Teh
Niyyah, Teh Alin, seluruh staf BPBPI, teman-teman Biokimia ’42 (terutama
sahabat-sahabatku : Saeli, Ratna Dewi, dan Izza) dan juga teman-teman di Wisma
Wina. Semoga penelitian ini dapat memberikan manfaat bagi semua pihak yang
membutuhkannya demi kemajuan ilmu pengetahuan.
Bogor, Juni 2010
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Palangkaraya pada tanggal 5 Desember 1987 dari
pasangan Didik Djatmiko dan Mutmainah. Penulis merupakan anak pertama dari
empat bersaudara.
Tahun 2005 penulis lulus dari SMA Negeri 5 Palangkaraya dan melanjutkan
pendidikannya di IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis
memilih program studi mayor Biokimia, Departemen Biokimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam sebagai pilihan studi di IPB.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis mengikuti beberapa acara
kepanitiaan diantaranya Pesta Sains Nasional tahun 2007 dan masa pengenalan
departemen Biokimia tahun 2007/2008. Penulis melakukan Praktik Lapang di
Laboratorium Biologi Molekuler dan Rekayasa Genetika, Balai Penelitian
Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI) Bogor selama bulan Juli-Agustus
2008 dengan judul Pengujian Aktivitas Enzim Selulase dari Fungi Aspergillus
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ... ix
DAFTAR TABEL ... ix
DAFTAR LAMPIRAN ... x
PENDAHULUAN ... 1
TINJAUAN PUSTAKA
Kakao (Theobroma cacao L.) ... 1
Gen APETALA (AP1) ... 2
Promoter ... 3
PCR (Polimerase Chain Reaction ) ... 4
TAIL-PCR (Thermal Asymmetric Interlaced-PCR) ... 5
Bioinformatika ... 5
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat ... 6
Metode ... 7
HASIL DAN PEMBAHASAN
DNA Daun Kakao Hasil Isolasi ... 10
Primer Spesifik Gen dan Primer Acak ... 12
Amplikon Daerah Pengapit Ujung 5’ Gen TcAP1 ... 13
Ekstraksi dan Purifikasi DNA Hasil TAIL-PCR ... 14
Pengklonan Hasil TAIL-PCR ... 15
Hasil Analisis Pengurutan Sekuen ... 16
SIMPULAN DAN SARAN ... 20
DAFTAR PUSTAKA ... 20
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Pohon, Bunga dan Buah kakao ... 2
2
Model Gen ABC ... 2
3
Konsensus promoter dan bagian-bagiannya ... 3
4
Tahapan PCR ... 4
5
Tahapan TAIL-PCR ... 6
6
Elektroforegram sampel DNA daun kakao ... 10
7
Analisis BLAST gen TcAP1 dengan sekuen genom referensi ... 13
8
Elektroforegram TAIL-PCR ... 14
9
Elektroforegram purifikasi DNA hasil PCR ... 15
10
Elektroforegram PCR koloni ... 16
11
Elektroforegram hasil isolasi plasmid ... 16
12
Urutan basa hasil amplifikasi terhadap gen TcAP1 (484 bp) ... 17
13
Konsensus sekuen untuk 2 promoter sekuen eukariotik ... 18
DAFTAR TABEL
Halaman
1
Program TAIL-PCR ... 8
2
Analisis kuantitatif DNA daun kakao ... 10
3
Hasil perancangan primer TAIL-PCR ... 14
4
Kombinasi primer TAIL-PCR ... 14
5
Hasil analisis NSITE ... 19
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
Tahapan penelitian ... 23
2
Komposisi larutan sediaan ... 24
3
Hasil BLAST gen TcAP1 dengan sekuen genom referensi ... 25
4
Elektroforegram sekuensing TcAP1 forward ... 25
5
Elektroforegram sekuensing TcAP1 reverse ... 26
6
Hasil analisis program TSSP Softberry ... 26
6
PENDAHULUAN
Kakao merupakan salah satu komoditi ekspor utama Indonesia. Tahun 2002 sampai tahun 2006, Indonesia merupakan produsen kakao terbesar ketiga setelah Pantai Gading dan Ghana. Indonesia saat ini menjadi produsen bahan baku kakao kedua terbesar setelah Pantai Gading dengan menguasai 6% pasar dunia. Kakao memiliki prospek yang cerah karena kebutuhan kakao dunia cenderung meningkat tiap tahunnya terutama di negara-negara maju (Departemen Perindustrian 2007).
Keberhasilan Indonesia menjadi salah satu produsen kakao terbesar dunia tak lepas dari program perluasan dan peningkatan produksi yang mulai dilaksanakan sejak awal tahun 1980 an. Perkebunan Indonesia mengalami perkembangan pesat dalam kurun waktu 20 tahun terakhir dan luas lahan tanaman kakao Indonesia kurang lebih 992.448 Ha dengan produksi biji kakao sekitar 456.000 ton per tahun. Produktivitas lahan kakao rata-rata 900 Kg per ha. Kebutuhan kakao dalam negeri masih dianggap sedikit, sekitar 250 ribu ton per tahun, sehingga hasil produksi petani cenderung untuk memenuhi kebutuhan ekspor (Departemen Perindustrian 2007).
Indonesia sebenarnya berpotensi untuk menjadi produsen utama kakao dunia. Rendahnya produktivitas perkebunan merupakan penghalang Indonesia mencapai posisi ini. Hal ini disebabkan berbagai kendala yang dihadapi petani di lapangan seperti lamanya waktu berbunga, bunga yang mudah layu, rendahnya keberhasilan penyerbukan bunga dan serangan hama pada tanaman terutama hama yang menyerang buah. Tersedianya lahan perkebunan kakao yang telah ada seharusnya dapat memberikan peluang untuk menghasilkan produksi kakao yang lebih besar lagi dengan pengelolaan tanaman yang tepat dan penggunaan bibit kakao dengan produktivitas tinggi.
Salah satu penyebab rendahnya produktivitas perkebunan Indonesia adalah lamanya masa tanaman belum menghasilkan pada tanaman kakao. Tanaman kakao baru mulai berbunga pada usia 2-6 tahun. Tanaman kakao dewasa umumnya dapat menghasilkan 50 ribu bunga tetapi hanya 5% saja yang berkembang menjadi buah (McMahon et al 2007). Menurut model pembungaan yang digambarkan sebagai model gen ABC, beberapa gen bertanggung jawab terhadap mekanisme pembungaan pada tanaman. Salah satu gen yang bertanggung jawab terhadap
pembungaan adalah APETALA1 (AP1). Gen ini berfungsi mengontrol transisi pembungaan dan menginduksi pembentukan sepal dan petal.
Homolog AP1 telah berhasil diklon Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia dari organ bunga kakao dan pengujian ekspresinya menunjukkan ekspresi konstitutif
TcAP1 (Theobroma cacao AP1) pada level
sedang mampu menginduksi pembungaan in
vitro pada planlet tembakau transgenik
(Chaidamsari et al 2006). Perubahan fenotip pada jeruk transgenik yang disisipkan gen
AtLEAFY (Arabidopsis thaliana LEAFY) atau AtAP1 (Arabidopsis thaliana AP1) yang
berasal dari Arabidopsis thaliana mampu memperpendek masa tanaman belum menghasilkan pada jeruk (Pena et al 2001). Pembungaan yang diinduksi gen TcAP1 diharapkan dapat lebih diamati mekanismenya ketika gen TcAP1 diekspresikan dengan promoternya.
Penelitian ini bertujuan mengamplifikasi daerah pengapit ujung 5’ gen TcAP1 dan menganalisis hasil amplifikasinya. Hipotesis penelitian ini adalah teknik TAIL-PCR mampu mengamplifikasi daerah pengapit ujung 5’ gen
TcAP1 dari daun kakao. Tahapan penelitian
yang dilakukan antara lain perancangan primer, isolasi DNA genomik dari daun kakao, uji kualitas dan kuantitas DNA, amplifikasi daerah promoter dengan TAIL-PCR, ekstraksi dan purifikasi DNA hasil TAIL-PCR, kloning fragmen gen, PCR koloni dan sekuensing fragmen gen terklon. Karakterisasi
in silico daerah pengapit ujung 5’ gen TcAP1
hasil amplifikasi dilakukan dengan program
BioEdit dan softberry. Hasil penelitian ini
diharapkan dapat memberikan informasi urutan basa promoter putatif gen TcAP1 yang nantinya dapat digunakan untuk mempelajari pengaruh zat penginduksi pembungaan untuk menginduksi gen TcAP1.
TINJAUAN PUSTAKA
Kakao (Theobroma cacao L.)Kakao merupakan tanaman berdaun lebar yang selalu hijau dan tumbuh sampai 5-8 m dalam perkebunan dan mencapai tinggi lebih dari 15 m di hutan. Tumbuhan ini memiliki bunga sempurna, memiliki stamen dan pistil dan mengalami penyerbukan sendiri atau silang untuk pembentukan buah. Buah kakao berbentuk oval dan memiliki rongga di dalamnya, panjang 10-50 cm dan mengandung 30-50 biji, yang tiap bijinya
2
dikelilingi getah putih yang disebut pulp. Buah umumnya matang dalam 5-6 bulan pada jenis klon dan dipanen mingguan ketika buah berubah warna menjadi merah atau kuning (McMahon et al 2007). Tanaman kakao termasuk dalam divisi Spermatophyta, subdivisi Angiospermae, kelas Dicotyledone, ordo Malvales, famili Sterculiaceae, genus Theobroma, dan spesies Theobroma cacao L (Gambar 1).
Coklat berasal dari biji kakao yang telah melalui serangkaian proses sebelum dipasarkan. Buah kakao yang telah matang, dibuka dan diambil bijinya. Pulp disekitar biji dibuang melalui proses fermentasi selama 3-8 hari yang menyebabkan suhu naik sampai 51 °C. Proses ini membunuh embrio dalam biji dan menghasilkan beberapa prekusor kimia yang memberi rasa coklat ketika biji kemudian dikeringkan dan dibakar (McMahon
et al 2007). Biji yang telah dibakar siap untuk
diproses menjadi berbagai produk olahan coklat.
Konsumsi kakao cenderung meningkat tiap tahunnya terutama di negara-negara maju. Hal ini menimbulkan peluang untuk meningkatkan produksi kakao Indonesia. Kakao Indonesia memiliki kelebihan yaitu tidak mudah meleleh (melting point cocoa
butter tinggi) sehingga cocok bila dipakai
untuk campuran, tidak mengandung pestisida dibanding biji kakao dari Ghana maupun Pantai Gading dan apabila difermentasi memiliki citarasa setara dengan kakao yang berasal dari Ghana.
Berbagai kelebihan tersebut tidak ditunjang dengan produktivitas perkebunan yang tinggi. Indonesia sebagai negara produsen kakao terbesar ketiga dunia masih memiliki tingkat produktivitas yang rendah (Departemen Perindustrian 2007). Berbagai kendala di lapangan merupakan penyebabnya, diantaranya lamanya masa tanaman belum menghasilkan pada tanaman kakao. Tanaman kakao baru mulai berbunga pada usia 2-6 tahun (McMahon et al 2007). Hal ini mendorong studi molekuler gen-gen pembungaan pada tanaman kakao.
(a) (b) (c
Gambar 1 Pohon (a), bunga (b) dan buah kakao (c).
Gen APETALA1 (AP1)
APETALA1 (AP1) merupakan salah satu
gen identitas pembungaan yang mengendalikan terbentuknya jaringan sepal dan petal. Menurut model gen pembungaan ABC, pembentukan bunga pada tanaman memerlukan keberadaan serangkaian gen untuk membentuk bagian-bagian dari bunga sempurna (Gambar 2). Gen A berperan dalam pembentukan sepal. Ekspresi gen A dan gen B akan menginduksi pembentukan petal. Ekspresi gen B dan gen C menginduksi pembentukan stamen sedangkan ekspresi gen C saja akan menghasilkan karpel (Lea & Leegood 1999).
Gen AP1 selain berperan sebagai gen A dalam pembentukan sepal dan petal juga berfungsi sebagai gen pengendali transisi pembungaan. Gen AP1 dan gen LEAFY dapat saling menginduksi satu sama lain sehingga terjadi perubahan dari perkembangan vegetatif menjadi pembungaan. Gen LEAFY sendiri merupakan gen kunci inisiasi pembungaan yang menginduksi gen-gen model ABC untuk membentuk organ-organ bunga (Wagner et al 1999). Menurut Pena et al (2001), perubahan fenotip pada jeruk transgenik yang disisipkan gen AtLEAFY atau AtAP1 yang berasal dari
Arabidopsis thaliana mampu memperpendek
masa tanaman belum menghasilkan pada jeruk. Hal ini membuka peluang perbaikan produktivitas tanaman kakao yang memiliki masa tanaman belum menghasilkan yang panjang.
3
Homolog AP1 telah berhasil diklon Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia dari organ bunga kakao (TcAP1) dengan kombinasi techniques dan
bio-informatics. Gen TcAP1 telah diuji ekspresinya dengan konstruksi transgenesis konstitutif 35S-TcAP1 menggunakan teknik
leaf disk eksplan daun tembakau dengan
mediasi Agrobacterium tumefaciens. Hasil pengujian ekspresinya menunjukkan ekspresi konstitutif TcAP1 pada level sedang mampu menginduksi pembungaan in vitro pada planlet tembakau transgenik (Chaidamsari et
al 2006). Hal ini menunjukkan pengaturan
ekspresi gen TcAP1 dapat menginduksi pembentukan bunga pada tanaman-tanaman yang memiliki masa tanaman belum menghasilkan yang lama seperti tanaman kakao. Mekanisme pembungaan yang diinduksi gen TcAP1 diharapkan dapat lebih diamati mekanismenya ketika gen TcAP1 diekspresikan dengan promoternya.
Promoter
Promoter merupakan daerah pada DNA tempat RNA polimerase II dapat melekat untuk mengawali proses transkripsi. Suatu promoter mencakup titik awal (startpoint) transkripsi (nukleotida tempat sintesis RNA yang sebenarnya dimulai) dan membentang beberapa pasang lusin nukleotida “upstream” (ke depan) dari titik awal. Fungsi lain promoter adalah menentukan utas DNA mana yang digunakan sebagai cetakan dari dua untai heliks DNA (Campbell et al 2002).
Promoter umumnya terletak pada daerah pengapit ujung 5’ gen yang diatur ekspresinya seperti yang terlihat pada Gambar 3. Daerah promoter terbagi menjadi 2 kelompok, yaitu daerah promoter proksimal dan daerah promoter distal. Daerah promoter proksimal berfungsi sebagai tempat inisiasi transkripsi dan daerah promoter distal berfungsi dalam regulasi ekspresi gen.
Daerah promoter proksimal terdiri atas 3 daerah, yaitu titik awal transcripsi (TCS), kotak TATA yang berfungsi menginisiasi transkripsi dengan mengarahkan RNA polimerase ke titik awal traskripsi dan kotak CAAT atau kotak AGGA yang diduga berfungsi mengatur inisiasi transkripsi pada gen tertentu (Lea & Leegood 1999). Posisi kotak TATA umumnya terletak -25 bp dari titik awal transkripsi sedangkan kotak CAAT berada antara -80 sampai -110 bp dari titik awal transkripsi (Held 2005). Daerah promoter distal diduga memainkan peranan dalam interaksi promoter dengan faktor transkripsi (Lea & Leegood 1999).
Bagian-bagian tertentu suatu promoter sangat penting untuk pengikatan RNA polimerase. Suatu kumpulan protein yang disebut faktor transkripsi pada eukariota menjadi perantara antara pengikatan polimerase RNA dan inisiasi transkripsi. Setelah faktor transkripsi tertentu terikat pada promoter barulah RNA polimerase mengikatkan diri pada promoter tersebut. Susunan lengkap antara faktor transkripsi RNA polimerase yang mengikatkan diri pada promoter disebut kompleks inisiasi transkripsi.
Interaksi antara faktor transkripsi, RNA polymerase dan promoter biasanya tidak menghasilkan transkripsi yang efisien sehingga hanya menghasilkan tingkat inisiasi yang rendah dan sedikit. Beberapa elemen kontrol berfungsi meningkatkan tingkat transkripsi eukariot dengan cara mengikat faktor transkripsi tambahan. Elemen kontrol ini berada pada daerah promoter distal dan disebut enhancer yang letaknya ribuan nukleotida jauhnya dari promoter dan bahkan berada pada arah down stream dari gen. Daerah promoter distal juga dapat mengandung silencer, elemen kontrol yang menurunkan tingkat transkripsi gen (Campbell
et al 2002).
Gambar 3 Konsensus promoter dan bagian-bagiannya (Held 2005).
Bagian-bagian promoter: elemen pengontrol transkripsi, kotak CAAT, kotak TATA dan titik awal transkripsi.
elemen pengontrol transkripsi kotak CAAT kotak TATA
titik awal transkripsi
ekson basa
4
Kerjasama antara faktor transkripsi DNA yang terikat pada enhancer mengakibatkan pembengkokan DNA sehingga faktor transkripsi pada enhancer dapat berinteraksi dengan protein dari kompleks inisiasi transkripsi promoter. Faktor transkripsi yang dapat mengikatkan diri pada enhancer dan menstimulasi transkripsi gen disebut aktivator yang dapat juga membantu penempatan kompleks transkripsi pada promoter. Kerjasama antara faktor transkripsi DNA yang terikat pada silencer juga mengakibatkan pembengkokan DNA sehingga faktor transkripsi pada silencer dapat berinteraksi dengan protein dari kompleks inisiasi transkripsi promoter. Faktor transkripsi yang dapat mengikatkan diri pada silencer dan menurunkan tingkat transkripsi gen disebut
repressor yang mengakibatkan pelepasan
kompleks transkripsi dari promoter (Campbell
et al 2002)
PCR (Polimerase Chain Reaction )
Reaksi rantai polimerase atau PCR (polimerase chain reaction) merupakan teknik untuk memperbanyak fragmen DNA (amplifikasi) dengan cepat tanpa menggunakan sel (Gambar 4). Metode ini jauh lebih cepat daripada pengklonan gen dengan DNA plasmid atau DNA faga dan seluruhnya dilakukan secara in vitro. DNA diinkubasi dalam tabung reaksi dengan DNA polimerase khusus, nukleotida dan dua buah
potongan pendek untai DNA tunggal sintetik sebagai primer untuk sintesis DNA (Campbel
et al 2002 ).
Informasi sekuen DNA perlu diketahui untuk perancangan dan pembuatan primer yang sesuai. Syarat umum primer untuk PCR yaitu panjang primer sekitar 16-24 nukleotida, %GC 45-55%, kedua primer memiliki Tm (melting point) yang hampir sama, kedua primer tidak komplemen pada ujung 3’ karena akan membentuk primer dimer dan tiap primer tidak memiliki sekuen palindrom yang akan menyebabkan terbentuknya struktur sekunder yang mengganggu penempelan primer pada sekuen target (Chawla 2002).
Teknik PCR merupakan ide Kary Mullis untuk mengamplifikasi DNA dengan menggunakan Taq polimerase dari bakteri
Thermus aquaticus yang hidup dalam sumber
mata air panas (Chawla 2002). Enzim ini tidak seperti sebagian besar protein karena dapat menahan panas yang dibutuhkan untuk memisahkan untai-untai DNA pada tahap awal setiap siklus. Teknik ini cepat, tidak mahal dan sederhana untuk menghasilkan salinan DNA yang banyak dari sumber yang mengandung sangat sedikit DNA bahkan dengan kualitas yang rendah. Kelebihan lain PCR adalah kekhususannya untuk mengamplifikasi urutan DNA tertentu. Primer menentukan urutan DNA yang akan diamplifikasi (Campbel et al 2002 ). Hanya sekuen DNA yang diapit primer saja yang akan teramplifikasi (Chawla 2002).
Gambar 4 Tahapan PCR.
Tiga tahapan PCR : denaturasi DNA, penempelan primer, dan pemanjangan utas DNA baru.
DNA utas ganda
denaturasi DNA penempelan primer pemanjangan utas DNA baru primer maju primer mundur siklus
pertama siklus kedua
5
Teknik PCR terdiri atas tiga tahap. Tahap pertama adalah denaturasi DNA. Campuran reaksi PCR dipanaskan sampai 95 °C untuk mendenaturasi DNA menjadi utas tunggal. Suhu denaturasi dipertahankan kira-kira 1 menit. Tahap kedua adalah renaturasi DNA. Campuran reaksi PCR perlahan didinginkan sampai kira-kira 55 °C untuk membuat primer menempel (anneal) pada sekuen komplemennya yang berupa utas tunggal DNA. Tahap terakhir adalah pemanjangan utas DNA baru. Suhu dinaikkan sampai kira-kira 75 °C. Pada suhu optimum ini, Taq polimerase mulai memperpanjang primer dengan menambahkan nukleotida pada ujung 3‘ hidroksil. Replikasi DNA target adalah daerah yang dibatasi primer. Siklus berulang dan DNA diamplifikasi kembali dengan menggunakan utas DNA awal dan utas DNA baru (Acquaah 2004).
TAIL-PCR (Thermal Asymmetric Interlaced-PCR)
Amplifikasi promoter dan enhancer
merupakan tahapan penting untuk mempelajari regulasi ekspresi gen. Umumnya amplifikasi daerah promoter dilakukan dengan
screening pustaka genom menggunakan
cDNA sebagai probe. Konstruksi dan
screening pustaka genom merupakan proses
yang memerlukan waktu dan biaya. Pencarian solusi dengan metode PCR melahirkan teknik
inverse PCR dan ligation-mediated PCR yang
paling banyak digunakan untuk tujuan ini. Akan tetapi kedua teknik ini tetap mahal dan memerlukan waktu lama. Pengembangan lebih lanjut dengan metode PCR melahirkan teknik TAIL-PCR (Gambar 5). Teknik ini lebih sederhana, murah dan cepat untuk mengamplifikasi promoter (Michiels et al 2003).
Teknik TAIL-PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu primary, secondary dan tertiary PCR. Tiap tahapan TAIL-PCR memiliki tujuan yang berbeda-beda. Primary PCR bertujuan mengamplifikasi daerah pengapit ujung 5’ yang diapit primer spesifik gen (GSP 1) dan primer acak. Secondary PCR bertujuan memperpanjang hasil amplifikasi tahap pertama dengan mengamplifikasi daerah pengapit ujung 5’ yang diapit primer spesifik gen (GSP 2) dengan primer acak yang sama.
Tertiary PCR bertujuan memperbanyak hasil
amplifikasi yang telah diperpanjang.
Teknik TAIL-PCR pertama kali
dikembangkan Liu and Whittier (1995) untuk mengamplifikasi daerah pengapit ujung 5’ yang tidak diketahui. Metode ini awalnya menggunakan nested sequence-specific primers sepanjang 26 nukleotida dan
degenerate primer (primer acak) sepanjang 16
nukleotida. Metode ini terdiri atas
low-stringency dan high-low-stringency cycling untuk
mengamplifikasi daerah spesifik yang tidak diketahui. Metode ini merupakan pengembangan Thermal Asymmetric PCR yang menggunakan 2 primer yang berbeda panjang dan suhu annealing. Siklus PCR pada suhu yang lebih tinggi berguna untuk penempelan primer spesifik gen yang lebih panjang dan suhu yang lebih rendah untuk penempelan primer spesifik gen dan primer acak (Michiels et al 2003). Oleh karena kemampuannya untuk mengamplifikasi daerah pengapit ujung 5’ dari suatu sekuen gen yang telah diketahui, TAIL- PCR banyak digunakan untuk mengamplifikasi daerah promoter dari suatu gen.
Teknik TAIL-PCR mengalami perkem-bangan dan modifikasi. Salah satunya dilakukan oleh Terauchi & Kahl (2000) dengan penggunaan primer acak sepanjang 10 nukleotida dan primer spesifik gen sepanjang 22-35 nukleotida. Modifikasi ini mampu secara cepat mengamplifikasi daerah promoter pada daerah pengapit ujung 5’ gen Pal dari D.
bulbifera dan gen Pgi dari D. tokoro.
Modifikasi metode TAIL-PCR oleh Terauchi & Kahl (2000) inilah yang digunakan sebagai metode dalam amplifikasi promoter gen
TcAP1.
Bioinformatika
Bioinformatika merupakan salah satu cabang ilmu yang menggabungkan kecanggihan penyimpanan data dengan biologi molekuler. Ilmu ini mulai berkembang pada tahun 1970-an ketika program sekuensing otomatis dapat dilakukan dan menghasilkan berbagai data gen dan protein yang besar. Kebutuhan untuk menyimpan dan mengakses data-data analisis biologi molekuler menghasilkan pengembangan berbagai software untuk menyimpan, mengorganisir dan mengakses data dari komputer pada tahun 1980-an. Sejalan dengan perkembangan teknologi informasi, munculnya internet pada tahun 1990-an menimbulkan kemudahan untuk mengakses dan menganalisis berbagai data secara cepat (Chawla 2002).
6
Berbagai software telah dikembangkan untuk membantu penelitian di bidang biologi molekuler. Beberapa diantaranya dapat diakses secara online seperti program BLAST, primer3 dan softberry yang digunakan dalam penelitian ini. Program BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool) merupakan program
pencarian kesamaan yang dirancang untuk mengeksplorasi semua database sekuen yang diminta, baik itu berupa DNA atau protein. Program BLAST juga dapat digunakan untuk mendeteksi hubungan di antara sekuen yang hanya berbagi daerah tertentu yang memiliki kesamaan (Aprijani & Elfaizi 2004). Program primer3 berguna untuk merancang primer sesuai dengan parameter-parameter yang dibutuhkan sedangkan program softberry bermanfaat untuk menganalisis sekuen promoter gen tanaman. Program lain yang digunakan dalam penelitian ini adalah
GeneRunner yang digunakan untuk untuk
mengecek keberadaan struktur sekunder pada primer yang dapat mengganggu reaksi PCR dan BioEdit yang bermanfaat untuk mengolah data electrophoregraph hasil sekuensing.
BAHAN DAN METODE
Bahan dan AlatBahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain daun kakao dari Balai Penelitian dan Bioteknologi Perkebunan Indonesia, N2 cair, polyvinylpoly-pyrrolidone
(PVPP), larutan bufer tris HCl 1 M pH 8.0, NaCl 5 M, larutan EDTA (etilen diamin tetra asetat) 0.5 M pH 8.0, N-cetyl-N,N,N-trimetilamonium bromida (CTAB), natrium sitrat 0.1 M, glukosa 0.35 M, akuades, β -merkaptoetanol, isopropanol, larutan kloroform:isoamilalkohol (24:1), etanol 80%,
Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen),
pGEM-Gambar 5 Tahapan TAIL-PCR.
7
T Easy (Promega), ddH2O, T4 DNA ligase,
bufer ligasi. sel kompeten E. coli XL-1 Blue, media LB (Luria Bertani), dan media LA (Luria Agar) selektif yang telah ditambahkan ampisilin (100 ppm), X-Gal (5-bromo-4-kloro-3-indol-β-D-galaktopiranosi-da) 40 ppm, dan IPTG (isopropil-tiogalaktosidase) 0.1mM. buffer TBE 0.5X, etidium bromida 1% (w/v), loading bufer (brom fenol biru 2.5%, sukrosa 40%), marker 1 kb plus DNA
ladder (Invitrogen) dan High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche).
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain mortar, lemari asam, sentrifus Beckman Allegra 64R, sentrifus Eppendorf 5417R, penangas air, autoklaf, tabung sentrifus 30 mL, tabung mikro 2 mL dan 1.5 mL, pipet Mohr, pipet Eppendorf, Decby freezer -40 °C, Sansio freezer -20 °C, spektrofotometer UV-VIS Beckman Coulter-DU 530, sisir, cetakan agar, bak elektroforesis, adaptor 100 Volt, UV T2201 (Sigma), mesin PCR (Biometra T-Personal), DNA speed vacuum 110 savant, shaker inkubator, laminar air flow cabinet, autoklaf, pH meter, dan peralatan-peralatan gelas seperti cawan petri, gelas piala, labu Erlenmeyer, dan gelas ukur.
Metode Isolasi DNA Genomik Kakao
Metode isolasi DNA genomik yang digunakan dalam penelitian ini merupakan modifikasi dari Couch dan Fritz (1990) dan Khanuja et al (1999). Daun kakao muda digunakan sebagai sumber DNA genomik dalam penelitian ini. Daun yang dipilih memiliki ciri-ciri daun lemas dan berwarna kehijauan. Daun-daun ini kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan dengan tissue. Daun-daun yang telah bersih dipisahkan dari bagian daun yang rusak, dipotong kecil-kecil dan ditimbang sebanyak 4 g. Potongan daun yang telah ditimbang kemudian dibungkus aluminium foil dan dicelupkan ke dalam N2 cair.Bungkus
aluminum foil dibuka dan daun kemudian digerus di dalam mortar dengan N2 cair dan
0.4 g polyvinylpoly-pyrrolidone (PVPP). Setelah halus, 15 mL buffer ekstraksi ditambahkan ke dalam mortar sedikit demi sedikit sambil memindahkan daun ke dalam blender.
Campuran daun dan buffer ekstraksi kemudian dihomogenisasi dalam blender selama 2 menit dengan kecepatan maksimum
dan tiap 30 detik proses homogenisasi dihentikan. Homogenat kemudian disaring dengan cheese cloth. Filtrat yang didapatkan kemudian disentrifus selama 15 menit pada 15 000 rpm suhu 4 °C. Supernatan dibuang dan pelet kemudian diresuspensi dalam 10 mL buffer lisis dengan cara dibolak-balik selama 5 menit. Setelah diinkubasi pada 60oC selama 1 jam sambil sesekali dikocok dengan membolak-balikan tabung, sampel kemudian diekstraksi dengan penambahan 10 mL larutan kloroform: isoamilalkohol (24:1) atau KI. Campuran kemudian dibolak-balik selama 10 menit dan disentrifus pada 10.000 rpm dan suhu 4 oC selama 10 menit. Setelah itu lapisan atas dipindahkan ke dalam tabung baru dan proses ekstraksi diulang.
Lapisan atas dari hasil ekstraksi yang kedua dicampur perlahan-lahan dengan 2 mL NaCl 5M dan dibolak-balik sampai larut. Campuran kemudian ditambahkan 3,6 mL isopropanol dan dibolak balik sampai larut. Campuran kemudian didiamkan pada 4 oC selama 1 jam. Campuran kemudian disentrifus selama 15 menit pada 15 000 rpm suhu 4°C. Supernatan dibuang dan pelet dicuci dengan 80% etanol dingin. Tabung kemudian di vacum selama 1 menit dan pelet yang didapat kemudian dilarutkan dalam ddH2O.
Pemurnian DNA
Larutan DNA hasil isolasi dapat dimurnikan lebih lanjut dengan penambahan RNAse. Volume RNAse yang ditambahkan 1/10 dari volume DNA. Percobaan ini menggunakan 17.5 µL DNA ditambah 1.75 µL RNAse dan ditempatkan pada tabung mikro 2 mL. Campuran diinkubasi dalam penangas air 37 °C selama 1 jam dan dicek hasilnya dengan elektroforesis.
Uji Kualitatif dan Kuantitatif DNA Total
Larutan DNA hasil isolasi dianalisis kualitatif dan kuantitatif untuk mengetahui konsentrasi dan kemurniannya. Uji kualitatif dilakukan dengan menggunakan metode elektroforesis, menurut Sambrook et al (1989). Sebanyak 1 µ L DNA hasil isolasi dicampur dengan 1 µ L loading buffer dan campuran ini kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel agarosa 1% dan dianalisis pada tegangan 75 volt selama ± 1 jam 30 menit. Hasil elektroforesis tersebut diamati di bawah UV transiluminator untuk melihat keutuhan DNAnya.
Uji kuantitatif DNA total dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer. Konsentrasi DNA diukur dengan
8
spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm dengan akuades sebagai blanko. Absorbans DNA sebesar 1 pada panjang gelombang 260 nm setara dengan absorbans DNA pada konsentrasi 50 µg/mL. Tingkat kemurnian DNA terhadap senyawa kontaminan polisakarida dan protein dapat diukur menggunakan spektrofotometer. Tingkat kemurnian DNA dapat dilihat dari perbandingan absorbansi pada panjang gelombang 260/280 nm untuk kontaminan protein dan 260/230 nm untuk kontaminan polisakarida. Nilai rasio yang baik berkisar pada 1.8-2.0 (Sambrook et al 1989)
Perancangan Primer
Primer yang dirancang ada 2 macam, yaitu primer spesifik gen dan primer acak. Primer spesifik gen dirancang menggunakan program primer3 yang tersedia pada situs web http://frodo.mit.edu/. Hal pertama yang dibutuhkan dalam perancangan primer ini adalah daerah terkonservasi (conserved
region) dari urutan basa gen TcAP1. Daerah
terkonservasi gen TcAP1 didapatkan dari hasil analisis program BLAST yang tersedia di http://blast.ncbi.nlm.nih.gov.
Daerah terkonservasi digunakan sebagai urutan DNA untuk merancang primer spesifik gen karena daerah ini memiliki homologi yang signifikan dengan gen yang berfungsi sama pada spesies lain. Primer yang dibuat harus memenuhi syarat umum primer yaitu % basa GC 40-60%, tidak terdapat kemungkinan adanya saling komplemen antara basa di dalam satu rantai primer ataupun antara primer yang satu dengan lainnya.
Primer spesifik gen yang dibuat berdasarkan daerah terkonservasi diusahakan berada sedekat mungkin dengan daerah pengapit ujung 5’ dan mensintesis DNA ke arah reverse. Primer acak yang digunakan adalah primer pendek sepanjang 10 nukleotida yang digunakan Terauchi (2000), yaitu AP103 (5’GGTGCTCCGT), AP122 (5’CGATGAGC CC), AP125 (5’ACGGTGCCTG) dan AP140 (5’CGCAGACCTC).
Amplifikasi Daerah Pengapit Ujung 5’ Gen TcAP1
Metode TAIL-PCR digunakan untuk mengamplifikasi daerah pengapit ujung 5’ gen
TcAP1. Metode ini merupakan modifikasi dari
Liu dan Whittier (1995). TAIL-PCR terdiri atas tiga kali proses PCR yaitu primary,
secondary dan tertiary PCR. Primary PCR
dilakukan pada tabung Eppendorf 20 µL berisi 100 ng DNA genomik kakao, 0.2 µM primer
spesifik gen 1 (GSP 1) , 2 µM primer acak 10 mer, 200 µM tiap dNTP, 1U Taq polymerase (Invitrogen) dan 1xbuffer Taq polymerase dengan enzim. Secondary PCR dilakukan pada tabung Eppendorf 20 µL berisi 1 µ L hasil pengenceran 1/50 produk primary PCR sebagai template, 0.2 µM primer spesifik gen 2 (GSP 2) , 2 µM primer acak 10 mer, 200 µM tiap dNTP, 1U Taq polymerase (Invitrogen) dan 1xbuffer Taq polymerase dengan enzim. Tertiary PCR dilakukan pada tabung Eppendorf 20 µL berisi 1 µL produk
secondary PCR sebagai template, 0.2 µM
primer spesifik gen 2 (GSP 2) , 2 µM primer 10 mer, 200 µM tiap dNTP, 1U Taq polymerase (Invitrogen) dan 1xbuffer Taq polymerase dengan enzim. Pengaturan program PCR untuk ketiga tahapan TAIL-PCR dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1 Program TAIL-PCR
Reaksi Siklus Parameter siklus Primary PCR 1 93 °C, 1 min; 95 °C, 1 min
5 94 °C, 30 s; 62 °C, 1 min; 72 °C, 2.5 min 1 94 °C, 30 s; 25 °C, 3 min; naik ke 72 °C selama 3 min; 72 °C, 2.5 min 1 5 94 °C, 10 s; 68 °C, 1 min; 72 °C, 2.5 min; 94 °C, 10 s; 68 °C, 1 min; 72 °C, 2.5 min; 94 °C, 10 s; 29 °C, 1 min; 72 °C, 2.5 min 1 72 °C, 5 min Secondary PCR 12 94 °C, 10 s; 64 °C, 1 min; 72 °C, 2.5 min; 94 °C, 10 s; 64 °C, 1 min; 72 °C, 2.5 min; 94 °C, 10 s; 29 °C, 1 min; 72 °C, 2.5 min 1 72 °C, 5 min Tertiary PCR 30 94 °C, 15 s; 29 °C, 30 s; 72 °C, 2 min 1 72 °C, 5 min
Ekstraksi dan Purifikasi DNA hasil PCR
Hasil tertiary PCR diverifikasi pada gel agarosa 1.2 %. Hasil PCR tersebut kemudian dianalisis seluruhnya pada gel agarosa 1% dan divisualisasi di atas transluminator UV. Proses ekstraksi dan purifikasi DNA hasil PCR dilakukan dengan menggunakan kit Quick Gel
Extraction kit dari Invitrogen.
Bagian gel yang memiliki fragmen gen dipotong menggunakan skalpel dan disimpan pada suhu 4 °C. Selanjutnya potongan gel dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf 2 µL, ditimbang, dan dilarutkan dengan GS1 sebanyak 3x volume gel. Suspensi selanjutnya diinkubasi pada suhu 50 °C selama 15 menit (dikocok setiap 3 menit dan 5 menit setelah gel larut). Larutan selanjutnya dipindahkan ke
9
dalam tabung baru yang telah ditambahkan kolom dan disentrifus pada 12 000 rpm selama 2 menit. Selanjutnya larutan yang ada di dalam tabung dibuang, kolom dimasukkan kembali dan ditambahkan 500 µL GS1, diinkubasi pada suhu ruang selama 1 menit, dan disentrifugasi lagi pada kondisi yang sama.
Larutan yang ada di dalam tabung dibuang, kolom dimasukkan kembali dan ditambahkan 700 µL W9, diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit, dan disentrifugasi lagi pada kondisi yang sama. Setelah itu larutan yang ada di dalam tabung dibuang, kolom dimasukkan kembali, dan disentrifugasi lagi untuk menghilangkan sisa etanol. Selanjutnya kolom dipindahkan ke tabung Eppendorf 1.5 µ L, dielusi tepat di bagian tengah dengan 30 µ L bufer TE hangat (65-70 °C), diinkubasi pada suhu ruang selama 1 menit, disentrifugasi padakondisi yang sama, dan terakhir dianalisis pada gel agarosa 1%.
Pengklonan Fragmen Daerah Pengapit Ujung 5’ Gen TcAP1 dengan pGEM-T Easy
Fragmen daerah pengapit ujung 5’ gen
TcAP1 yang sudah dipurifikasi kemudian
diklon ke dalam vektor kloning pGEM-T
Easy. Tahapan kloning dapat dibagi menjadi
tiga tahap, yaitu ligasi, transformasi, dan seleksi transforman. Fragmen diligasi ke dalam pGEM-T Easy (Promega) dengan cara sebanyak 0.5 µ L vektor pGEM-T Easy, 5 µL bufer ligasi, 3.5 µL sisipan, serta 1 µ L T4 ligase dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf 200 µL dan diinkubasi selama semalam pada suhu 4 °C.
Hasil ligasi sebanyak 10µL selanjutnya ditransformasikan ke dalam 200 µL sel kompeten E. coli XL-1 Blue secara perlahan dan disimpan di dalam es selama 30 menit. Setelah 30 menit di dalam es, kemudian diberi kejut panas (heat shock) 42 °C selama 50 detik dan dimasukkan ke dalam es lagi selama 10 menit. Setelah itu, ditambahkan 800 µL medium LB + glukosa 20 mM tanpa antibiotik. Campuran selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 ºC sambil digoyang selama 90 menit. Setelah 90 menit, sebanyak 100 µL suspensi sel transforman ditransfer pada media seleksi (medium LA + ampisilin + IPTG + X-Gal) di cawan petri dan disebar. Sisanya disentrifugasi 3 000 rpm selama 5 menit, supernatan dibuang dan disisakan sedikit (± 100 µL ) kemudian diresuspensikan dan disebar pada media seleksi (medium LA + ampisilin + IPTG + X-Gal). Medium
kemudian diinkubasi pada 37 °C selama semalam hingga terbentu koloni putih biru.
Seleksi transforman dilakukan dengan pengamatan terhadap koloni yang terbentuk. Koloni yang terbentuk adalah E. coli yang berhasil ditransformasi, sedangkan yang tidak berhasil ditransformasi akan mati akibat penambahan ampisilin. Dua jenis koloni akan terbentuk pada cawan petri. Koloni yang berwarna putih menunjukkan sel yang mengandung plasmid yang berhasil disisipi, sedangkan koloni yang berwarna biru mengandung plasmid yang tidak berhasil disisipi. Koloni yang berwarna putih kemudian diambil dengan tusuk gigi steril untuk PCR koloni dan dipindahkan ke media seleksi (medium LA + ampisilin + IPTG +
X-Gal) dalam cawan petri (duplikat koloni). Konfirmasi Koloni Transforman yang Membawa Fragmen Sisipan Daerah Pengapit Ujung 5’ Gen TcAP1
Konfirmasi koloni transforman dilakukan dengan teknik PCR dengan menggunakan primer SP6 dan T7 serta koloni bakteri sebagai cetakan. Koloni putih diambil dengan tusuk gigi dan digoreskan pada media seleksi sebagai duplikat dan sisanya dimasukkan ke dalam tabung mikro berisi 10 µL ddH2O.
Tabung-tabung mikro berisi koloni bakteri kemudian dimasukkan ke dalam PCR. Program untuk melisis sel bakteri kemudian dijalankan yaitu pemanasan 96 °C selama 5 menit, 50 ° selama 1 menit 30 detik, 96 °C selama 1 menit 30 detik, 45 °C selama 1 menit 30 detik, 96 °C selama 1 menit dan 40 °C selama 1 menit. Proses PCR dihentikan sebentar untuk memasukkan 5 µL campuran pereaksi. Proses PCR kemudian dilanjutkan dengan program amplifikasi sisipan yaitu denaturasi DNA pada 94 °C selama 30 detik, penempelan primer (annealing) pada 55 °C selama 1 menit, pemanjangan utas cDNA (extension) pada 72 °C selama 2 menit sebanyak 30 siklus dan final extension pada 72 °C selama 5 menit. Hasil PCR koloni diverifikasi pada gel agarosa. Koloni terpilih kemudian dikulturkan dalam medium LB cair yang telah ditambahkan ampisilin dan diinkubasi pada shaker-incubator pada suhu 37 °C 150 rpm. Selanjutnya dari kultur bakteri yang tumbuh dilakukan isolasi DNA plasmid menggunakan High Pure Plasmid Isolation
Kit (Roche).
Sebanyak 0.5-4.0 mL kultur bakteri dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf 2 µL dan disentrifugasi pada 8 000 rpm selama 1 menit. Supernatan selanjutnya dibuang dan
10
pelet diresuspensikan dengan 250 µL bufer suspensi yang masih mengandung RNase. Setelah itu, 250 µL bufer lisis ditambahkan, dikocok bolak-balik sebanyak 3-6 kali, dan diinkubasi 5 menit di suhu ruang. Kemudian ditambahkan 350 µL bufer pengikat yang didinginkan, dikocok bolak-balik sebanyak 3-6 kali, diinkubasi di es selama 5 menit, dan dilakukan sentrifugasi pada 13 000 rpm selama 10 menit. High pure filter tube selanjutnya ditempatkan ke dalam tabung dan supernatan dipindahkan ke dalam filter kemudian disentrifugasi pada 13 000 rpm selama 1 menit. Supernatan selanjutnya dibuang dan filter ditempatkan kembali lagi pada tabung yang sama, lalu ditambahkan 500 µL bufer pencuci I, dan disentrifugasi pada 13 000 rpm selama 1 menit. Supernatan kemudian dibuang, pelet ditambahkan 700 µL bufer pencuci II, dan disentrifugasi lagi pada 13 000 rpm selama 1 menit. Setelah itu, supernatan dibuang dan pelet disentrifugasi lagi pada 13 000 rpm selama 1 menit untuk menghilangkan bufer. Setelah itu, filter dipindahkan ke dalam tabung baru 1.5 mL, ditambahkan 30 µL bufer elusi atau ddH2O,
dan disentrifugasi lagi pada 13 000 rpm selama 1 menit. Hasil isolasi selanjutnya diverifikasi dengan gel agarosa 1%.
Pengurutan Sekuen Daerah Pengapit Ujung 5’ Gen TcAP1 Terklon
Pengurutan basa (sekuensing) fragmen gen terklon dilakukan di Charoen Phokphand, Jakarta menggunakan primer universal M13F dan R. Hasil sekuen fragmen gen terklon selanjutnya dianalisis lebih lanjut dengan program bioinformatika BioEdit dan softberry (www.softberry.com).
HASIL DAN PEMBAHASAN
DNA Daun Kakao Hasil IsolasiLarutan DNA yang telah dimurnikan dari RNA kemudian diuji secara kualitatif dan kuantitatif. Hasil uji kualitatif dengan elektroforesis dapat dilihat semua sampel DNA mengalami smear (Gambar 6). Smear adalah kondisi pita DNA yang muncul pada elektroforesis akibat terjadinya degradasi atau kerusakan pita DNA. Hal ini dapat disebabkan kesalahan-kesalahan yang terjadi dalam proses isolasi DNA seperti pengocokan sampel yang terlalu cepat dan pemindahan lapisan atas pada proses ekstraksi yang kurang hati-hati yang mengakibatkan terjadinya gaya gesek yang merusak DNA. Terjadinya
penampakan smear pada pita DNA hasil elektroforesis merupakan suatu hal yang umum terjadi karena degradasi pita DNA dalam proses isolasi DNA tidak dapat dihindari.
Uji kuantitatif DNA dilakukan dengan pengukuran absorbans DNA pada panjang gelombang 260 nm, 280 nm dan 230 nm. Ikatan rangkap terkonjugasi pada basa heterosiklik purin dan pirimidin menjadikan nukleotida, nukleotida dan polinukleotida mampu menyerap sinar UV (Murray 2003). Tingkat kemurnian sampel DNA terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi pada panjang gelombang 260/280 nm dan 260/230 nm untuk kontaminan polisakarida. Nilai rasio yang baik berkisar pada 1.8-2.0 (Sambrook et
al 1989).
Tabel 2 memperlihatkan konsentrasi DNA yang didapat cukup tinggi dan berkisar antara 85- 145 µg/mL. Tingkat kemurnian sampel DNA terhadap kontaminan protein bervariasi dengan nilai rasio di atas 1.9. Sebaliknya, perbandingan absorbans 260/230 nm untuk kontaminan polisakarida memperlihatkan nilai rasio yang berkisar antara 1.3- 1.8. Hal ini menunjukkan kemurniaan DNA terhadap kontaminan protein lebih besar daripada kemurniaan DNA terhadap kontaminan polisakarida.
Gambar 6 Elektroforegram sampel DNA daun kakao. Nomor 1 – 4 : sampel DNA daun kakao
Tabel 2 Analisis kuantitatif DNA daun kakao Sampel 260/280 260/230 [DNA] (µg/mL) 1 4.2 2.625 105 2 2.429 1.307 85 3 3.222 1.706 145 4 1.923 1.785 125
11
Nilai rasio kemurnian DNA terhadap kontaminan protein dan kontaminan polisakarida yang tinggi diperoleh setelah sampel diberi RNAse. Sebelum diberi RNAse, nilai rasio kemurnian DNA terhadap kontaminan protein dan kontaminan polisakarida berada jauh dibawah rasio yang baik menurut Sambrook et al (data tidak ditunjukkan). Hasil isolasi yang dipilih sebagai sumber DNA genomik pada penelitian ini adalah sampel nomor 4, karena memiliki konsentrasi DNA genomik yang besar dan memiliki nilai rasio mendekati 1.8-2.0.
Isolasi DNA dalam penelitian ini merupakan modifikasi dari metode Couch dan Fritz (1990) dan Khanuja et al (1999). Metode ini dipilih karena mampu mengisolasi DNA dari tanaman yang memiliki kadar metabolit sekuender yang tinggi terutama polifenol. Tahapan pertama isolasi DNA ini adalah penggerusan daun kakao yang telah dicelupkan ke dalam N2 cair dan penambahan
buffer ekstraksi dan PVPP
(polyvinylpoly-pyrrolidone). Penggerusan ini bertujuan memecahkan dinding sel secara mekanik. Penambahan PVPP saat penggerusan dan merkaptoetanol dalam buffer ekstraksi bertujuan menghambat enzim polifenol oksidase yang dapat mendegradasi rantai DNA dan menyebabkan teroksidasinya senyawa fenol. Terjadinya oksidasi ditandai dengan terbentuknya warna coklat pada jaringan tanaman yang akan diisolasi. Penambahan nitrogen cair saat penggerusan juga bertujuan mencegah terjadinya oksidasi dan kerusakan DNA.
Buffer ekstraksi yang digunakan pada tahapan penggerusan juga mengandung EDTA (etilen diamin tetra asetat) yang akan menghancurkan sel secara kimiawi dengan cara mengikat ion magnesium (Mg 2+) sehingga enzim menjadi tidak aktif. Buffer ini juga mengandung natrium sitrat dan glukosa yang menjaga keutuhan sel, nukleus dan organel-organel lainnya dari perubahan kondisi pH dan tekanan osmotik. Selanjutnya dilakukan homogenisasi dengan blender selama 2 menit yang bertujuan mencampurkan hasil gerusan daun kakao dan buffer ekstraksi secara merata. Proses ini dilakukan pada suhu rendah dan dihentikan tiap 30 detik untuk mencegah terjadinya kerusakan pada DNA akibat suhu. Homogenat kemudian disaring dengan cheese
cloth untuk memisahkan dinding sel dan
pengotor-pengotor lainnya yang tidak larut dari sel, nukleus dan organel-organel sel lainnya yang masih utuh. Filtrat yang
didapatkan kemudian disentrifus sehingga sel, nukleus dan organel-organel sel mengendap menjadi pelet.
Pelet yang didapat kemudian diresuspensi kembali oleh buffer lisis dengan cara dibolak-balik selama 5 menit. Campuran ini kemudian diinkubasi pada 60oC selama 1 jam sambil sesekali dikocok dengan membolak-balikan tabung. Tahapan ini bertujuan merusak membran sel, membran nukleus dan membran organel sel yang masih utuh sehingga DNA dapat diisolasi. Inkubasi campuran pada suhu 60oC bertujuan mengaktifkan detergen kationik CTAB (N-cetyl-N,N,N-trimetil-amonium bromida) di dalam bufer lisis untuk memecah membran sel. Larutan detergen ini akan menurunkan tegangan permukaan cairan dan melarutkan lipid sehingga membran sel mengalami degradasi. Deterjen yang bermuatan positif ini juga berfungsi memisahkan DNA dari polisakarida yang banyak terkandung pada sel tanaman dengan cara mengikat DNA yang bermuatan negatif. Buffer lisis ini juga mengandung tris-HCl untuk menjaga kondisi pH optimum, EDTA untuk mengikat ion magnesium (Mg 2+), NaCl sebagai larutan isotonik untuk menjaga tekanan osmotik larutan agar DNA tidak rusak, PVPP dan merkaptoetanol untuk menghambat enzim polifenol oksidase yang dapat mendegradasi rantai DNA dan menyebabkan teroksidasinya senyawa fenol.
Tahapan selanjutnya adalah pembersihan DNA dari polisakarida, protein dan pengotor lainnya dengan ekstraksi larutan kloroform: isoamilalkohol (24:1). Kloroform akan menghancurkan dan mengendapkan protein sedangkan polisakarida akan terpisah dari DNA dan tinggal pada fase organik (fase kloroform). Isoamilalkohol berfungsi mengurangi busa yang terbentuk pada proses ekstraksi dan dapat mengganggu pengambilan DNA pada fase air. Sentrifugasi akan memisahkan molekul-molekul berdasarkan bobot molekulnya. Hasil sentrifugasi akan menghasilkan campuran larutan yang terpisah menjadi tiga fase. Larutan kloroform yang memiliki densitas tertinggi akan terletak dibagian bawah (fase organik) tabung sentrifus. Bagian tengah larutan terdapat protein yang dilarutkan oleh larutan kloroform. DNA yang larut pada fase air di bagian atas kemudian dapat dipipet dengan hati-hati agar bagian proteinnya tidak ikut terambil.
Larutan DNA yang didapat kemudian dimasukkan dalam tabung sentrifus baru dan diekstraksi kembali. Ekstraksi DNA dengan
12
larutan kloroform: isoamilalkohol (24:1) dilakukan sebanyak dua kali pada penelitian ini agar DNA yang didapatkan terbebas dari pengotor. Ekstraksi berulang merupakan cara terbaik untuk mendapatkan DNA yang benar-benar murni walaupun proses ekstraksi berulang ini memiliki potensi mengakibatkan kerusakan (patah) DNA akibat gaya gesek yang timbul pada proses pencampuran larutan pada ekstraksi DNA dan pemindahan larutan di bagian atas (fase air) dengan pipet.
Hasil ekstraksi DNA yang didapat ini masih mengandung molekul RNA yang akan dihilangkan setelah tahapan pencucian dengan penambahan RNAse. Hasil ekstraksi kedua sebelum dicuci dengan isopropanol dan etanol, dicampurkan terlebih dahulu dengan larutan NaCl yang bertujuan membantu proses pemekatan dan pengendapan DNA pada tahap pencucian DNA. Adanya garam (khususnya kation Na+) pada suhu rendah membantu pengendapan DNA oleh isopropanol dan etanol. Campuran kemudian ditambahkan isopropanol dan diinkubasi pada 4 oC selama 1 jam yang bertujuan memaksimalkan jumlah asam nukleat yang terendapkan oleh isopropanol. Sentrifugasi kemudian akan memisahkan molekul-molekul berdasarkan bobot molekulnya. Asam nukleat karena memiliki bobot molekul terbesar akan mengendap menjadi pelet sedangkan senyawa-senyawa pengotor akan larut dalam supernatan.
Pelet yang didapat kemudian dicuci dengan 80% etanol dingin. Pencucian dengan etanol bertujuan untuk mengendapkan DNA dari larutan (pemekatan DNA). Pencucian dengan etanol juga memiliki keuntungan lain yaitu dapat sekaligus menyingkirkan asam nukleat pendek maupun monomer asam nukleat karena tidak ikut mengendap dalam pencucian dengan etanol. Pelet yang didapat kemudian dilarutkan dalam karena DNA akan lebih stabil dalam bentuk larutan. Larutan DNA hasil isolasi yang didapat kemudian dimurnikan lebih lanjut dengan penambahan RNAse yang akan mendegradasi RNA sehingga dihasilkan DNA murni yang terbebas dari RNA dan siap digunakan sebagai cetakan DNA saat PCR.
Primer Spesifik Gen dan Primer Acak
Primer memegang peranan penting dalam reaksi PCR. Primer akan menempel pada daerah spesifik yang diinginkan sehingga DNA polymerase dapat mengamplifikasi sekuen yang diinginkan. Perancangan primer untuk TAIL-PCR sedikit berbeda dari
perancangan PCR pada umumnya. Pasangan primer yang dipakai TAIL-PCR memiliki panjang dan Melting Temperature (Tm °C) yang tidak sama. Primer yang dibutuhkan ada 2 macam, yaitu primer spesifik gen dan primer acak.
Primer spesifik gen dirancang menggunakan program primer3 yang tersedia pada situs web http://frodo.mit.edu/. Primer dirancang dengan memasukkan data urutan basa DNA target (Rozen dan Skaletsky 1999). Langkah pertama dalam perancangan primer spesifik gen TAIL-PCR adalah menemukan daerah terkonservasi (conserved region) dari urutan basa gen TcAP1. Daerah terkonservasi gen TcAP1 didapatkan dari hasil analisis program BLAST yang tersedia di http://blast.ncbi.nlm.nih.gov
.
Daerah terkonservasi digunakan sebagai urutan DNA untuk merancang primer spesifik gen karena daerah ini memiliki homologi yang signifikan dengan gen yang berfungsi sama pada spesies lain. Daerah ini juga menunjukkan posisi daerah ekson gen TcAP1 terhadap sekuen genom. Pencarian daerah terkonservasi penting dilakukan karena urutan gen TcAP1 yang didapat berasal dari amplifikasi RNA (daerah yang ditranskripsikan /ekson). Posisi bagian ekson gen TcAP1 terhadap sekuen genom perlu diketahui supaya primer spesifik gen yang dirancang dapat menempel pada daerah ekson gen TcAP1.
Hasil analisis BLAST menunjukkan daerah terkonservasi gen TcAP1 berada pada basa urutan pertama sampai basa ke-175 (Gambar 7). Tingkat homologi yang tinggi ditunjukkan parameter skor yang lebih dari 150 dan nilai E value yang kurang dari 10-4 (Claverie & Notredame 2003). Grafik analisis BLAST memperlihatkan 2 garis berwarna merah dan 1 garis berwarna merah muda (Gambar 7). Garis berwarna merah menun-jukkan nilai skor lebih besar atau sama dengan 200 (≥ 200) dan garis berwarna merah muda menunjukkan nilai skor berada pada kisaran 80-200. Hal ini menunjukkan tingkat homologi yang tinggi. Nilai E value hasil BLAST juga kurang dari 10-4 (Lampiran 3).
Urutan basa daerah terkonservasi ini kemudian digunakan sebagai input program primer3 (http://frodo.mit.edu/). Reaksi TAIL-PCR membutuhkan minimal 2 primer spesifik gen untuk dapat mengamplifikasi sekuen ke arah daerah pengapit ujung 5’. Kedua primer ini dirancang untuk berada di dalam daerah terkonservasi dengan jarak diantara keduanya sebesar 100 bp. Hal ini
13
Gambar 7 Analisis BLAST gen TcAP1 dengan sekuen genom referensi.
dimaksudkan supaya primer kedua dapat memperpanjang hasil amplifikasi primer pertama.
Kriteria umum untuk merancang primer yang baik adalah ukuran primer sebaiknya 18-30 bp, mengandung G+C 50-60%, pasangan primer (forward dan reverse) tidak saling komplemen, urutan basa primer itu sendiri masing-masing tidak saling komplemen (tidak dapat membentuk struktur sekunder) dan Tm untuk kedua primer sebaiknya sama serta berkisar antara 45 °C- 65 °C (Muladno 2002). Berbeda dengan PCR biasa, primer spesifik gen TAIL-PCR memiliki nilai Tm yang lebih tinggi. Menurut Terauchi (2000), primer spesifik gen yang dipakai pada primary dan
secondary PCR harus memiliki Tm di atas
62 °C dan primer spesifik gen untuk tertiary PCR harus memiliki Tm lebih tinggi daripada 57 °C. Bahkan Michiels (2003), berpendapat primer spesifik gen harus ≥ 70 °C untuk menjamin terjadinya penempelan primer pada suhu annealing 62-68 °C.
Berdasarkan informasi diatas, primer spesifik gen dirancang memiliki Tm 67 °C. Perancangan primer dengan program primer3 menghasilkan 2 buah primer reverse yang terletak pada basa ke-166 (GSP 1) dan basa ke-24 (GSP 2). Kedua primer spesifik gen ini telah diperiksa dengan program GeneRunner untuk mengecek keberadaan struktur sekunder (dimer, hairpin loop) yang dapat menggangu reaksi PCR. Kedua buah primer ini dirancang untuk dapat menempel pada daerah gen
TcAP1 dan berarah reverse supaya reaksi
sintesis cDNA mengamplifikasi daerah pengapit ujung 5’ gen APETALA1.
Primer acak atau Arbitrary Primer (AP) yang digunakan dalam penelitian ini adalah primer pendek sepanjang 10 nukleotida yang digunakan oleh Terauchi (2000). Keempat primer pendek ini dipilih karena telah terbukti mampu mengamplifikasi daerah pengapit ujung 5’ gen oleh Terauchi (2000). Primer acak dalam reaksi TAIL-PCR berfungsi menempel secara acak di daerah pengapit
ujung 5’ suatu gen sehingga fragmen daerah pengapit ujung 5’ gen tersebut dapat diamplifikasi. Primer ini berarah forward sehingga daerah yang diapit primer acak dan primer spesifik gen dapat diamplifikasi (daerah pengapit ujung 5’ gen). Keempat primer acak yang dipakai ini telah diuji dengan program GeneRunner untuk mengecek keberadaan struktur sekunder (dimer, hairpin
loop) yang dapat menggangu reaksi PCR dan
telah dipastikan tidak saling komplemen dengan kedua primer spesifik gen yang telah dirancang. Tabel 3 memperlihatkan urutan basa primer yang digunakan dalam proses
TAIL-PCR beserta % GC hasil analisis GeneRunner dan nilai Tm primer hasil
perancangan.
Amplikon Daerah Pengapit Ujung 5’ Gen TcAP1
Teknik TAIL-PCR digunakan untuk mengamplifikasi promoter. Teknik ini dipilih karena proses pengerjaannya sederhana, cepat dan murah dibandingkan teknik lainnya. Teknik ini terdiri atas tiga tahap PCR yaitu
primary, secondary dan tertiary PCR. Primary PCR dilakukan dengan 4 buah
sampel yang mengandung primer spesifik gen yang sama (GSP 1) dan primer acak yang berlainan. Selanjutnya hasil pengenceran produk primary PCR digunakan sebagai cetakan DNA (template) secondary PCR dengan primer acak sama seperti primary PCR dan primer spesifik gen yang berbeda (GSP 2). Produk secondary PCR kemudian digunakan sebagai cetakan tertiary PCR dengan kombinasi primer sama seperti
secondary PCR (Tabel 4).
Produk dari ketiga tahap TAIL-PCR dapat dilihat pada Gambar 8. Produk primary PCR terlihar smear. Hal ini diakibatkan banyaknya produk non spesifik, fragmen dengan berbagai ukuran, yang terbentuk pada tahap ini. Produk
secondary dan tertiary PCR terpisah menjadi
beberapa fragmen dengan ukuran fragmen terbesar sekitar 850 bp. Fragmen ini dipilih
14
Tabel 3 Hasil perancangan primer TAIL-PCR
untuk diklon karena memiliki ukuran fragmen terbesar dan lebih tebal daripada fragmen-fragmen lain yang berasal dari sampel yang sama. Gambar 8 juga memperlihatkan pita fragmen DNA produk
tertiary PCR yang lebih tebal daripada pita
produk secondary PCR dengan ukuran fragmen yang sama. Hal ini memperlihatkan proses amplifikasi produk secondary PCR berhasil dilakukan.
Tabel 4 Kombinasi primer TAIL-PCR Sampel Primary PCR Secondary PCR Tertiary PCR GSP AP GSP AP GSP AP 1 1 103 2 103 2 103 2 122 122 122 3 125 125 125 4 140 140 140 Keterangan : GSP = primer spesifik gen; AP = primer acak
Ekstraksi dan Purifikasi DNA Hasil TAIL-PCR
Produk TAIL-PCR terdiri atas beberapa fragmen hasil amplifikasi primer spesifik gen dan primer acak. Fragmen DNA hasil TAIL-PCR kemudian dipilih yang memiliki ukuran terbesar untuk diklon, yaitu fragmen dengan ukuran sekitar 850 bp. Fragmen ini harus dipisahkan dari produk TAIL-PCR lainnya untuk keperluan klon. Proses pemisahan dilakukan berdasarkan ukuran molekul DNA melalui elektroforesis gel agarosa. Molekul DNA yang bermuatan negatif akan bermigrasi menuju kutub positif apabila ditempatkan pada medan listrik. Kecepatan migrasi molekul DNA tergantung pada konsentrasi gel yang digunakan, ukuran molekul yang dianalisis serta tegangan listrik yang diberikan. Elektoforesis dengan gel agarosa
dapat digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen-fragmen DNA (Sambrook et al.1989).
Produk tertiary PCR kemudian dielektorofresis seluruhnya pada gel agarosa 1%. Bagian gel yang mengandung fragmen 850 bp dipotong dengan menggunakan scapel dan fragmen DNA yang terkandung kemudian diekstrak dari gel menggunakan Quick Gel
Extraction kit dari Invitrogen. Hasil ekstraksi
kemudian dianalisis pada gel agarosa 1% untuk melihat kemurniannya. Gambar 9 memperlihatkan hanya ada satu pita DNA dengan ukuran sekitar 850 bp pada tiap sampel. Hal ini menunjukkan ekstraksi dan pemurnian sampel berhasil dilakukan. Sampel 2 dan 4 kemudian dipilih untuk diklon berdasarkan penampakan pita yang lebih tinggi daripada pita lainnya. Pita sampel yang lebih tinggi daripada pita lainnya dalam satu sumur gel menunjukkan pita tersebut memiliki ukuran basa lebih besar daripada pita lainnya.
1 2 3 4 M 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Gambar 8 Elektroforegram TAIL-PCR. M = marker, atas : nomor 1- 4 = sampel 1-4, bawah : 1 =
primary PCR, 2 = secondary
PCR, 3 = tertiary PCR.
Nama Primer Sekuen % GC Tm
(°C) Primer spesifik gen
GSP1 5’CAAAGAGCTTCCCTTTGTGAGAGA 46 67 GSP2 5’CAACTGAACCCTACCTCTTCCCA 52 67 Primer acak AP103 5’GGTGCTCCGT 70 27 AP122 5’CGATGAGCCC 70 27 AP125 5’ACGGTGCCTG 70 27 AP140 5’CGCAGACCTC 70 27 Smear 850 bp
