SISTEM SITOSKELETON SISTEM SITOSKELETON

(1)

Achmad Farajallah | SISTEM SITOSKELETON

Copyright Achmad Farajallah achamad@ipb.ac.id

http://achamad.staff.ipb.ac.id/2011/11/23/sistem-sitoskeleton/

SISTEM SITOSKELETON

Achmad Farajallah, Departemen Biologi FMIPA IPB

Berbagai aktifitas selular biasanya dihubungkan dengan aktifitas berbagai

organel bermembran, baik dalam sistem endomembran maupun endosimbion, dan aktiftas ribosomal (ekspresi genetik). Semua aktifitas diatas terjadi di dalam sitosol yang mengikuti kompartementasi sistem organel. Jadi pada saat itu, pemahaman bahwa sitosol adalah cairan agak kental adalah untuk mendukung aktifitas-aktifitas sel yang diatur oleh organel sel. Kandungan protein cairan sitosol yang mencapai 20-30% dianggap sebagai bagian dari aktifitas enzimatik yang diatur oleh organel dan sebagai protein terlarut yang bebas.

Pendapat diatas menjadi wajar karena kemampuan resolusi mikroskop pada saat itu belum mampu menguraikan lebih ditil ultrastruktur cairan sitosol. Kemajuan teknik mikroskopi dan berbagai teknik laboratorium lainnya kemudian berhasil

mengungkapkan bahwa cairan sitosol yang agak kental mempunyai ultrastruktur filamen dan tubulus membentuk jejaring sangat rumit, menjulur-julur mulai dari sekitar nukleus sampai ke membran plasma yang kemudian dikenal sebagai sitoskeleton. Jadi sitoskeleton adalah matriks protein yang memberikan kerangka arsitektural bagi sel. Kesimpulan itu kemudian cocok dengan kenyataan bahwa organisasi organel di dalam sel adalah teratur. Sitoskeleton kemudian dikategorikan sebagai organel yang tidak bermembran. Selain itu, istilah sitoskeleton tidak

merujuk ke kondisi yang dinamis, yang selalu berubah dan terlibat dalam berbagai aktifitas selular yang sangat vital.

Akumulasi pengetahuan yang terjadi sgat pesat tentang ultrastruktur sel kemudian merubah pandangan tentang sitoskeleton. Ternyata sitoskeleton berperan penting dalam pergerakan sel, pembelahan sel, pengaturan arsitektural organel berikut mobilitasnya dalam sitosol, dan proses pembentukan mRNA dan komponen selular lainnya. Selain itu, kemudian diketahui juga bahwa berbagai enzim tidak semuanya terlarut dalam cairan sitosol, melainkan menggerombol dan terikat ke sitoskeleton dan beberapa jenis enzim dalam lintasan biokimia yang sama ditemukan berada

(2)

dalam lokasi yang berdekatan akibat terikat ke sitoskeleton yang sama. Studi yang mendalam tentang hubungan antara sitoskeleton dengan pergerakan sel kemudian mengungkapkan lebih jauh bahwa fungsi sitoskeleton bukan hanya yang berkaitan dengan pergerakan sel saja. Sitoskeleton ternyata terlibat dalam berbagai aktifitas intraselular dan membangun interaksi berbagai jenis sel dalam tubuh, mulai dari pengaturan sinyal, pengenalan dan pengikatan antar mereka.

KOMPONEN-KOMPONEN UTAMA SITOSKELETON

Berdasarkan komponen-komponen penyusun strukturnya, sitoskeleton bisa dibagi menjadi tiga komponen, yaitu filamen mikro, tubulus mikro dan filamen

intermediet. Ketiganya sangat unik untuk sel eukariot yang berhasil diungkapkan akibat penggunaan mikroskop elektron. Teknik-teknik biokimia dan imunologi kemudian memperdalam pengetahuan kita tentang ketiga struktur penyusun sitoskeleton diatas. Akhirnya, teknik immunofluorescence microscopy dan biologi molekular (termasuk rekayasa genetik) masing-masing berperan dalam

mengkarakterisasi lebih lanjut setiap protein penyusun sitoskeleton, mulai dari ukuran, struktur, distribusi intraselularnya sampai ke mode polimerasinya.

Filamen mikro berdiamater 7 nm merupakan polimer dari protein aktin sehingga seringkali disebut dengan filamen aktin. Tubulus mikro mempunyai diameter luar

(3)

25 nm yang disusun oleh protein tubulin. Sedangkan filamen intermediet

mempunyai diamater diantara filamen mikro dan tubulus mikro, yaitu 8-12 nm, dengan monomer-monomer yang beragam tergantung jenis selnya walaupun dari segi ukuran dan strukturnya sama. Selain komponen struktural yang utama diatas, setiap jenis sitoskeleton juga berasosiasi dengan berbagai jenis protein lainnya yang dikategorikan sebagai protein-protein asesoris.

Fungsi filamen mikro dan tubulus mikro yang paling banyak dikenal adalah mengatur pergerakan sel. Filamen mikro adalah komponen yang membentuk

serabut-serabut otot, sedangkan tubulus mikro adalah komponen utama alat gerak sel dalam lingkungan cairan atau mengalirkan cairan yang mengenainya, yaitu silia dan flagela. Struktur serabut otot, silia maupun flagela dikenal lebih awal karena ukurannya yang relatif besar menjadikan bisa diamati menggunakan mikroskop cahaya biasa. Pengungkapan strukturnya lebih lanjut ternyata diketahui bahwa mereka mempunyai komponen-kompon penyusun yang sama dan menyatu dengan sitoskeleton. Walaupun kemudian setiap jenis sitoskeleton sepertinya saling

terpisah (untuk keperluan pembahasan yang rinci), pada kenyataanya ketiganya tidak bisa saling dipisahkan dalam menunjang arsitektur sel dan aktifitas sel.

Filamen mikro Tubulus mikro Filamen intermediet Strukt ur Dua rantai F-aktin yang saling menganyam Tabung dengan dinding dari 13 protofilamen 8 protofilamen digabung ujung ketemu ujung dan pada beberapa tempat saling tumpang-tindih Diame

ter

7 nm Sisi luar: 25 nm, sisi dalam 15 nm

8 -12 nm

(4)

Mono mer

(5)

G-aktin

(6)

a- dan b-tubulin

(7)

Beberapa jenis protein

(8)

(9)

Fungsi

(10)

http://achamad.staff.ipb.ac.id/2011/11/23/sistem-sitoskeleton/ page 10 / 174 Kontraksi tot; pergerakan ameboid; lokomosi sel, distribusi sitoplasmik; pembelahan sel, menjaga bentuk sel

(11)

Motilitas sel (aksonemal); organisasi dan

menjaga bentuk sel; pergerakan

kromosom,

penambatan dan mobilitas organel sel

(12)

Penyokong

struktural; memberi bentuk sel,

membentuk inti sel, memperkokoh serabut syaraf dan menjaga kekuatan elastis otot

page 12 / 174

(13)

CATATAN TEKNIK MEMPELAJARI SITOSKELETON

Sebagai komponen cairan sitosol dengan indeks refraksi yang rendah, sitoskeleton tidak bisa diamati menggunakan mikroskop cahaya biasa, kecuali yang berbentuk meraksasa seperti serabut otot dan benang-benang gelendong selama mitosis, atau berbentuk yang mudah terlihat seperti silia dan flagela. Dengan begitu,

pengetahuan ultrastruktur sitoskeleton bisa dipelajari akibat kemajuan yang pesat dari teknik-teknik mikroskopik, antara lain immunofluorescence microscopy, digital video microcopy dan electron microscopy.

§ immunofluorescence microscopy. Antibodi primer akan mengenali dan mengikat protein sitoskeleton. Antibodi sekunder yang diberi label dengan fluoresen

kemudian mengikat antibodi primer yang sudah terikat. Sitoskeleton yang

membentuk kompleks dengan antibodi berlabel akan terlihat berpendar di bawah pengamatan mikroskop.

§ fluorescence techniques. Teknik ini biasa digunakan untuk melacak rangkaian reaksi secara in vivo atau sel dalam keadaan hidup. Protein sitoskeleton sintetik dilabel dengan fluoresen kemudian disuntikkan ke sel yang hidup. Aktifitas

sitoskeleton berlabel fluoresen kemudian bisa diikuti dengan bantuan mikroskop fuoresen yang dilengkapi dengan kamera video digital.

§ computer-enhanced digital video microscopy. Teknik ini digunakan untuk

memproses gambar video digital (high resolution image) agar semakin kontras dan gambar-gambar di latar belakang yang tidak dikehendaki bisa disamarkan.

§ electron microscopy. Salah satu mikroskop yang menggunakan elektron sebagai pengganti cahaya tampak dan menggunakan medan magnet sebagai pengganti sistem lensa.

(14)

Teknik-teknik mikroskopik diatas berhasil mengungkapkan dari sisi struktur

sitoskeleton yang jika dideduksi ke fungsinya seringkali kurang tepat. Pendekatan teknik-teknik biokimia modern memanfaatkan pengrusakan secara selektif (dan terkontrol) fungsi-fungsi suatu protein yang terlibat dalam suatu struktur maupun aktifitas selular. Dengan begitu, fungsi normal protein penyusun struktur

sitoskeleton bisa dipelajari. Setelah molekul yang bisa menginaktifkan protein aktin dan tubulin ditemukan maka berbagai aktifitas selular yang tergantung ke filamen mikro dan tubulus mikro berhasil diungkapkan satu persatu. Beberapa molekul racun yang biasa digunakan untuk mempelajari sitoskeleton antara lain

· kolkisin (alkaloid dari tanaman crocus, Colchicum autumnale) mengikat protein tubulin bebas menjadi kompleks tubulin-kolkisin yang sangat kuat.

Akibatnya tubulin terikat ini tidak bisa digunakan untuk menyusun tubulus mikro.

· Nocodazol adalah substitusi kolkisin untuk mempelajari funvgsi tubulin dalam sel hidup. Kompleks tubulin-nocodazol tidak sekuat kompleks tubulin-kolkisin. Jika nocodazol dihilangkan maka tubulin menjadi bebas kembali.

· Vinblastine dan Vincristine (diekstrak dari tanaman Vinca minor) bisa menyebabkan tubulin bebas di dalam sitosol membentuk agregat.

· taxol (diekstrak dari Taxus brevifolis) bekerja berkebalikan dengan kolkisin maupun nocodazol, yaitu membuat tubulus mikro menjadi sangat stabil sehingga tidak bisa terurai menjadi subunit-subunit penyusunnya.

Þ keempat obat-obatan diatas bisa dikelompokkan sebagai obat antimitosis – karena menganggu proses mitosis. Dalam kondisi tertentu, jika pembelahan mitosis tidak bisa berlangsung maka pembelahan yang cepat dari sel-sel kanker juga bisa dihambat. Dengan begitu, keempatnya bisa juga disebut sebagai antikanker

(terutama vinblastine dan vincristine). Taxol seringkali diresepkan untuk mengatasi pertumbuhan yang sangat cepat sel-sel kanker payudara.

· Cytochalasin D (suatu metabolit jamur) dan Latrunculin A (diekstrak dari spons Laut Merah, Latrunculia magnifica) menghambat polimerasi (penambahan

(15)

subunit-subunit baru di ujung positif) filamen mikro

· Phalloidin (peptida siklik dari jamur merah mematikan, Amanita phalloides) menghambat depolimerasi filamen mikro atau menghambat penguraian filamen mikro menjadi subunit-subunitnya

· Thymosin B4 mengikat monomer G-aktin yang larut dalam sitosol sehingga tidak bisa bergabung dengan protofilamen

· ADF/cofilin mempercepat penguraian subunit-subunit filamen mikro

Selain teknik mikroskopik dan penggunaan racun diatas, rekayasa genetik

(kombinasi teknik biologi molekular dan genetik) telah berhasil mengintroduksikan mutasi yang spesifik pada gen penyandi protein dari penyusun sitoskeleton. Mutasi buatan kemudian bisa digunakan untuk memetakan dan sekaligus melacak

rangkaian aktifitas selular sebagai fungsi dari suatu sitoskeleton tertentu.

Agar bisa mengamati sel dalam keadaan hidup, maka teknik-teknik kultur sel yang telah berkembang lebih awal masih tetap relevan dan merupakan teknik penyokong yang utama.

(16)

TUBULUS MIKRO

Dalam sel-sel eukariotik, tubulus mikro (TM) bisa dibedakan menjadi dua tipe, yaitu aksonemal dan sitoplasmik. TM aksonemal merupakan penyusun flagela dan silia, suatu substruktur sel spesifik yang berfungsi dalam motilitas sel; dan badan basal. TM aksonemal ini bersifat sangat stabil dan terorganisasi dengan baik. Dalam batang tengah silia dan flagela, TM berasosiasi dengan protein-protein asesoris membentuk bundel TM. Dalam bentuk bundel yang meraksasa, TM bisa diamati menggunakan mikroskop cahaya. Akumulasi pengetahuan TM sampai saat ini banyak yang berasal dari pengamatan terhadap TM silia dan flagela.

Tipe TM yang kedua adalah yang tersebar dan membentuk jejaring yang dinamis di dalam sitoplasma. Tm ini diketahui setelah teknik fiksasi (mematikan dan

mendiamkan sel yang akan diamati) yang lebih baik. Teknik-teknik fiksasi sebelumnya hanya bisa melihat butiran (granul) dalam larutan sitosol yang seringkali diartikan sebagai artefak teknik pengamatan. Kombinasi dengan

visualisasi yang juga semakin baik, ternyata granul-granul dalam sitosol sel eukariot membentuk jejaring halus yang sangat kompleks. TM sitoplasmik ini kemudian

diketahui mempunyai beragam fungsi, mulai dari meregangkan serabut akson sel syaraf, polaritas sel yang bermigrasi sampai ke pembangkitan listrik sel. Pada sel-sel tumbuhan, TM sitoplasmik berperan dalam membentuk orientasi serabut selulosa selama pertumbuhan dinding sel. Selain itu, TM sitoplasmik diketahui juga berfungsi dalam menarik kromosom ke arah kutub-kutub yang berlawanan selama mitosis dan meiosis. Penggunakan kamera video digital kemudian berhasil

mengungkapkan lebih jauh bahwa TM sitoplasmik mengatur juga posisi dan mobilitas organel dan vesikula di dalam sel eukariot.

TM Disusun oleh Heterodimer Protein Tubulin

Sebagaimana disajikan dalam Tabel diatas, diameter berbagai jenis TM yang ada di dalam sel adalah sama, dan yang berbeda adalah panjangnya. Panjang TM bisa mencapai beberapa mikrometer (misalnya pada flagela) atau kurang dari 200 nm. Dinding TM disusun secara longitudinal oleh polimer-polimer linear protofilamen.

(17)

Sekitar 13 protofilamen disusun samping-menyamping yang akhirnya membentuk tabung.

Protofilamen disusun oleh subunit dasar dari heterodimer protein tubulin. Dari lima jenis protein tubulin yang sudah dikenal mempunyai struktur mirip, yang menjadi komponen penyusun TM adalah a-tubulin dan b-tubulin. Segera setelah disintesis, keduanya langsung bergabung membentuk ab-heterodimer (atau disingkat dimer tubulin). Struktur heterodimer ini tidak bisa terurai pada kondisi normal. Secara individual, molekul a-tubulin dan b-tubulin mempunyai diameter 4-5 nm dengan berat molekul sekitar 50.000 dalton. Setiap molekul protein tersebut berlipat menjadi tiga domain, yaitu domain ujung N (pengikat GTP), domain tengah

(mempunyai situs pengikatan dengan kolkisin) dan domain ujung C (mempunyai situs pengikatan dengan berbagai protein asesoris). Perbedaan-perbedaan antar penyusun TM biasanya terdapat pada domain ujung C akibat mengikat

protein-protein asesoris yang berbeda. Subunit-subunit tubulin yang berbeda diatas disebut isotipe tubulin. Setidaknya di dalam sel-sel otak bisa ditemukan lima isotipe untuk a-tubulin dan lima isotipe untuk b-tubulin.

Dalam setiap protofilamen, ab-heterodimer atau penyusunan a-tubulin dan b-tubulin mempunyai orientasi yang tetap. Dengan kata lain molekul

protofilamen mempunyai ujung-ujung yang berbeda dengan karakteristik kimia yang berbeda. Setelah protofilamen membentuk berbagai jenis TM di dalam sel maka orientasi penyusunan a-tubulin dan b-tubulin-nya masih tetap sehingga TM merupakan molekul dengan struktur yang mempunyai orientasi polaritas.

Proses Pembentukan TM

Polimerasi dimer tubulin dalam membentuk TM bersifat reversibel (dapat bolak-balik). Secara in vitro, jika konsentrasi dimer tubulin, GTP dan ion Mg mencukupi maka pada suhu antara 0-37o_{C akan terjadi sintesis TM. Titik kritis}

sintesis TM adalah pembentukan agregat dimer tubulin menjadi oligomer yang disebut dengan nukleasi atau pembentukan inti. Dari struktur inti oligomer ini polimerasi untuk membentuk TM selanjutnya terjadi dengan cara menambahkan dimer tubulin yang disebut elongasi atau pemanjangan.

(18)

Agregasi dimer tubulin bebas menjadi oligomer sebagai inti pada awal

pembentukan TM terjadi sangat lambat yang dikenal dengan fase lag. Proses pemanjangan terjadi sangat cepat. Jika kondisi jumlah dimer tubulin dalam sitosol menjadi terbatas maka pertumbuhan MT melambat dan akhirnya mencapai titik keseimbangan yang dikenal dengan fase plateu. Pada fase plateu ini, laju

penambahan dimer tubulin di salah satu ujung adalah sama dengan laju penguraian dimer tubulin di ujung yang lain.

Secara in vitro arah pertumbuhan TM mengikuti konsentrasi dimer tubulin. Pada konsentrasi dimer tubulin tinggi maka TM akan tumbuh, sebaliknya pada

konsentrasi dimer tubulin rendah maka TM akan terurai. Kondisi tumbuh dan terurai ternyata setimbang. Secara keseluruhan, konsentrasi dimer tubulin bebas yang ada dalam sitosol adalah faktor pembatas utama pertumbuhan TM.

Polaritas struktur yang inheren pada TM berarti bahwa karakteristik kimia kedua ujungnya saling berbeda. Kedua ujung MT mempunyai laju pertumbuhan yang

berbeda akibat perbedaan laju penambahan atau pengurangan dimer tubulin. Ujung TM yang tumbuh lebih cepat disebut sebagai ujung positif dan yang lebih lambat tumbuh disebut ujung minus. Dalam kondisi normal, laju penambahan dimer tubulin di ujung positif adalah sama dengan laju penguraian dimer tubulin di ujung minus. Kondisi ini disebut treadmilling condition. Dengan kata lain, TM berada dalam kondisi yang stabil dan dinamis. Sifat stabil dan dinamis tersebut diatur oleh ketersediaan dimer-dimer tubulin bebas di sitosol. Pada saat konsentrasi dimer tubulin yang ada disekitar ujung positif tinggi maka TM akan tumbuh cepat ke arah positif.

Sebelumnya telah disebutkan bahwa penambahan dimer tubulin ke ujung TM secara in vitro membutuhkan ion Mg dan GTP. Dimer tubulin harus diaktifkan terlebih dahulu dengan mengikat dua molekul GTP. Setiap satu molekul tubulin mengikat satu molekul GTP untuk membentuk kompleks GTP-tubulin. Ketika dimer tubulin ditambahkan ke ujung TM maka GTP-tubulin dihidrolisis menjadi

GDP-tubulin. Pengikatan GTP oleh dimer tubulin membutuhkan ion Mg sebagai kofaktor. Di lain eksperimen, ternyata beberapa dimer tubulin bebas bisa langsung berikatan dengan ujung TM tanpa terlebih dahulu membentuk kompleks

GTP-tubulin. Dengan begitu, ada dua mode penambahan dimer tubulin, yang satu lebih mahal karena membutuhkan GTP sedangkan yang lain lebih murah karena tanpa membutuhkan GTP.

(19)

Dalam eksperimen yang lain, ternyata ditemukan bahwa GTP membentuk

kompleks molekul bukan dengan dimer tubulin bebas melainkan dengan tubulin yang ada di ujung positif TM. Untuk menerangkan hasil eksperimen diatas, ternyata ditemukan kenyataan yang lain bahwa kompleks GTP-tubulin bebas yang

bergabung dengan tubulin di ujung positif tidak segera dihidrolisis menjadi GDP-tubulin melainkan kemudian membentuk ujung positif bertudung GTP. Keterangan ini bisa menjelaskan pengaturan cepat tidaknya pertumbuhan TM. Ujung positif bertudung GTP akan jauh lebih cepat menangkap dimer tubulin bebas yang mengikat GTP dibanding dengan dimer tubulin yang tidak mengikat GTP.

Konsentrasi GTP-tubulin bebas sangat menentukan model stabilitas dinamis TM. Jika konsentrasi GTP-tubulin bebas tinggi maka pembentukan ujung positif bertudung GTP terjadi dengan cepat yang kemudian mempercepat pertumbuhan selanjutnya. Pertumbuhan TM menyebabkan tudung GTP bergeser ke arah ujung minus. Jika konsentrasi GTP tubulin bebas rendah maka penguraian ujung minus terjadi dengan cepat. Sampai kemudian TM tidak lagi mengandung tudung GTP atau tudung GTP terlepas. TM tanpa tudung GTP menjadi tidak stabil dan terurai menjadi oligomer atau malah menjadi subunit-subunit penyusunnya. Kondisi ini disebut dengan microtubule catastrophe, yaitu molekul TM tidak ada lagi dan untuk membentuknya kembali membutuhkan tahapan dari awal lagi, yaitu agregasi dimer tubulin membentuk oligomer (nukleasi) dan pemanjangan.

Titik Pertumbuhan TM dari Pusat Pengorganisasi TM (MTOC)

Proses pertumbuhan TM secara in vivo terjadi lebih teratur dengan lokasi di dalam sel yang lebih spesifik untuk setiap fungsi sel yang juga spesifik. Pada umumnya, TM tumbuh dari struktur sel yang disebut pusat pengorganisasi TM atau

microtubule-organizing center (MTOC). MTOC ini merupakan tempat inisiasi pembentukan oligomer atau titik awal pertumbuhan TM. MTOC pada saat sel sedang dalam fase pembelahan mitosis disebut sentrosom yang berada di dekat nukleus. Pada sel-sel hewan normal, sentrosom terdiri atas dua sentriol yang dikelilingi oleh material berbentuk granula yang disebut parasentriol. Dari gambaran mikroskop elektron, titik pertumbuhan TM berasal dari material parasentriol ini.

Struktur sentriol dalam sentrosom sangat simetris, yaitu dinding masing-masing sentriol tersusun atas sembilan pasang dari TM bersusun triplet. Pada sebagian

(20)

besar sel, satu sentriol membentuk sudut dengan sentriol pasangannya. Walaupun keuntungan struktur menyudut ini belum diketahui, sentriol berperan penting

dalam membentuk badan basal sebagai titik melekat (titik asal) TM yang menyusun aksonema flagela dan silia. Peran sentriol pada sel-sel yang tidak mempunyai silia maupun flagela belum diketahui. Pada sel-sel hewan, peran sentriol yang terlihat adalah mengumpulkan material parasentriol membentuk sentrosom sebagai titik nukleasi TM. Jika sentriol dihilangkan secara in vitro maka material

microtubule-nucleating (»parasentriol) dan MTOC tidak terbentuk. Meskipun begitu, sel yang tidak mempunyai sentriol masih bisa melakukan pembelahan sel karena kromosom bisa mengorganisasikan TM-nya sendiri. Jika dilihat pada sel-sel tanaman yang tidak mempunyai sentriol bisa diartikan bahwa sentriol tidak terlalu berperan penting dalam pembentukan MTOC.

Material parasentriol didominasi oleh protein g-tubulin yang berbentuk cincin. Beberapa molekul yang lain adalah protein pericentrin. Kompleks protein cincin dari g-tubulin diketahui berperan dalam membentuk nukleasi MT yang kemudian tumbuh ke arah luar dari sentrosom. Selain sentrosom, badan basal juga diketahui bisa bertindak sebagai MTOC.

Pemanjangan TM ke seluruh bagian sel berpusat di beberapa MTOC yang ada di dalam sel. Artinya ujung minus TM ada di kompleks MTOC sedangkan ujung positifnya ada di posisi distal MTOC. Dengan begitu, MTOC juga bisa berperan dalam mengatur jumlah TM yang ada di setiap sel sebagai manifestasi kemampuan MTOC membentuk inti TM. Kemampuan MTOC ini bisa meningkat dengan pesat akibat meningkatnya jumlah molekul pericentrin ketika sel masuk ke fase profase dan metafase.

Pengaturan Stabilitas TM dalam Sel

Kemampuan MTOC dalam membentuk inti TM sebagaimana yang terjadi dalam sentrosom mempunyai konsekuensi dinamika TM dalam sel. Ujung minus TM ada di sentrosom maka ujung positifnya akan menjulur ke arah periferal sel. Dalam kondisi tertentu, TM bisa melepaskan diri dari sentrosom dengan cara menguraikan ujung minusnya. Biasanya TM yang telah lepas dari sentrosom akan lenyap dalam sitosol karena terurai menjadi subunit-subunit penyusunnya. Di lain pihak, beberapa TM terus bertahan lama di sitosol dan tidak mengalami pertumbuhan akibat ujung positifnya diproteksi dari penambahan dimer tubulin. Misalnya, TM yang tumbuh

(21)

dari sentrosom menuju ke kinetokor sejak profase sampai ke pembelahan sel akan terus bertahan. Jika dalam selang waktu itu terjadi penguraian maka TM baru akan tumbuh lagi dari sentrosom. Jadi ujung positif TM yang berikatan dengan kinetokor tidak bisa mengalami penambahan dimer tubulin sehingga pertumbuhan tidak terjadi.

Protein Asesoris TM (MAPs)

Beragam protein diketahui mempengaruhi struktur, pembentukan dan fungsi TM yang dikenal sebagai protein asesoris TM atau microtubule-associated proteins (MAPs). Dari isolasi sel, kandungan MAPs bisa mencapai 10-15% dari massa TM. Beberapa jenis MAPs berikatan di sepanjang dinding TM pada jarak yang teratur maupun tidak teratur. Tonjolan MAPs ini menyebabkan TM bisa berikatan dengan TM lain, filamen dan struktur-struktur sel lainnya. MAPs yang ditemukan berikatan pada ujung positip TM diketahui berfungsi menyetabilkan subunit-subunit dalam pemanjangan TM, sedangkan yang berikatan pada ujung negatif diketahui

membantu penguraian subunit-subunit menjadi monomer bebas.

Beberapa MAPs yang sangat intensif dipelajari adalah yang ada di sel-sel otak.

MAPs tersebut bisa dibagi menjadi motor dan nonmotor. MAPs motor menggunakan ATP sebagai sumber energinya untuk mendorong organel sel dan vesikula, dan mengatur pergeseran dua TM yang saling berdekatan. Sedangan MAPs nonmotor berfungsi mengontrol organisasi TM dalam sitosol. Di dalam sel syaraf, MAPS nonmotor ini berperan dalam pembentukan penjuluran-penjuluran akson dan dendrit. Aktifitas pengaliran rangsang (listrik) dalam akson jauh lebih banyak dibanding dalam dendrit diduga karena TM di akson membentuk bundel-bundel yang jauh lebih banyak, selain karena jenis MAPs-nya antara akson dan dendrit juga berbeda. Jadi, perbedaan-perbedaan jenis MAPs antar sel menyebabkan organisasi TM juga berbeda, walaupun struktur TM-nya sendiri sangat stabil.

(22)

FILAMEN MIKRO

Filamen mikro (FM) atau lebih dikenal dengan filamen aktin merupakan komponen sitoskeleton dengan ukuran paling kecil, yaitu sekitar 7 nm. Akumulasi pengetahuan tentang filamen mikro ini berasal dari penelahaan yang intensif terhadap

serabut-serabut kontraktil sel-sel otot. Kontraksi otot dihasilkan oleh interaksi antara filamen aktin atau filamen tipis dengan miosin atau filamen tebal. FM ini bukan hanya bisa ditemukan dalam sel-sel otot melainkan dalam hampir semua sel eukariot dengan fungsi yang sangat beragam, baik yang berhubungan dengan

fungsi-fungsi pergerakan sel maupun struktur sel. Beberapa fungsi pergerakan yang dibantu oleh FM adalah gerak ameboid, migrasi sel diatas permukaan dan

pergerakan teratur cairan sitosol (cytoplasmic streaming) pada sel-sel tumbuhan maupun hewan. Selain itu, FM membantu mekanisme pelekukan membran sel pada awal-awal sitokinesis. Keterlibatan FM dalam fungsi-fungsi struktural terlihat pada peranan FM dalam jejaring yang memperkuat pengikatan antar sel melalui matriks ekstraselular.

Sebagai pemberi bentuk sel, sitosol beberapa jenis sel dipenuhi oleh jejaring FM yang disebut dengan sel korteks, biasanya jejaring FM tadi mengumpul membentuk lapisan di bawah membran sel. Dalam hal ini, jejaring FM bisa disebutkan sebagai yang memberi bentuk sel sekaligus bisa juga disebutkan sebagai yang memberi kekuatan mekanis sel. Pada sel-sel epitel saluran pencernaan, jejaring FM

mengorganisasikan diri membentuk bundel yang kemudian mengisi pelekukan membran sel yang disebut mikrovili.

Protein Aktin adalah Subunit Penyusun FM

Dalam sitosol sel-sel eukariot, protein aktin berada dalam jumlah yang sangat banyak. Protein aktin disintesis sebagai polipeptida tunggal yang terdiri dari 375 asam amino dengan berat molekul sekitar 42 kDa. Polipeptida aktin yang baru disintesis akan mengalami pelipatan-pelipatan membentuk banyak huruf U saling menyambung yang kemudian bagian tengahnya mempunyai afinitas yang tinggi terhadap ATP ataupun ADP.Satu molekul aktin yang aktif disebut G-aktin. Pada

(23)

kondisi yang tepat, molekul-molekul G-aktin bebas mengalami polimerasi

membentuk FM yang kemudian disebut F-aktin. Molekul aktin, baik dalam bentuk monomer (G) maupun polimernya (F) bisa berikatan dengan beragam protein

lainnya. Molekul aktin yang berikatan dengan suatu protein kemudian memberikan fungsi yang berlain-lainan tergantung protein yang diikatnya.

Pada dasarnya, struktur protein aktin bersifat sangat stabil atau identik di berbagai jenis sel, malah yang paling stabil dibanding TM dan FI (filamen intermediet).

Protein aktin fungsional bisa jadi sangat beragam di dalam satu sel, antar jenis sel maupun antar sel dari spesies yang berbeda. Berdasarkan kesamaan runutan asam aminonya, setidaknya protein aktin bisa dibedakan menjadi dua kelompok utama, yaitu aktin spesifik untuk otot (a-aktin) dan aktin selain di sel-sel otot (b- aktin dan g-aktin). Selain itu, b- aktin dan g-aktin yang ditemukan di dalam satu sel atau di berbagai jenis sel bisa jadi saling berbeda. Misalnya, pada sel epitel dengan orientasi basal-apikal, biasanya b- aktin paling banyak ditemukan di bagian apikal sedangkan g-aktin paling banyak ditemukan di bagian basal dan lateral.

Selain jenis aktin yang beragam, kelompok protein yang mempunyai runutan asam amino serupa dengan protein aktin kemudian disebut sebagai actin-related proteins (Arps). Misalnya, protein aktin di sel-sel ayam dan di sel ragi mempunyai kesamaan runutan asam amino lebih dari 90%, sedangkan Arps memperlihatkan kesamaan runutan asam amino hanya sekitar 50%. Arps2 dan Arps3 ternyata ditemukan terlibat dalam pengaturan pembentukan inti polimerasi FM pada sel-sel yang sedang bermigrasi.

Proses Pembentukan FM

Sebagaimana dimer tubulin, monomer G-aktin akan mengalami polimerasi menjadi FM dan sebaliknya FM akan mengalami depolimerase menjadi G-aktin kembali. Awal polimerase G-aktin bebas terjadi sangat pelan sampai terbentuk inti filamen (fase lag) kemudian dilanjutkan dengan pemanjangan filamen yang terjadi sangat cepat. Akhirnya, dua filamen yang sudah memanjang saling berpilin membentuk struktur molekul heliks. Satu pilinan terdiri atas 13.5 monomer F-aktin dengan panjang sekitar 36-37 nm. Molekul-molekul aktin dalam FM mempunyai orientasi yang sama yang menyebabkan FM secara inheren mempunyai polaritas struktur, yaitu

ujung-ujungnya saling berbeda. Sifat polaritas FM bisa dibuktikan dengan

menginkubasi FM dengan myosin subfragmen (S1). Fragmen S1 akan berikatan

(24)

dengan F-aktin layaknya menghias FM dengan rumbai-rumbai yang mengarah ke satu arah. Berdasarkan pola arah dari setiap molekul miosin yang melekat ke F-aktin maka ujung positif adalah yang di depan dan ujung minus adalah yang

dibelakang sesuai arah rumbai molekul miosin. Polaritas FM menjadi sangat penting berkaitan dengan penambahan dan penguraian monomer-monomer aktin.

Pada kondisi penambahan monomer G-aktin lebih cepat di ujung positif dibanding penguraiannya di ujung minus maka FM disebut mengalami pertumbuhan, atau sebaliknya. Kondisi arah rumbah protein miosin pada beberapa FM tidak bisa dijadikan patokan. Jika G-aktin mengalami polimerasi menjadi filamen berukuran pendek yang kemudian mengikat S1 maka polimerasi selanjutnya bisa ke arah yang berlawanan dari arah rumbai-rumbai S1. Dengan begitu, ujung filamen yang

mengalami penambahan kemudian disebut ujung positif. Artinya, akan

disebut ujung positif jika mengalami pertumbuhan yang lebih cepat dibanding penguraian di ujung minusnya.

Pada saat monomer G-aktin mengalami polimerasi membentuk filamen, maka ATP yang berikatan dengan G-aktin akan dihidrolisis menjadi ADP. Hal yang serupa dengan GTP yang berikatan dengan dimer tubulin dalam pertumbuhan TM. Dengan begitu, ujung-ujung FM yang mengalami pertumbuhan (ujung positif) akan

mempunyai tudung kompleks ATP-F-aktin. Semakin ke ujung negatif maka

kompleks ATP-F-aktin akan berubah menjadi ADP-F-Aktin. Dari hasil eksperimen in vitro, ternyata kompleks ATP-G-aktin dan ADP-G-aktin mempunyai peluang yang sama untuk membuat pertumbuhan FM. Hal ini berarti kebutuhan pengaturan dengan pembentukan kompleks ATP-G-aktin tidak terlalu diperlukan untuk pertumbuhan FM.

Pengaturan pembentukan dan penguraian FM terjadi sangat kompleks di dalam sel hidup, yaitu melibatkan berbagai jenis protein berukuran kecil (antara lain protein G, Rac, Rho dan Cdc42) maupun membran fosfolipid (yaitu fosfolipid inositol). Pengaturan tersebut meliputi tahap-tahap awal pembentukan nukleasi (agregasi G-aktin) dan perpanjangan FM yang sebelumnya sudah ada dan pengaturan depolimerasi. Semua molekul yang terlibat dalam pengaturan FM melakukannya dengan mekanisme yang berbeda-beda, walaupun semuanya melibatkan

(setidaknya di tahap-tahap awal pengaturannya) pengikatan GTP.

Jika tidak ada faktor-faktor yang lain, maka pertumbuhan FM sangat tergantung pada ketersediaan monomer ATP-G-aktin bebas dalam sitosol. Jika dalam sitosol

(25)

terdapat molekul yang menyebabkan G-aktin menjadi tidak bebas, misalnya thymosin B4, maka pertumbuhan FM akan terganggu. Sebagaimana disebutkan diatas, peluang ATP-G-aktin dan ADP-G-aktin adalah sama untuk ditambahkan ke ujung positif FM. Berarti jika ATP-G-aktin tidak tersedia bebas dan yang tersedia bebas adalah ADP-G-aktin maka FM tetap mengalami pertumbuhan sampai kemudian ADP-G-aktin juga tidak tersedia akibat diikat oleh ADF/cofilin. Dalam kondisi tertentu, ADF/cofilin mengikat ADP-G-aktin dari ujung minus FM yang kemudian dilepaskan ke sitosol. Jika hal tersebut yang terjadi maka pertumbuhan FM tetap normal karena ADP-G-aktin menjadi tersedia bebas kembali.

Protein Tudung Berfungsi Menstabilkan ujung-ujung FM

Sebagaimana halnya pada TM, ujung-ujung FM tidak bisa tumbuh atau terurai karena ditutupi oleh protein tudung. Salah satu jenis protein tudung yang

menghalangi penambahan monomor G-aktin di ujung sitif adalah Cap-Z. Dengan begitu, Cap-Z bisa dianggap sebagai molekul penstabil FM.

Interaksi antar FM diatur oleh Protein Pengikat Aktin

Sebagai bagian dari sitoskeleton, FM fungsional bisa membentuk polimer aktin dengan berbagai derajat organisasi, mulai dari struktur yang membutuhkan

kekuatan (misalnya mikrovilli, pemanjangan ujung akrosomal sperma avertebrata laut) sampai ke struktur jejaring yang longgar (misalnya struktur korteks sel). Keragaman struktur yang luas tersebut sangat tergantung pada protein-protein pengikat aktin (= protein asesoris pada TM).

Mikrovilli

(26)

Mikrovilli adalah penjuluran-penjuluran yang terdapat pada sisi apikal sel-sel epitel saluran pencernaan. Satu sel bisa mempunyai ratusan mikrovili dengan diameter 0.1 μm dan panjang 1-2 μm sehingga luas permukaan sel bisa bertambah 20 kali lipat. Untuk menyokong struktur mikrovili, di bagian tengahnya terdapat susunan sejajar dari FM membentuk bundel yang sangat kuat. Setiap FM yang menyusun bundel saling diikat oleh protein fimbrin dan villin. Keduanya dikenal sebagai actin-bundling proteins. Ujung-ujung positif FM berada di ujung mikrovili berikatan dengan membran sel melalui plaque padat elektron. Bundel dari FM juga

membentuk ikatan saling-silang dengan membran plasma di sisi lateral melalui struktur protein miosin I dan kalmodulin. Sedangkan di bagian dasar mikrovilli, setiap bundel FM membentuk jejaring filamen yang lebih longgar yang disebut terminal web. Dalam terminal web ini, setiap FM saling diikat oleh miosin dan spektrin, yang kemudian diikatkan ke protein terikat membran plasma atau ke filamen intermediet yang ada di sitoplasma. Dengan begitu, terminal web berfungsi sebagai fondasi (penambat) agar penjuluran mikrovilli yang perpendikular (tegak lurus) dengan dinding saluran pencernaan bisa kokoh.

Korteks Sel

Pada sebagian besar sel-sel hewan bisa ditemukan adanya korteks sel. Korteks sel ini merupakan jejaring tiga dimensi FM tepat dibawah membran plasma. Di

beberapa bagian, FM penyusun korteks membentuk ikatan dengan protein terikat membran sel. Dari struktur seperti di atas, fungsi FM adalah untuk memperkokoh membran plasma, membentuk permukaan sel yang kuat, mengatur

perubahan-perubahan bentuk sel dan terlibat dalam pergerakan sel. Untuk

membentuk jejaring tiga dimensi, beberapa FM dianyam atau saling dilekatkan oleh protein-protein pengikat aktin yang dikenal sebagai actin-binding proteins. Salah satu protein tersebut adalah protein filamin yang terdiri dari gabungan dua utas polipeptida yang saling identik dan ujung-ujung keduanya melekat ke situs

pelekatan protein dalam F-aktin. Dalam hal ini, dua FM disilangkan dan pada posisi silangan diikat oleh dua tali dari protein filamin. Struktur seperti itu memungkinkan terbentuknya jejaring tiga dimensi dari FM sehingga cairan sitosol di bagain korteks mempunyai tekstur gel (kondisi gel). Jika struktur jejaring FM diputus maka sitosol di bagian korteks akan semakin encer (kondisi sol). Perubahan kondisi gel ke sol

(27)

atau sebaliknya berarti diatur oleh pembentukan dan pemutusan jejaring FM yang ada di sitosol. Mekanismenya melibatkan protein gelsolin yang bisa memutuskan jejaring FM yang dibangun oleh filamin dan juga bisa membentuk tudung protein di ujung-ujung FM.

Lamellipodia

Struktur khusus pada sel yang bisa melakukan lokomosi antara lain adalah lamellipodia. Organisasi jejaring FM yang menyusun lamellipodia lebih baik

dibanding yang menyusun korteks tapi masih lebih baik yang menyusun mikrovilli. Struktur FM pada lemellipodia tumbuh bercabang-cabang. Percabangan filamen aktin dibantu oleh molekul profilin. Pada awal pembentukannya, inisiasi nukleasi dibantu molekul mirip aktin, yaitu kompleks Arp2/3. Selain itu, kompleks Arp2/3 juga menginisiasi titik tumbuh cabang. Percabangan yang dibuat oleh Arp2/3 ini bisa diinaktifasi oleh suatu kelompok protein yang dikenal dengan Wiskott Aldrich syndrome protein (WASP). Sindrom ini menyebabkan platelet tidak bisa berubah bentuk sehingga tidak bisa menjadi penyumbat jika pembuluh darah bocor (mekanisme pembekuan darah terganggu).

Fungsi lain dari FM adalah membentuk pelekukan membran sel pada saat

sitokinesis. Untuk bisa melakukan fungsi diatas maka FM harus berikatan dengan protein yang tertanam ke membran plasma dengan bantuan molekul penghubung (linker). Beberapa molekul penghubung FM dengan protein membran adalah band 4.1, ezrin, radixin dan moesin yang dikenal sebagai kelompok protein FERM. Mutasi yang menyebabkan protein kelompok Ferm ini tidak berfungsi akan menyebabkan berbagai proses selular terganggu, misalnya sitokinesis, sekresi dan pembentukan mikrovili. Dalam sel darah merah, protein penghubung antara FM dengan protein membran adalah spektrin dan ankyrin. Keperluan FM yang ada dalam sel-sel darah

(28)

mamalia adalah untuk mengatur perubahan-perubahan bentuk sel selama masa fungsionalnya (misalnya melalui pembuluh kaplier yang sangat sempit dan pengangkutan oksigen).

FILAMEN INTERMEDIET

Filamen intermediet (FI) mempunyai diameter 8-12 nm yang berada diantara filamen mikro (7 nm) dan tubulus mikro (15-25 nm), atau berada diantara filamen tebal dan filamen tipis sel-sel otot. Sampai saat ini, akumulasi pengetahuan tentang ultrastruktur FI banyak diperoleh dari sel-sel hewan, terutama yang ada di otot sebagaimana ditemukan pertama kalinya.

FI merupakan komponen sitoskeleton yang paling stabil dan komponennya paling sedikit larut dalam sitosol. Kestabilan ini diperlihatkan oleh kenyataan tidak

rusaknya FI dalam perlakuan detergen dan larutan berion tinggi maupun rendah pada saat sel dipecah. Sebaliknya, teknik pemecahan sel diatas menguraikan FM maupun TM menjadi subunit-subunit penyusunnya. Karena kestabilannya dalam menopang sitoplasma, sebenarnya istilah sitoskeleton lebih merujuk ke filamen intermediet ini dibanding ke FM dan TM.

FI Bersifat Spesifik Jaringan

FI hanya ditemukan pada sel-sel eukariot yang menyusun organisme multiselular. Polipeptida yang membentuk subunit-subunit penyusun FM dan TM relatif sama pada berbagai jenis sel, sebaliknya, polipeptida yang menyusun subunit-subunit FI sangat beragam dengan runutan asam amino yang berbeda-beda, baik antar jaringan dalam satu tubuh organisme multiselular maupun antar organisme itu sendiri. Berdasarkan pada jenis sel ditemukannya, setidaknya FI bisa

(29)

dikelompokkan menjadi 6 kelas. Kelas I dan II terdiri dari protein-protein keratin yang banyak ditemukan membentuk tonofilamen di dalam sel-sel epitel. Sel-sel epitel merupakan sel pembentuk jaringan epitel yang biasa ditemukan di sisi paling luar dari suatu organ atau melapisi rongga tubuh, misalnya jaringan epitel yang membentuk lapisan mukosa dari saluran pencernaan. FI kelas I merupakan keratin yang bersifat asam, sedangkan kelas II bersifat basa atau netral; dan keduanya bisa terdiri atas 15 macam protein keratin yang berbeda.

FI kelas III meliputi vimentin, desmin dan protein-protein GFA (glial fibrilliary acidic). Vimentin ditemukan dalam jaringan ikat dan sel-sel lain yang berkembang dari sel-sel non epitel. Dalam kultur sel-sel fibroblas, filamen vimentin sangat jelas terlihat menjulur-julur dari titik tengah ke arah perifer sel. Desmin banyak

ditemukan dalam sel-sel otot, dan protein GFA hanya ditemukan dalam sel-sel penyokong syaraf, termasuk sel-sel glial yang mengelilingi akson (sel Schwann). FI kelas IV adalah protein-protein neurofilamen (NF) yang hanya ditemukan dalam sel-sel syaraf yang kemudian bisa dibedakan menjadi dua, yaitu NF major (NF-L) dan NF minor (NF-M dan NF-H). FI kelas V adalah protein lamin atau nuclear lamin yang ditemukan di sisi dalam dari membran yang membungkus inti sel. FI kelas IV adalah nestin yang hanya ditemukan pada sel-sel syaraf yang bersifat embrional.

Selain berdasarkan jenis selnya, pembagian FI menjadi enam kelas diatas juga didasarkan pada gen-gen penyandi proteinnya yang masih saling berhubungan sebagai satu keluarga gen penyandi FI. Perbedaan-perbedaan antar jenis sel dalam satu tubuh kemudian ditentukan oleh mode ekspresi dan modifikasi

pascatranslasinya. Dengan begitu, spesifisitas setiap kelas FI kemudian membuat FI bisa digunakan sebagai pelacak jenis-jenis sel dalam satu tubuh. Pada saat ini, analisis FI biasanya menggunakan mikroskop fluoresensi. Pelacakan jenis-jenis sel dalam tubuh organisme multiselular biasa dilakukan untuk menentukan asal-usul sel kanker yang mengalami metastasis sebagai dasar dari pemilihan tindakan medis selanjutnya.

Protein Fibrosa adalah Subunit Penyusun FI

Walaupun subunit-subunit protein penyusun FI sangat beragam dari segi ukuran dan sifat-sifat kimianya, mereka disandikan oleh gen-gen yang masih berhubungan. Semua subunit penyusun FI bisa dikategorikan sebagai protein fibrosa. Bandingkan dengan protein globular yang menjadi subunit-subunit penyusun FM dan TM. Semua

(30)

protein fibrosa penyusun FI mempunyai domain tengah berbentuk batang yang saling homolog dengan ukuran yang sangat stabil (berkisar antara 310-318 asam amino) dan bisa membentuk struktur sekunder yang juga stabil. Domain tengah tersebut terdiri atas empat segmen berstruktur heliks yang saling disambung oleh segmen penyambung berukuran pendek. Domain tengah diapit oleh ujung N dan ujung C yang sangat beragam dari segi ukuran, runutan asam amino dan fungsinya. Dengan begitu, fungsi dari setiap FI ditentukan oleh ujung N maupun oleh ujung C-nya.

Pembagian kelas filamen intermediet

Kela s Protein FI BM (kDa) Jaringan Fungsi I Keratin bersifat asam 40-56. 5 Epitel Kekuatan mekanis II Keratin bersifat basa atau netral 53-67 Epitel Kekuatan mekanis III Vimentin 54 Fibroblas, sel-sel yang

berasal dari mesenkim, lensa mata

Mengatur bentuk sel III Desmin 53-54 Otot, terutama otot

polos

Menyokong sifat

kontraktil

(31)

(32)

III

(33)

Protein GFA

(34)

50

(35)

Sel-sel glial dan asterosit

(36)

Mengatur bentuk sel

(37)

IV

(38)

Protein

neurofilamen

(39)

(40)

Syaraf pusat dan tepi

(41)

http://achamad.staff.ipb.ac.id/2011/11/23/sistem-sitoskeleton/ Pemanjanga n dan diameter akson page 41 / 174

(42)

(43)

NF-L (major)

(44)

page 44 / 174

(45)

(46)

(47)

(48)

page 48 / 174

(49)

(50)

(51)

(52)

(53)

page 53 / 174

(54)

(55)

(56)

page 56 / 174

(57)

(58)

(59)

(60)

(61)

(62)

page 62 / 174

(63)

(64)

(65)

(66)

(67)

(68)

(69)

(70)

(71)

(72)

(73)

(74)

(75)

(76)

(77)

(78)

(79)

FUNGSI-FUNGSI SEL TERKAIT SITOSKELETON

Ketiga komponen sitoskeleton, yaitu filamen mikro, tubulus mikro dan filamen intermediet yang sebelumnya dibahas secara terpisah, pada kenyataannya di

(80)

(81)

(82)

(83)

(84)

(85)

(86)

(87)

(88)

(89)

(90)

(91)

(92)

(93)

(94)

(95)

(96)

(97)

(98)

(99)

(100)

(101)

(102)

(103)

(104)

(105)

(106)

(107)

(108)

(109)

(110)

(111)

(112)

(113)

(114)

(115)

(116)

(117)

(118)

(119)

(120)

(121)

(122)

(123)

(124)

(125)

(126)

(127)

(128)

(129)

(130)

(131)

(132)

(133)

(134)

(135)

(136)

(137)

(138)

(139)

(140)

(141)

(142)

(143)

(144)

(145)

(146)

(147)

(148)

(149)

(150)

(151)

(152)

(153)

(154)

(155)

(156)

(157)

(158)

(159)

(160)

(161)

(162)

(163)

(164)

(165)

(166)

(167)

(168)

(169)

(170)

(171)

(172)

(173)

(174)