Perbandingan Efektifitas dari
Fish Oil,
Kurkumin dan Metformin pada Perbaikan Resistensi Insulin Mencit ObesNama Penyusun Laporan :
1. Mardiana
z. Nur Ashari
3. A. Yasmin Syauki
Bagian ilmu Gizi Fakultas Kedokteran Universitas Hasanuddin Makassar
Perbandingan Efektifitas dari
Fish Oil,
Kurkumin dan Metformin pada Perbaikan Resistensi Insulin Mencit ObesNama Penyusun Lap
1. Mardiana
2. Nur Ashari
3. A. Yasmin Syauki
Bagian ilmu Gizi Fakultas Kedokteran Universitas Hasanuddin Makassar
BABI PENDAHULUAN
Obesitas didefinisikan sebagai suatu keadaan yang ditandai dengan penimbunan jaringan lemak secara berlebihan dari yang diperlukan untuk fungsi tubuh yang normal. Obesitas telah menjadi pandemi global di seluruh dunia dan dinyatakan oleh Word Health Organization (WHO) sebagai masalah kesehatan kronis terbesar pada orang dewasa (Soegih R, 2009). Pada tahun 2003 Badan Kesehatan Dunia (WHO) menunjukkan data bahwa 17,5% populasi Indonesia dikategorikan over weight (kegemukan) dan 4,7% obesitas. Apabila digunakan klasifikasi obesitas untuk orang Asia yaitu indeks massa tubuh lebih dari 25 kg/m2, maka hasilnya menjadi 48,97% pria dan 40,65% wanita (Nugraha, 2009).
Hasil penelitian akhir-akhir ini menunjukkan bahwa jaringan adiposa bukan hanya sebagai tempat penyimpanan lemak, tetapi juga merupakan organ endokrin yang berperan penting dalam interaksi dengan signal endokrin, metabolik dan inflamasi untuk mengatur homeostasis energi. Matsuzawa dkk telah buktikan sel lemak (adiposa) mengsekresi berbagai macam protein ke dalam sirkulasi. Protein ini secara kolektif disebut sebagai adipositokin, yang sekarang lebih sering disebut sebagai adipokin, yaitu leptin, plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), adipsin, resistin, dan adiponektin. Tidak seperti yang lainnya, adiponektin temyata unik oleh karena dapat meningkatkan sensitivitas insulin (Matsuzawa Y, 2004).
Penelitian akhir-akhir ini merubah pandangan kita tentang jaringan adiposa. Anggapan awal bahwa jaringan adiposa merupakan jaringan yang pasif dan hanya berfungsi sebagai tempat menyimpan kelebihan
energi (dalam bentuk trigliserida) telah berubah secara drastis. Asam lemak bebas adalah bentuk bebas lipoprotein akibat adanya enzim lipoprotein lipase (LPL) yang masuk ke dalam sel adiposa, dan berkumpul kembali dalam bentuk trigliserida melalui proses esterifikasi menjadi gliserol. Sel adiposa mempunyai peran fisiologi yang penting dalam memelihara trigliserida dan kadar asam lemak bebas, juga mempengaruhi resistensi insulin. Dengan demikian jaringan adiposa saat ini merupakan jaringan yang aktif berperan dalam mengatur secara aktif jalur homeostatis energi. Aktivitas tersebut dikendalikan oleh jalinan kerja sinyal hormonal dan neuronal yang kompleks (Bray, 2004) (Fruhbeck G, 2001).
Jaringan lemak mempunyai dua fungsi yaitu sebagai tempat penyimpanan lemak dalam bentuk trigliserida, dan sebagai organ endokrin. Sel lemak menghasilkan berbagai harmon yang disebut juga adipositokin (adipokin) yaitu leptin, tumor necrosis factor alpha (TNF-alfa), interleukin-6 (IL-6), resistin, dan adiponektin. Harmon-harmon tersebut berperan juga pada te�adinya resistensi insulin.
Sel adiposa yang membesar akan merangsang terjadinya inflamasi sehingga makrofag masuk ke jaringan adiposa dan melepaskan sekret protein proinflamasi. Oleh karena itu mengendalikan respon proinflamasi bermanfaat mencegah atau memperbaiki efek patologis dari obesitas (Kelley D, 2000).
Jaringan adiposa model binatang coba yang obes ditandai dengan adanya suasana inflamasi atau disebut juga sebagai sel lemak yang sedang "sakif (sick fat cells), serta tampak adanya infiltrasi makrofag yang sejalan dengan derajat obesitas. Perubahan pada sel adiposa dalam hal jumlah dan ukuran sel, menyebabkan perubahan pada daerah sekitamya dan te�adi modifikasi fungsi parakrin dari jaringan adiposa (Lee, 2005).
Pada kondisi obesitas akan te�adi penurunan konsentrasi adiponektin. Penurunan kadar adiponektin diduga berperan dalam patogenesis resistensi insulin terlepas apakah termasuk kategori obesitas atau tidak, penyakit kardiovaskular yang terkait dengan obesitas (Yildiz , 80, 2004), (Chandran M,2003), (Trujillo ME, 2005). Konsentrasi adiponektin disimpulkan ada hubungan yang kuat dengan obesitas sentral dan resiko penyakit kardiovaskuler (Smith, 2006). Obesitas sentral mempunyai risiko hipoadiponektinemia 5 kali lebih besar dibandingkan dengan non obesitas sentral (Gotera, 2006).
Adiponektin merupakan salah satu dari banyak faktor spesifik jaringan adiposa. Adiponektin berperan memperbaiki sensitivitas insulin dan menghambat peradangan vaskuler. Kadar adiponektin di dalam plasma secara bermakna menurun pada subyek yang mengalami obesitas, resistensi insulin, dan pengidap diabetes melitus tipe 2 (Roberto B, 2004).
Berbagai penelitian menunjukkan bahwa aktifasl AMP kinase merupakan bagian dari efek signalling dari adiponektin. AMP kinase akhir akhir ini, dianggap sebagai komponen yang berperan dalam mekanisme kerja metformin sehingga diduga adiponektin mempunyai efek metabolik anti diabetik melalui peningkatan sensitivitas insulin (Fernandez-Real, 2004).
Secara garis besar dampak adiponektin terhadap respon inflamasi adalah menghambat produksi TNF-a, sehingga dianggap adiponektin adalah anti inflamasi (Chandran M, 2003). Adiponektin juga menurunkan kadar trigliserida hati dan otot melalui peningkatan ekspresi gen peroxisome proliferator activated receptor (PPAR) a dan y (Chan NN, 2005).
Saat ini penelitian ekstrak kurkuma lebih difokuskan pada mekanisme efek molekulernya. Kurkumin sebagai zat .aktif yang terdapat pada ekstrak kurkuma diketahui mempunyai sifat anti inflamasi dengan cara menghambat produksi IL-1, IL-6 dan TNF-a dan merangsang sekresi IL-10 pada hewan coba (Sharma, 2007). Kurkumin juga dilaporkan mempunyai efek anti inflamasi yang diperlihatkan dengan memicu ekspresi PPARy (leu TH, 2002).
Fish oil yang banyak mengandung n-3 sebagai prekursor EPA dan DHA telah dibuktikan dalam beberapa penelitian mempunyai efek anti inflamasi. Penelitian oleh Neschen melaporkan fish oil 27% dalam diet binatang percobaan dapat memicu sekresi adiponektin secara tidak langsung, yaitu melalui jalur PPAR-y dan PPAR-a (Neschen, 2006).
Kurkumin dan fish oil keduanya merupakan bahan alami yang berlimpah di tanah air kita, pemanfaatan keduanya perlu dilakukan untuk memberi manfaat bagi kita semua. Dari beberapa bukti diatas bahwa efek fish oil dan kurkumin sebagai anti inflamasi maka penelitian ini saya anggap penting dilakukan sehingga nantinya keduanya dapat direkomendasikan sebagai suplementasi bagi penderita obes.
Penelitian ini dilakukan pada mencit mengingat pada penelitian hewan perbedaan faktor genetik dapat dikendalikan dan pengaruh rancu dari lingkungan dapat diminimalisasi sehingga patomekanisme penyakit dapat menjadi lebih baik ditelusuri dibanding penelitian pada manusia.
Menurut pengetahuan kami, belum pernah ada penelitian untuk membandingkan efek gabungan keduanya dengan melihat peningkatan sensitivitas insulin berdasarkan mekanisme peningkatan kadar adiponektin dengan kontrol positif obat anti diabetes metformin pada mencit obes maka kami anggap sebagai nilai novel penelitian ini.
Berdasarkan uraian di atas maka hal tersebut mendorong penulis untuk melakukan penelitian mengenai "pengaruh pemberian fish oil, ekstrak kurkuma dan terhadap peningkatan kadar adiponektin mencit obes".
1.2 rumusan masalah
Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan di atas maka dapat dirumuskan masalah penelitian sebagai berikut yaitu :
1. Sejauh mana pengaruh pemberian fish oil dan ekstrak kurkuma dibanding metformin terhadap perbaikan sensitivitas insulin pada mencit obes ?
2. Sejauh mana pengaruh pemberian fish oil dan ekstrak kurkuma dibanding metformin terhadap berat badan pada mencit obes ? 3. Sejauh mana pengaruh pemberian fish oil dan ekstrak kurkuma
dibanding metformin terhadap peningkatan kadar adiponektin, pada mencit obes ?
4. Sejauh mana pengaruh pemberian fish oil dan ekstrak kurkuma dibanding metformin terhadap penurunan TNF-a, pada mencit obes?
5. Sejauh mana pengaruh pemberian fish oil dan ekstrak kurkuma dlbanding metformin terhadap penghambatan ekspresi Sterol Regulatory Element Binding Protein (SREBP-1c) pada mencit obes?
6. Sejauh mana hubungan peningkatan kadar adiponektin penurunan TNF-a, penghambatan ekspresi Sterol Regulatory Element Binding Protein (SREBP-1 c) dengan penurunan berat badan dan sensitivitas insulin melalui tes toleransi glukosa, tes toleransi insulin pada mencit obes?
1.3 Tujuan Pene litian
1.3.1 Tujuan Umum
Melihat pengaruh pemberian fish oil, kurkumin dan kombinasi keduanya terhadap mekanisme perbaikan resistensi insulin mencit obes.
1.3.2 Tujuan Khusus
a. Membandingkan berat badan sebelum dan setelah intervensi pada mencit kontrol dan perlakuan.
b. Membandingkan resistensi insulin melalui tes toleransi glukosa dan Insulin (TTG & TTl) setelah intervensi pada mencit kontrol dan perlakuan.
c. Menganalisa mekanisme perbaikan resistensi insulin dan metabolisme glukosa dengan mengukur kadar protein dan ekspresi adiponektin, TNF-a, SREBP-1c, setelah intervensi pada mencit kontrol dan perlakuan.
1.4. Hipotesis Penelitian
Pemberian fish oil dan ekstrak kurkuma dapat memperbaiki resistensi insulin melalui peningkatan kadar adiponektin, penurunan TN F a, penghambatan ekspresi Sterol Regulatory Element Binding Protein (SREBP-1c) dan penurunan berat badan mencit obes.
1.5 Manfaat Penelitian
a. Memberikan informasi ilmiah mengenai manfaat suplementasi fish oil dan kurkuma dalam perbaikan metabolism glukosa melalui peningkatan kadar adiponektin, penurunan TNF-a dan penurunan ekspresi SREBP-1c sehingga meningkatkan oksidasi lemak.
b. Memberi informasi kepada masyarakat manfaat suplementasi fish oil dan kurkuma yang dapat menurunkan berat badan penderita obes.
c. Dapat dijadikan acuan untuk penelitian selanjutnya untuk menggali mekanisme molekuler selanjutnya.
d. Dapat menjadi bahan pertimbangan industri masyarakat untuk lebih mengembangkan pemanfaatan fish oil (minyak ikan) dan kurkuma {kunyit) karena berdasarkan manfaatnya bagi penderita obes. e. Dapat dijadikan sebagai sumber informasi untuk peneliti
selanjutnya, antara lain penefitian dengan suplemen gabungan keduanya pada penelitian manusia pada penyakit yang berhubungan dengan obesitas.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Jaringan adiposit model binatang coba yang obes ditandai dengan adanya suasana inflamasi atau disebut juga sebagai sel lemak yang sedang "sakit" (sick fat celfs), serta tampak adanya infiltrasi makrofag yang sejalan dengan derajat obesitas. Perubahan pada adiposit dalam hal jumlah dan ukuran sel, menyebabkan perubahan pada daerah sekitarnya dan te�adi modifikasi fungsi parakrin dari adiposit. Pada keadaan obes, adiposit akan mengsekresi TNF-a, yang akan menstimulasi preadiposit mengeluarkan monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1 ). Dengan pola yang sama, sel endotel juga menghasilkan MCP-1 sebagai respons terhadap rangsangan sitokin. {Lee,2005)
Resistensi insulin pada keadaan prediabetes menyebabkan peningkatan faktor-faktor pro inflamasi seperti hsCRP, TNFa, IL-6 serta te�adinya penurunan faktor anti inflamasi. Penelitian oleh Pradhan dkk menyimpulkan bahwa kadar hsCRP dan kadar IL-6 yang tinggi merupakan
faktor risiko bagi penyakit diabetes mellitus dan kardiovaskuler di kemudian hari. (Pradhan,2001)
Pada kondisi obesitas akan te�adi penurunan konsentrasi adiponektin. Penurunan kadar adiponektin diduga berperan dalam patogenesis resistensi insulin terlepas apakah termasuk kategori obesitas atau tidak. (Chandran M,2003) (Trujillo ME, 2005) Adiponektin terletak pada kromosom 3q27, sebuah lokus yang juga diketahui secara struktural homolog dengan TNF-a. Produksi TNF a yang berlebihan oleh jaringan adiposa menyebabkan terjadinya resistensi insulin. Penurunan kadar adiponektin plasma berperan kausatif terhadap perkembangan resistensi insulin.(Hotta,2000). Oleh sebab itu secara garis besar dampak adiponektin terhadap respon inflamasi adalah menghambat efek proinflamasi dari TNF-a, sehingga ada anggapan adiponektin sebagai anti inflamasi.
Adiponektin adalah protein yang disekresikan secara spesifik oleh adiposit. Kadarnya akan meningkat sebagai respon terhadap adanya paparan agonis PPARy sehingga kadar adiponektin dalam serum akan meningkat secara signifikan. {Bouskila M,2005).
Peningkatan asam lemak bebas pada subyek obes merupakan akibat dari resistensi insulin dan peningkatan TNF-a sehingga terjadi lipolisis terutama dari lemak intraperitoneal. Asam lemak ini akan menghambat kerja insulin di jaringan perifer terutama otot skelet yang akan menggunakan 70% dari glukosa darah. Peningkatan oksidasi lemak di jaringan otot misalnya dengan aktivitas akan meningkatkan sensitivitas insulin. Obat diabetes golongan metformin merupakan salah satu obat paling unggul untuk meningkatkan sensitivitas insulin melalui peningkatan oksidasi lemak di hati dan otot skelet dengan target peningkatan aktivitas AMPK, PPAR-a, dan inhibisi ekspresi Sterol Regulatory Element Binding
Protein (SREBP-1c) di hati yang merupakan faktor transkripsi untuk sintesa protein dan enzim sintesa lemak. Penurunan �kumulasi lemak ini akan menurunkan inflamasi yang merupakan penyebab resistensi insulin (Hotta,2000)(Berg AH,2002) (Berg AH, 2005).
Hati merupakan tempat metabolisme asam lemak. Faktor transkripsi SREBP-1c merupakan kunci dalam metabolisme asam lemak melalui pengaturan ekpresi variasi gen yang berkontribusi terhadap sintesis asam lemak. Sebuah observasi menyatakan bahwa ekspresi SREBP-1c dalam hati adalah up-regulated pada model tikus obes dan bahwa ekspresi berlebihan transgenik SREBP-1c menginduksi hipertrigliseridemia atau hepatik steatosis, disarankan bahwa peningkatan SREBP-1c yang melimpah dalam hati memberi kontribusi terhadap patogenesis dari penyakit ini. Mekanisme yang mendasari peningkatan ekspresi SREBP-1c pada binatang obes bagaimanapun tetap tidak diketahui. (Mototsugu Takashima, 2009). Prinsipnya bahwa SREBP-1c adalah mediator sentral aktifitas genomik insulin terhadap metabolism karbohidrat dan lipid dalam hati dan jaringam adiposa (Smih, 2002) .
11.1 Efek Fish Oil Terhadap Sensitivitas Insulin
Minyak Omega merupakan minyak yang memiliki kadar tinggi asam lemak omega (omega berarti akhir). Jadi a sam lemak Omega-3 berarti � ikatan rangkap tak jenuh yang terdapat pada atom C ketiga dan pat terakhir dihitung dari gugus methyl-nya , demikian seterusnya · Omega-6 dan Omega-9.
Penelitian pada binatang model, untuk melihat kadar adiponektin setelah pemberian omega 3 menunjukkan efek anti inflamasi dapat
meningkatkan sensitivitas insulin melalui mekanisme yang mandiri
PPARy-dependent mechanism dan adiponectin depe_ndent mechanism.
Kesimpulan dari penelitian ini bahwa omega 3 berperan untuk menurun gejala gangguan metabolisme seperti peradangan, kelainan Profil lipid
kelainan, fungsi endotel, dan tekanan darah melalui adiponectin dependent mechanism. (D, 2007)
Penelitian mencit obesitas dapat melihat omega 3 mencegah resistensi insulin melalui jalur PPARa-dependent pathway dimana diacylglycerol (DAG) dianggap sangat berperan sebagai prediktor sensitivitas insulin. (Neschen S, 2006)
Pada model tikus obesitas dan lipoatrofi, terjadi resistensi insulin yang disertai dengan penurunan kadar adiponektin. Pada manusia, kadar adiponektin secara bermakna lebih rendah pada keadaan resistensi insulin, termasuk diabetes tipe-2 .. Penelitian meta analisis membuktikan pengaruh omega 3 dalam menurunkan glukosa darah pada penderita diabetes. (Friedberg C, 1998). Omega 3 juga dapat meningkatkan adiponektin plasma pada penelitian tikus. (Duda MK, 2007). Kenyataan membuktikan jaringan adiposit berhubungan erat dengan ukuran besarnya sel adiposit dan menyebabkan ekspresi proinflamasi, sehingga timbul resistensi insulin, seperti TNF a. (Weisberg S P, 2003) (Xu H, 2003)·
Pada beberapa peneHtian tahun-tahun terakhir menjelaskan efek omega 3 menjelaskan mekanisme kerjanya, bersifat memicu PPARy sehingga menghambat aktivitas kerja makrofag. (Ricote M, 1 998)
Eicosanoid (EPA) banyak dijetaskan mempunyai kemampuan menghambat inflamasi jaringan adiposa. Aktivitas hambatan inflamasi in melalui peroxisome proliferator-activator receptors (PPARs) a, 6 and y, yang pada penelitian akhir-akhir ini dianggap bersifat anti pada jaringan
adiposa dan makrofag. (Kliewer SA, 1997) (Tsuchida A, 2005) Omega-3 dalam fish oil menghambat transkripsi gen SREBP-1 (sterol regulatory element binding) yang mengatur produksi enzim lipogenesis seperti fatty acid synthase (FAS), acetyi-CoA carboxylase (ACC), stearoyi-CoA desaturase (SCD), dan S14 protein. (Fujiwara H, 2008). Penelitian hewan menunjukkan pemberian fish oil dapat menekan proses lipogenesis melalui penekanan pematangan SREBP1 melalui penekanan terhadap ekspresi mRNA SREBP1c. SREPB1 adalah gen yang mengatur enzim cholesterologenic dan lipogenic (Kim HJ, 1999)
Minyak ikan (fish oil) mengandung asam eicosapentanoat (EPA) (C20:5n-3) dan asam docosa-heksanoat (DHA) (C22:6n-3) yang termasuk dalam kelompok asam lemak w-3.Secara lengkap kandungan Fish oil yang digunakan dalam penelitian ini yaitu: 14:0 Myristic acid, 6-9%, 16:0 Palmitic acid, 15-20%,16:1 Palmitoleic acid, 9-14%, 18:0 Stearic acid, 3-4%, 18:1 Oleic acid, 5-12%, 18:2 Linoleic acid, <3%, 18:3 Linolenic acid, <3%, 18:4 Octadecatetraenoic acid*, 2-4%, 20:4 Arachidonic acid, <3%, 20:5 Eicosapentaenoic acid*, 10-15%, 22:6 Docosahexaenoic Acid*, 8-15%.( * adalah asam lemak omega 3 ) yang berasal dari produk sigma.
Omega-3 dalam fish oil menghambat transkripsi gen SREBP-1 (sterol regulatory element binding) yang mengatur produksi enzim lipogenesis seperti fatty acid synthase (FAS), acetyi-CoA carboxylase (ACC), stearoyi CoA desaturase (SCD), dan S14 protein. Selain itu, asam lemak omega-3 meningkatkan transkripsi enzim regulator untuk oksidasi asam lemak, seperti acyi-CoA oxidase (ACO), medium-chain acyi-CoA dehydrogenase (MCAD), lipoprotein lipase (LPL), Fatty Acid Binding Protein (FABP), acyi CoA synthetase (ACS), uncoupling protein-2 (UCP2). dan camitine palmitoyltransferase-1 (CPT-1), dengan mengaktivasi peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-a. (Reddy J , 1 999) melaporkan fish oil 27% dalam diet binatang percobaan dapat memicu sekresi adiponektin
secara tidak langsung, yaitu melalui jalurPPAR-y dan PPAR-a. (Neschen s ,2006)
Dalam suatu penelitian yang menggunakan fish oil dalam jangka
pendek dan jangka lama ternyata menunjukkan hasil peningkatan kadar gen adiponektin sekitar 2 kali lipat dalam lemak epididimal, yang selaras dengan peningkatan 2 - 3 kali lipat ekspresi PPAR-y. Hal ini menunjukkan
fish oil merupakan suatu bahan alami yang merupakan aktivator dari
PPARa dan PPARy. Fish oil yang banyak mengandung n-3 sebagai
prekursor EPA dan DHA telah dibuktikan dalam beberapa penelitian mempunyai efek anti-inflamasi, anti-thrombosis, hipolipidemia, dan
meningkatkan kadar adiponektin plasma. (Ridker, 1999)
11.2 Tlnjauan Efek Kurkumin dalam Perbaikan Sens itivitas Insulin
Kunyit (Curcuma longa Linn.) Sinonim :Curcuma domestics Val.atau C.
domestics Rumph atau C. longa Auct. Merupakan Familia
:Zingiberaceae.
Nama Lokal : Turmeric, Saffron (lnggris), Kurkuma (Belanda), Kunyit (Indonesia dan Malaysia); Kunir (Jawa), Koneng (Sunda), Konyet (Madura).
Kunyit (Curcuma domestic) termasuk salah satu tanaman rempah dan obat, habitat asli tanaman ini meliputi wilayah Asia khususnya Asia Tenggara. Tanaman ini kemudian mengalami penyebaran ke daerah Indo
Malaysia, Indonesia, Australia bahkan Afrika. Hampir setiap orang Indonesia dan India serta bangsa Asia umumnya pernah mengkonsumsi tanaman rempah ini, baik sebagai pelengkap bumbu masakan, jamu atau untuk menjaga kesehatan dan kecantikan. Rhizoma dari kunyit ini telah lama dikenal di dunia sebaga dapur dan pewarna makanan. Juga
digunakan sebagai tanaman obat untuk perlakukan keseleo dan radang di India, negeri China dan negara-negara Asia lainnya.
Di Asia lebih dari 30 jenis spesies kurkuma (Zingiberaceae) ditemukan di Asia, dimana rhizome dari tumbuhan ini dapat digunakan baik sebagai bahan bumbu makanan dan obat, seperti pada obat tradisional Indonesia (Jamu) and obat tradisional Cina. Tumbuhan ini berbau harum dan carminative, dan digunakan pada gangguan pencernaan, penyakit hepatitis, ikterus, diabetes, atherosklerosis dan pengobatan akibat infeksi bakteri. Beberapa spesies Kurkuma seperti Curcuma tonga, Curcuma aromatica and Curcuma xanthorrhiza adalah bentuk-bentuk yang popu/er. Komponen utama dari spesies curcuma adalah kurkuminoid (curcumin, desmetoxicumin dan bisdesmetoxicurcumin). Kurkumin adalah komponen yang terbanyak dan menjadi komponen penting yang ditemukan pada tumbuhan ini. (ltokawa H, 1985)
Pertama kali diisolasi tahun 1 870, tapi struktur kimianya baru dapat ditemukan sampai tahun 1 9 1 0. Kurkuminoid sebagai komponen yang utama dalam jenis kurkuma ,yang bertanggung jawab untuk efek farmakologis karena sifat kimia dan biologinya. Kurkuminoid dalam C. /onga dan spesies kurkuma lainnya terutama terdiri dari curcumin (1), bis demethoxycurcumin (2) and demethoxycurcumin (3) dimana banyak penelitian menunjukkan spectrum aktivitas biologiknya. Kurkumin
[ { diferuloylmethane, 1 , 7 -bis-( 4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dioneJ adalah bentuk pemberi warna kuning yang diisolasi dari C. tonga dan jenis Curcuma lainnya. (Uehara S, 1987}, (Milobedzka J, 1910)
Efek terkenal dari kurkumin adalah anti inflamasi. Aktivitas kurkumin yang lain adalah dapat menurunkan kolesterol darah, lipoprotein ( LDL) yang teroksidasi, (Soni KB, 1992) menghambat agregasi platelet,
arthritis, multiple sclerosis dan Alzheimer's disease, menghambat replikasi virus human immunodeficiency virus (HIV), mempercepat penyembuhan luka, meningkatkan sekresi empedu, hepatoprotektor, cataract formation, pulmonary toxicity dan fibrosis, anti-leishmaniasis dan anti-atherosclerotic, baik pada saat pencegahan maupun pengobatan. Efek toksisitas kurkumin tidak ditemukan bahkan pada dosis tinggi, dan telah digolongkan sebagai 'generally recognized as safe' (GRAS) oleh National Cancer Institute. Saat ini penelitian lebih difokuskan pada mekanisme efek molekulernya. (Leu TH, 2002) (Aggarwal BB, 2003). Penelitian dengan binatang membuktikan kurkumin dapat menghambat adipogenesis dan angiogenesis pada tikus obesitas. Penelitian ini dilakukan pada mencit yang diberi diet tinggi lemak dan intervensi dengan kurkumin 500 mglkg selama 12 minggu (Ejaz A, 2009).
Dalam berbagai studi binatang, didapatkan suatu dosis curcumin pada 100-200 mg setiap kilogram berat badan sebagai anti inflamasi. Dengan dosis yang sama tidak menimbulkan efek kurang baik pada manusia. Dosis letal peroral ( LD50) pada tikus, yang lebih tinggi dibanding 2.0 g/kg badan., sifat anti inflamasi kurkumin dengan cara menghambat produksi 1, 6 dan TNF-a dan merangsang sekresi IL-1 0. (Sharma, 2007)
Beberapa laporan menggambarkan kemampuan kurkumin sebagai anti diabetes. Kurkumin dapat menurunkan level glukosa darah pada penelitian tikus. (Mahesh T. 2005) dan kurkumin juga dilaporkan dapat meningkatkan sensitivitas insulin pada tikus percobaan (Weisberg SP, 2008). Dari penelitian tikus yang lain, dapat ditarik kesimpulan kurkumin mempunyai efek anti inflamasi yang dapat menghambat produksi glukosa pada hepatosit (Fujiwara H, 2008).
Kurkumin dilaporkan mencegah stimulasi efek insulin pada adiposit. Efek kurkumin mencegah penghambatan terhadap reseptor GLUT 4
sebagai transporter glukosa di sel. (lkonomov OC, 2002). GLUT4 adalah reseptor glukosa pada permukaan sel, yang menjelaskan kemampuan ambilan glukosa oleh sel. Tapi efek kurkumin dilaporkan menghambat secara langsung transport glukosa ke jaringan adiposit, dan jarang mempunyai efek pada insulin. lni adalah alasan kurkumin sebagai anti diabetes dijelaskan oleh Grenn dkk, pada penelitian berjudul Curcumin is a Direct Inhibitor of Glucose Transport in Adipocytes. (Green A, 2006). Curcumin dapat menekan ekspresi gen LDLR dengan mengaktifkan PPARy dan menekan ekspresi gen SREBP1c. (Qiaohua Kang, 2009)
BAB Ill. KERANGKA KONSEP
(
Kurkumi)
.(
Fish Oil)
I
G
Kurkumin +Fish Oil[§
tfonninJ
I
Keterangan:]
c::=J = Variabel bebas�
Sel·
I
iposa'
I
normalI
' "--0 = Variabel tergantung rniGl = Variabel antara-Variabel kendall
-... ...-;. ·-·--;-· --
-TNF -a,
I�
PPARa,- Sel PPAR y,
Diet aobes diposa
GLUT-4
AMP-tinggi kinase
I
-:: """1J
...�en•s ;' _ . :)II ·: 1-; _:<
'
��:
-: :,,,. ;_ ·-•. Ke :l&rQ
'
m'
·
·
--···::
�
..
:· ·-.. 1_ · !L:IZ: .!'··-···=:::> = Hubungan variabel bebas
===::> = Hubungan variabel tergantung c=::> = Hubungan variabel antara
�
= Hubungan varlabel kendali�
--
I
'c)
1I
Berat Badan, TIG, ITI, Acliponektin, TN F-a, SREBPicrv .1 Des a in Penelitian
BABIV
METODE PENELITIAN
Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental.
IV.2 Tempat Dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di animal laboratorium Fakultas Kedokteran UN HAS Makassar, direncanakan mulai bulan juli sampai desember 201 1 .
IV .3 Subyek Penelitian
Populasi yang digunakan adalah mencit sehat, jenis kelamin jantan dengan galur C57BU6J. Sampel yang diambil adalah mencit umur 5 minggu dengan berat badan 1 5-20 gram sebanyak 30 ekor.
Dibagi dalam 6 kelompok, disetiap kelompok terdapat 5 ekor mencit.
N.4 ljin Penelitian dan Ethical Clearance
Permintaan ijin penelitian ini dinyatakan memenuhi persyaratan etik penelitian hewan dari Komisi Etik Penelitian Biomedis Fakultas Kedokteran Universitas Hasanuddin, seperti terlihat pada lampiran 3. IV .5 Alat dan Bahan Penelitian
JV.5.1 Alat Penelitian
Kandang mencit, sterilisator, autoklaf, elektroforesis, ELISA (Lab. System Multiscan Ascent) mechine, QRT-PCR mechine, inkubator C02, mikropipet (Ependorf Tube 1,5 cc,), sentifuge, seperangkat alat bedah hewan, dan timbangan digital mencit, disposible 1 cc, tabung 50 cc, PCR Tube, tips kuning, tips biru, glukometer. hand shoen free powder, QRT-PCR master mix.
Menhaden Oil per 100 gms (01 1031002) ,kurkumin C7727, Metformin 500 mg, D-glukosa powder, Insulin injeksi, , strip glukometer, Aquades lnjeksi 20 cc, mause adlponektin elisa kit, Primers adiponektln, RNAesay mini kit., buvicaine 0,25%.
W .6 Prosedur Penelitian
IV.6.1 Prosedur Penelitian Eksperimental
Seluruh mencit dikandangkan pada kondisi bebas patogen dan diadaptasikan pada kondisi laboratorium selama 2 minggu dengan pemberian makanan normal dan diberi siklus penerangan 12 jam gelap,
12 jam terang. Mencit kemudian dibagi menjadi 6 kelompok, yaitu:
1 . Kelompok 1: Mencit umur 5 minggu, sebanyak 5 ekor diberikan diet normal, sebagai kelompok kontrol normal.
2. Kelompok II: Mencit umur 5 minggu, sebanyak 5 ekor diberi diet tinggi lemak selama 12 minggu, setelah didapatkan mencit dengan berat 35-40 gram, mencit ini tetap diberi diet tinggi lemak kembali tanpa intervensi selama 5 minggu, sebagai kelompok kontrol negatif.
3. Kelompok Ill: Mencit umur 5 minggu, sebanyak 5 ekor diberi diet tinggi lemak selama 12 minggu, setelah didapatkan mencit dengan berat 35-40 gram, diberi intervensi fish oil selama 8 minggu, sebagai kelompok intervensi fish oil.
4. Kelompok IV: Mencit umur 5 minggu, sebanyak 5 ekor diberi diet tinggi lemak selama 12 minggu, setelah didapatkan mencit dengan berat 35-40 gram, diberi intervensi kurkumin selama 6 minggu, sebagai kelompok intervensi kurkumin. Kelompok V:
5. Kelompok VI: Mencit umur 5 minggu, sebacyak 5 ekor diberi diet tinggi lemak setama 1 2 minggu, setelah didapatkan mencit dengan berat 35-40 gram, diberi intervensi metformin selama 8 minggu, sebagai kelompok kontrol positif.
Selama perlakuan dilakukan menimbangan pellet dan pembersihkan kandang setiap 3 hari. Pencatatan kenaikan berat badan mencit dilakukan setiap minggu.
Pada akhir masa perlakuan dilakukan pemeriksan TTGITTI kemudian mencit akan dikorbankan dengan menggunakan anestesi lokal intraperitoneum dengan bupivicaine (0.25%) dan jaringan lemak epididimis akan ditimbang lalu diambil untuk pemeriksaan adiponektin. TNFa. SRBP1c.
IV.6.2 Prosedur Pemeriksaan Tes Toleransi Glukosa
1 . Mencit dipuasakan selama 16 jam.
2. Berat masing-masing mencit diukur untuk menentukan dosis glukosa yang akan diberikan.
3. Setiap mencit diberikan dosis glukosa 2,5 mg/grBB.
4. Bubuk glukosa yang disiapkan diencerkan dengan konsentrasi 400 mg/ ml NaCL 0,9%.
5. Ukur glukosa darah sebelum penyuntikan glukosa menggunakan glukometer untuk mendapatkan nilai kadar glukosa 0 menit.
6. Darah diambil dari ekor mencit yang sebelumnya telah di anastesi lokal dengan bupivicaine (0.25%) untuk menekan nyeri akibat pemotongan ekor mencit.
7. Lakukan suntikan glukosa melalui intraperitoneum dengan dosis berat badan dalam gram dikalikan 1 0 ul yang diambil dari glukosa yang sudah diencerkan.
8. Glukosa darah kemudian diukur pada 30, 60,120 menit setelah penyuntikan glukosa.
IV.6.3 Prosedur Pemeriksaan Tes Toleransi Insulin
1. Mencit dipuasaka selama 4 jam.
2. Berat masing-masing mencit diukur untuk menentukan dosis insulin yang akan diberikan.
3. Penyuntikan insulin secara intraperitoneum dilakukan dengan dosis 0,75 U/kgbb.
4. Insulin disiapkan dengan melarutkan insulin 16,6 ul dari 1 0 mg/ml dalam 40 ml BPS untuk mendapatkan insulin 0,1 U/ml.
5. Ukur glukosa darah sebelum penyuntikan glukosa menggunakan glukometer untuk mendapatkan nilai kadar glukosa 0 menit.
6. Darah diambil dari ekor mencit yang sebelumnya telah di anastesi lokal dengan bupivicaine (0.25%) untuk menekan nyeri akibat pemotongan ekor mencit.
7. Lakukan penyuntikan insulin melalui intraperitoneum dengan dosis berat badan dalam gram dikalikan 7,5 ul dari 0,1 U/ml larutan insulin.
8. Glukosa darah kemudian diukur pada 30, 60,120 menit setelah penyuntikan insulin.
IV.6.4 Prosedur Pemeriksaan ELISA
IV.6.4.1 Mouse TNF a immunoassay dengan R & D system
* Kontrol: + 1 ml Dish steril Water kemudian homogenkan
* Standar: + 2 ml Calibrator diluents kemudian homogenkan, dan diamkan 5 menit.
yang sama untuk 5 tabung berikutnya. A B c 0 E F G H Keterangan: Str : standar Blk: blanko S : sampel Ctr : kontrol 1 2 3 4 5 Std1 Ctr S7 S15 S23 Std2 Blk sa S16 S24 Std3 S1 S9 S17 S25 Std4 S2 S10 S18 S26 Std5 S3 S11 S19 S27 Std6 S4 S12 S20 S28 Std7 S5 S13 S21 S29 Blk S6 S14 S22 S30 S 1-55: Normal diet S6-S11: High fat diet S12-S17: HFD+fish oil S18-S23: HFD+ kurkumin
S24-S28 : HFD+fish oil + kurkumin S29-S34 : HFD+ metformin. 6 S31 S32 S33 S34 Blk Blk Blk Blk
4. Masukkan 50 J..IL assay diluents di masing-masing well.
:$. Tambahkam 50 J..IL standar, kontrol dan sampel (seperti gambar
diatas)
* Tutup plate dan tepuk-tepuk/tap selama 1 menit untuk mencampur.
* lnkubasi plate selama 2 jam dalam suhu ruangan.
J. Cuci 5x dengan wash buffer pengenceran 25x (20ml+480 ml=300ml) dalam elisa washer.
*' Tambahkan 100 !JL conjugate disetiap well.
'* Tutup plate dan tap selama 1 menit.
1. lnkubasi selam 2 jam pada suhu ruangan.
• Cuci 5x dengan wash buffer 25x (300ml).
4 Tambahkan 1001JL larutan substrat di setiap well, tap selama 1 me nit.
Larutan substrat dibuat dengan mencampur color reagent A dan B dengan volume yang sama, dibuat 15 menit sebelum digunakan dan hindarkan dari cahaya.
� lnkubasi dalam suhu ruang, bebas cahaya selama 30 menit.
'* Tambahkan 1001JL stop solution disetiap well. Tap selama 1 menit.
� Baca dielisa reader pada 450 nm (.A-=540 atau 570 untuk koreksi
blank) dalam 10 me nit pertama.
IV.6.4.1 Mouse Adiponectin (Acrp30) Immunoassay dengan R & D
system
• Calibrator 1x, 20 ml calibrator diluents consentrate + 60 ml DW kemudian homogenkan.
• Preparasi sampel.
J. Pengenceran 1 OOx, 1 OIJL sam pel + 990 !JL calibrator
diluents(1x) kemudian vortex .
.._ Pengenceran 2000x, 1 O!JL sam pel + 190 IJL calibrator diluents (1X) kemudian vortex.
_. Pengenceran 8000x, 20 IJL + 60 IJL calibrator diluents (1x)
kemudian dilakukan vortex.
• Control, + 1 ml destilate water, kemudian homogenkan.
• Standar, + 5 ml calibrator diluents ( 1 x) kemudian homogenkan.
Kemudian buat pengenceran 200 !JI calibrator diluents dalam tabung eppendorf kemudian dilakukan vortex , dan selanjutnya pengenceran yang sama untuk 6 tabung berikutnya.
• Tutup dan tepuk-tepukltap plate selama 1 menit.
• lnkubasi selam 3 jam dalam suhu ruangan.
• Cuci 5x dengan wash buffer 25x ( 300 IJL/well)
20 ml wash buffer + 480 ml destilate water.
• Tambahakan 100 IJL conjugate disetiap well.
• Tutup dan tap selama 1 menit.
• lnkubasi selama 1 jam dalam suhu ruangan. • Cuci 5x dengan wash buffer 2 5x (3001JUwell).
• Tambahkan 100 IJL larutan substrat ke setiap well, tap selama 1
men it.
Larutan substrat dibuat dengan mencampur color reagent A dan B dengan volume yang sama, dibuat 1 5 menit sebelum digunakan dan hindarkan dari cahaya.
• lnkubasi dalam suhu ruang, bebas cahaya selama 30 menit.
• Tambahkan 1 OO!JL stop solution disetiap well. Tap selama 1 menit.
• Baca dielisa reader pada 450 nm (,\= 540 atau 570 untuk koreksi
blank) dalam 1 0 men it pertama.
N.6.5 Prosedur Pemeriksaan RT-PCR Ekstraksi RNeasy
1 . Jaringan lemak dan hati yang telah tersimpan pada ruang suhu -80°C, dikeluarkan, jaringan disiapkan dan ditimbang ± 30 mg. 2. Homogenkan jaringan dengan penambahan buffer RL T 600
!JUsampel. Campuran yang dipakai yaitu Buffer RL T 39.600 IJL ditambah l-mercaptoethanol 440 IJL menjadi 40 mL.
3. Hancurkan jaringan dengan alat sonycater selama 20-40 detik (dry ice).
4. Sentrifuge selama 3 menit dengan kecepatan > 13.000 rpm.
Pindahkan supernatant dengan menggunakan pipet dan masukkan ke eppendorf baru sebanyak 500 1Jl.
5. Tambahkan 500 IJL ethanol 70% , campur dengan menggunakan pipet dan jangan disentrifuge.
6. Pindahkan 500 IJL sam pel ke dalam spin column ukuran 2 ml, tutup
dan sentrifuge selama 15 detik dengan kecepatan > 13.000 rpm.
Buang cairan bagian bawah, ulangi sampai semua sampel habis.
7. Tambahkan 700 IJL buffer RW1, kemudian tutup dan sentrifuge selama 15 detik dengan kecepatan > 13.000 rpm. Buang cairan
bagian bawah.
8. Buat Buffer RPE + 44 m l ethanol 96-100%.
9. Tambahkan 500 JJL buffer RPE, kemudian tutup dan sentrifuge selama 1 5 detik dengan kecepatan > 1 3.000 rpm. Buang cairan bagian bawah.
10. Tambahkan 500 IJL buffer RPE, kemudian tutu p dan sentrifuge selama 2 menit dengan kecepatan > 13.000 rpm. Buang cairan
bagian bawah.
1 1 . Siapkan spin column yang baru, buang yang lama, kemudian tutup dan sentrifuge selama 1 menit dengan kecepatan > 13.000 rpm.
12. Siapkan eppendorf baru (free RNA) 1 , 5 mi. Tambahkan 30-50 JJL RNase free water. Tutup & sentrifuge selama 1 menit dengan kecepatan > 1 3.000 rpm.
QRT-PCR digunakan untuk menilai ekspresi SREBP-1c di hati,
F�lfa dan adiponektin di Jaringan lemak epididymis. RNA total c....ekstraksi dari jaringan lemak epididymal, hati, dan otot dengan -..enggunakan RNeasy kit (Qiagen) atau ISOGEN. Quantitative RT -PCR
: ... akukan dengan menggunakan SYBR Green QRT-PCR Master Mix, 1
5!ep sesuai protokol dari produsen (stratagene), yaitu mensintesa eDNA
diamplikasi pada Stratagene Mx3000P QPCR System (Stratagene, USA). Hasilnya dinormalisasi dengan internal kontrol (3-actin.
SREBP-1 c: forward primer:
ATCGGCGCGGAAGCTGTCGGGGTAGCGTC Reverse primer: TGAGCTGGAGCATGTCTTCAA, adiponectin forward primer: 5' GCCCAGTCATGCCGAAGA-3',
adiponectin reverse primer, 5'-TCTCCAGCCCCACACTGAAC-3' (product size: 332 bp); b-actin forward primer, 5'-ATGGATGACGATATCGCT-3', b actin reverse primer, 5' -ATGAGGT AGTCTGTCAGGT -3' (product size: 588 bp).
Tnfa forward, 5' -CCAGACCCTCACTAGATCA-3'; Tnfa reverse, 5' -CACTIGGTGGTTTGCTACGAC-3'
IV. 7 Cara Pengumpulan Data
Penelitian dilakukan pada sampel yang memenuhi kriteria hewan coba. Data diperoleh dengan cara primer. Data yang diperoleh diolah dengan meggunakan analisa statistik, SPSS 15. Untuk melihat perbandingan hasil terapi di antara keenam kelompok digunakan Uji ANOVA dengan batas kemaknaan p<O. 05.
•v.s ldentifikasi Variabel
a. Variabel bebas (lndependen): Kurkumin, Fish oil, Fish oil+kurkumin, metforrnin.
b. Variabel antara : Proses inflamasi pada obesitas.
c. Variabel tergantung (dependent): 8erat 8adan (88), TIG, TTl, dan Adiponektin, TNFa, SRBP1c, PPARa.
IV .9 Definisi Operasional
1 . Diet normal adatah diet yang mengandung 1 a % lemak, yang didatangkan dari Research Diet Amerika, seperti terlihat pada lampiran 1 .
2. Diet tinggi lemak adalah diet yang mengandung 45% lemak, yang didatangkan dari Research Diet Amerika, seperti terlihat pada tampiran 2.
3. Fish oil terdapat dalam Diet 45% temak, yang mengandung 3 gram Menhaden Oil dalam 100 gram diet, yang didatangkan dari
Research Diet Amerika, seperti terlihat pada lampiran 2.
4. Kurkumin adalah ekstrak kurkumin, dengan kode C7727 yang diproduksi ofeh Sigma ltd (Amerika), dicampukan ke dalam diet 45% lemak dan dibuat pellet.
5. Metformin, dibeli dalam bentuk tablet 500 mg di apotik setempat dengan menggunakan resep dokter dan dicampur ke dalam diet 45% lemak.
6. Mencit kontrol normal adalah mencit jantan, sehat galur C57BU6J, didatangkan langsung dari Animal Research Centre (Australia), umur 5 minggu yang diberi diet normal, komposisi pakan mengandung 10% lemak.
7. Mencit kontrol negatif ( mencit obes) adalah mencit jantan, sehat galur C57BU6J, didatangkan langsung dari Animal Research Centre (Australia), umur 5 minggu, yang telah diberi perlakuan diet tinggi lemak, komposisi pakan mengandung 45% lemak, selama 12 minggu sampai mendapatkan berat 35-40 gram dan tetap diberi diet 45% lemak sampai akhir percobaan.
8. Mencit perlakuan ( intervensi ) adalah mencit yang telah diberi diet tinggi lemak selama 3 bulan sampai berat didapatkan 35-40 gram. yang diberi diet 45% temak ditambah suplemen fish oil atau
lemak selama 3 bulan ditambah metformin yang dicampur ke dalam pellet yang dimakan selama 8 minggu.
10. Berat badan adalah nilai berat badan mencit yang di dapat dengan mengukur berat badan mencit setiap minggu selama penelitian berlangsung dengan menggunakan timbangan digital mencit dengan ketelitian 0,1 gram.
1 1 . Tes Toleransi Glukosa (TTG) adalah pemeriksaan untuk melihat sensitivitas insulin dengan cara mencit dipuasakan selama 16 jam kemudian larutan glukosa diinjeksi secara intraperitonium dengan dosis 2,5 gram/ kgbb. Kadar gula darah diukur dengan mengambil darah dari vena ekor pada menit 0, 30, 60, 120 dengan menggunakan glukometer.
12. Tes Toleransi Insulin (TTl) adalah pemeriksaan untuk melihat sensitivitas insulin dengan cara mencit dipuasakan selama 4 jam kemudian larutan insulin diinjeksi secara intraperitonium dengan dengan dosis 0,75 U/kgbb. Kadar gula darah diukur dengan mengambil darah dari vena ekor pada menit 0, 15, 30, 45, 60, 75, 90 dengan menggunakan glukometer.
13.Adiponektin adalah hermon yang didapatkan di jaringan serum plasma mencit dan jaringan adiposa epididimis setelah 8 minggu intervensi, diperiksa mengunakan teknik Elisa dan RT-PCR di Laboratorium Percobaan Hewan dan Unit Penelitian Fakultas Kedokteran UNHAS Makassar.
14. TN F-a adalah didapatkan di jaringan serum plasma mencit dan jaringan adiposa epididimis setelah 8 minggu intervensi, diperiksa mengunakan teknik Elisa dan RT -PCR di Laboratorium Penelitian Fakultas Kedokteran UNHAS Makassar.
Makassar
16. 1nsulin resisten adalah keadaan jika terjadi peningkatan kadar glukosa darah sesuai waktu pada 0, 30, 60, 90 dan 120 menit setalah penyuntikan glukosa intraperitoneum atau keadaan jika tidak terjadi penurunan kadar glukosa darah sesuai waktu pada 0, 15, 30, 45, 60, 75, 90 menit setelah penyuntikan insulin
intraperitoneum Jika dibanding kelompok kontrol normal.
17. lnsulin sensitivitas adalah keadaan jika terjadi penurunan kadar glukosa darah sesuai waktu pada 0,30,60,90 dan 120 menit setalah penyuntikan glukosa intraperitoneum atau keadaan jika terjadi penurunan kadar glukosa darah sesuai waktu pada 0, 15, 30, 45, 60, 75, 90 menit setelah penyuntikan insulin intraperitoneum jika dibanding kelompok kontrol normal.
18. P PARa adalah didapatkan di jaringan hati setelah 8 minggu intervensi, diperiksa mengunakan teknik RT-PCR di laboratorium Penelitian Fakultas Kedokteran UNHAS Makassar.
IV.10 Analisls Data Dan Uj i Statistik
Data yang dikumpul diolah menggunakan analisis statistik dengan "'ileOQQUnakan SPSS 15 .. Untuk melihat perbandingan hasil terapi di a.""!ara keenam kelompok digunakan Uji ANOVA dengan batas �knaan 5% (p<0,05).
IV .11 Alur Pene litian I N G G u 12 M I N 0 G u 8 M I N G G u
Mencitjantan, sehat, galur C57.BLI6J, umur
5minggu, BB: 15-20 gram, 30 ekor
!
Kondisi be bas pathogen,
. -·
�
adaptasi . - .
•
5 ekor, ukur BB, diet 25 ekor. Ukur BB, diet tinggi
normal (10% lemak) lemak ( 45% lemak)
Setelah mendapat bcrat mencit 35-40 gram ( mencit obes)
!
�
�
�
5 ekor 5 ekor, 5 ekor, 5 ekor, 5 ekor,
Intervensi
Kontrol Kontrol lntervensi Intervensi
normal perlaku Ekstrak Fish oil 3 g/100 g
Kurkuma 3 g/100 g diet
au Fish oil +
3glkg diet diet
3glkg diet
I
I
I
-Ukur komsumsi pellet tiap 3 hari Ukur BB setiap minggu, -Tes Toleransi Glukosa (ITG)
-Tes Toleransi Insulin (TTl) - Adiponektin, TNF-a serum
-Ekspresi TNF-a, Adiponectin lemak
intra-abdomen
- Eksoresi SREBPic di hati
+
5 ekor, intervensi metformi n 3glkg ..l
BAB V
HASIL DAN PEMBAHASAN V.1. HASIL
Penelitian ini dimulai pada pemeliharaan mencit yang berumur lima minggu dimana semua berat badan mencit rata-rata 19 gram, sebanyak 30 ekor mencit yang diteliti dibagi dalam 2 jenis diet yang masing-masing 5 ekor untuk diet normal (10% kalori dari lemak), dan 30 ekor diberi diet tinggi lemak (45% kalori dari lemak). Selama 12 minggu pemeliharaan telah didapatkan 2 kelompok mencit dengan berat badan yang signifikan berbeda antara kelompok diet normal dan kelompok diet tinggi lemak.
Sebanyak 35 ekor mencit CL57BU6J terlibat dalam penelitian ini, yang terbagi dalam 6 kelompok yaitu 5 ekor kelompok kontrol normal (Normal Diet,ND), 6 ekor kelompok kontrol negative (High Fat Diet,HFD), 6 ekor kelompok kontrol positif (High Fat Diet-Metformin. HFD-Met), 18 ekor kelompok intervensi yang masing-masing terdiri dari 6 ekor, yaitu kelompok intervensi fish oil (HFD-FO), kurkumin (HFD-Cur), dan gabungan fish oil dan kurkumin (HFD-FO-Cur). Pada keenam kelompok tersebut kemudian dilakukan analisis terhadap sejumlah variabel yang akan menjadi acuan dalam melakukan penilaian adanya pengaruh pemberian fish oil, kurkumin dan kombinasi keduanya terhadap mekanisme perbaikan resistensi insulin mencit obes.
Tabel l.Data berat badan mencit dan asupan.
l<ELOMPOK
HFD-
FO-Varia bel
ND HFD HFD-FO HFD-CUR CUR
Mean±SE Mean±SE Mean±SE Mean±SE Mean±SE
BB baseline(gr) 34.9±1.1 34.9±2.0
BBprel nterv(gr) 34.9±2.0
BBSelisihpre ...
post(gr) 13.0±1.0 12.4±1.0
Asupan Total (gr) 193.5±5.5 199.5±0.6 193.3±0.7 212.8±0.4 218.4±8.7 Asupan Total (kcal) 745.1±21.3 937.7±3.0 908.8±3.3 1000.2±2.1 1026-.6±41.0
Karakteristik Data dasar
Berat badan mencit awal ( data dasar ) tidak signifikan, BB mencit setelah memberikan diet tinggi lemak selama 12 minggu pada kelompok yang akan diintervensi didapatkan perbedaan BB yang signifikan antara kelompok NO dibanding HFD. Kelima kelompok HFD sebelum intervensi tidak didapatkan perbedaan BB yang bermakna.
Berat badan dibanding asupan setelah intervensi.
Setelah intervensi dilakukan uji statistik analisis multivariate (ANOVA) dengan SPSS 15 terhadap berat badan setiap kelompok, dan
didapatkan terdapat perbedaan berat badan yang signifikan antara keenam kelompok, kemudian analisis ini dilanjutkan dengan uji post hoc
HFD-MET Mean±SE 34.8±2.0 34.8±2.0 9.5±1.3 211.6±2.3 994.9±11.0
PERBANDINGAN SELISIH BERAT DANASUPAN 0 I ' I 200 +---...---=--i
:§
150 ...�
100 CQ so 0 • SelislhBBpre-post (gr) • Tot asupan (gr)Tabel 2. Pemeriksaan tes resistensi insulin.
. ,._ � '-ill - � KELOMPOK ,;,., -� -"o HFD-FO -Varia bel NO HFD HFD-FO HFD-CUR CUR
Mean±SE Mean±SE Mean±SE Mean±SE Mean±SE
m (gr/dl) 0 142.2±19.7 183±14.9 188.83±9.3 176.17±4.9 168±6.6 15 58.2±13.4 88.33±12.1 132.5±1 1.7 80.66±7.1 87.6±8.8 30 39:1:8.2 67.33±4.1 98±9.5 64.16:1:8.8 39:1:8.2 45 32±5.3 71.16±6.0 90.33:1:10.4 64.33±6.6 70±3.1 60 31.8±7.2 73.66±6.7 113.6:1:19.7 71.6±13.5 66.4±2.3 75 29.4±4.1 87.16±11.7 122±25.0 83.5±15.4 64.4±6.3 ·� HFD -MET Mean±SE 192±4.1 98.83±18.1 70.66:1:5.7 61,66±6.3 54.6±11.4 57±17.8
30 283.6±5.8 378.8±24.4 393±36.8 366.5±11.3 344.6±26.1
60 185.8±20.4 263.3±19.4 278.8±15.2 225.6±15.2 190.8±15.7
90 135.8±17.4 204.3±12.9 199.5±11.1 177.8±12.5 152±11.6
120 109±12. 5 164.5±12.1 179.6±9.1 154.5±6.4 133.4±11.2
Efek resistensi insulin setelah intervensi
A. Pada pemeriksaan Glucose Tolerance Test (GTT) didapatkan:
1 . GTT menit 0 atau Glukosa darah puasa selama 16 jam , terdapat perbedaan bermakna antara kelompok ND dibanding kelompok HFD dan HFD-FO, tapi pada kelompok NO dibanding kelompok HFD-Cur, HFD-FO-Cur dan HFO-met tidak didapatkan perbedaan yang bermakna.
2. GTT menit 30, didapatkan perbedaan bermakna antara kelompok NO dibanding kelompokHFD dan HFO-FO.
3. GTT menit 60, didapatkan perbedaan bermakna antara kelompok ND dibanding kelompok HFD dan HFO-FO. Oidapatkan perbedaan bermakna antara kelompok HFD dibanding kelompok NO dan HFO-FO-Cur.
4. GTT menit 90, didapatkan perbedaan bermakna antara NO dengan HFD dan HFD-FO.
5. GTT menit 1 20, didapatkan perbedaan bermakna antara NO dengan HFO, HFD-FO dan HFO-Cur. Perbedaan bermakna HFD hanya dengan ND, sedang antara HFD dan HFD-FO dan HFD Cur tidak didapatkan perbedaan bermakna.
308.3±18.1
216.1±10.0
174.1±10.8
GLUCOSE TOLERANCE TEST 360
�-I
I I 300 -+-NO :3' "0 -HFD � 5: 240 -.r-HFD-FO 0 u �HFO-CUR :I 'iii "0 0 ..._ HFD-FO-CUR 0 iii -"6-HFO-MET 180 120 60 0 30 60 90 120B. Pada pemeriksaan Insulin Tolerance Test (ITI) didapatkan:
1. ITI menit 0 atau glukosa darah puasa selama 4 jam berpuasa, didapatkan perbedaan bermakna antara kelompok NO dengan
HFO-Met.
2. ITI menit 15, didapatkan perbedaan bermakna antara NO dengan
bermakna. Perbedaan bermakna tidak lagi didapatkan antara NO dan HFO-Met seperti yang terjadi pada menit 0.
3. ITT menit 30, didapatkan perbedaan bermakna antara NO dengan HFO-FO.
4. ITT menit 45, didapatkan perbedaan bermakna antara ND dengan
kelompok lainnya, kecuali antara NO dengan HFO-met. Sedang untuk kelompok HFO didapatkan perbedaan bermakna hanya dengan kelompok NO, tidak didapatkan perbedaan bermakna dengan kelompok HFO lainnya.
s. ITT menit 60, didapatkan perbedaan bermakna antara kelompok
NO dan HFO-FO. Kelompok HFO-FO juga berbeda bermakna dengan kelompok H FO-Met. Kelompok HFO-FO tidak berbeda bermakna dengan kelompok HFO.
6. ITT menit 75, didapatkan perbedaan bermakna antara kelompok NO dan HFD-FO.
7. ITT menit 90, didapatkan perbedaan bermakna antara kelompok NO dan HFD-FO.
INSULIN TOLERANCE TEST 250 200
-]�
...,_NO ;:; ]9 150 -e-HFD Gl ,. "' 0 -, -HFD-FO u ::II Qo �HFD-CUR � 0 100 0 _.,_HFD-FO-CUR iii HFO-MET 50 0 0 15 30 45 60 75 90Ekspresi da n Kadar Adiponektin
Ekspresi mRNA adiponektin di jaringan lemak epididimis menurun secara signifikan pada semua kelompok mencit tinggi lemak (high fat diet, HFD) dibandingkan dengan normal diet (NO). Diet tinggi lemak dengan fish oil (HFD-FO), kurkumin (HFD-CUR), kombinasi fish oil dan kurkumin (HFD FO+CUR), dan metformin (HFD-MET) tidak dapat menaikkan ekspresi adiponektin akibat diet tinggi lemak. Namun kadar protein adiponektin serum hanya turun secara signifikan pada kelompok HFD metformin.
A Adiponektin mRNA 1.6 1.4 1.2 � .. .!!l e! 1 'iii Ill 0.8 .... Cl. l.! 11.1 0.6 0.4 0.2 ** 0
--NO HFD HFD-FO HFD-CUR HFD-FO+CUR HFD-MET B Adiponektin serum 14 -"E - 12 110 .:. E 10 2 Ill 8 "' c ll Gl 6 c 8. 4
�
.... 2 Ill -a Ill !Ill: 0NO HFD HFD-FO HFD-CUR HFD-FO+CUR HFD-MET
Grafik 1. A. Ekspresi adiponektin di jaringan lemak intraabdomen ( epididimis) pada mencit kelompok normal diet (ND), tinggi lemak (High fat diet) (HFD), tinggi lemak dengan fish oil (HFD-FO), tinggi lemak dengan kurkumin (HFD CUR), tinggi lemak dengan fish oil dan kurkumin (HFD-FO+CUR), dan tinggi lemak dengan metformin (HFD-MET).
B. Kadar adiponektin serum pada mencit kelompok normal diet (ND), tinggi lemak (High fat diet) (HFD), tinggi lemak dengan fish oil (HFD-FO), tinggi lemak dengan kurkumin (HFD-CUR), tinggi lemak dengan fish oil dan kurkumin (HFD-FO+CUR), dan tinggi lemak dengan metformin (HFD-MET).
kelompok normal diet {ND). dan sedikit menurun namun tidak signifikan pada kelompok Fish oil. Diet tinggi lemak dengan fish oil (HFD-FO), kurkumin {HFD-CUR), kombinasi fish oil dan kurkumin (HFD-FO+CUR), dan metformin {HFD-MET) cenderung menaikkan ekspresi TNFa.
Kecenderungan yang sama ditemukan pad a Radar TN Fa serum.
A TNFa mRNA 12 10 8 .... ·.;::; � Cll a:: ·v; 6 Cll ... Q. � w 4 2 0
•
___ ____,B TNFa serum 25 e Iii! .e 20 E 15 :I ... Cll "' 10 .... 10 z .... ... 10 "1:1 10 =-= 5 0
NO HFD HFO-FO HFD-cUR HFD-FO+CUR HFD-MET
Grafik 2. A. Ekspresi TNFa. lemak intraabdomen (epididimis) pada mencit kelompok normal diet (ND), tinggi lemak (High fat diet) (HFD), tinggi lemak dengan fish oil (HFD-FO), tinggi lemak dengan kurkumin (HFD-CUR), tinggi lemak dengan fish oil dan kurkumin (HFD-FO+CUR), dan tinggi lemak dengan metfonnin (HFD-MET).
B. Kadar adiponektin serum pada mencit kelompok normal diet (ND), tinggi lemak (High fat diet) (HFD), tinggi lemak dengan fish oil (HFD-FO), tinggi lemak dengan kurkumin (HFD-CUR). tinggi lemak dengan fish oil dan kurkumin (HFD-FO+CUR), dan tinggi lemak dengan metformin (HFD-MET).
(n == 5-6 mencit)
Ekspresi PPARa. di jaringan hati
Ekspresi PPARa. di jaringan hati menurun pada semua kelompok diet tinggi lemak (high fat diet, HFD) dibandingkan dengan ND. Fish oil meningkatkan ekspresi PPARa. demikian pula Metformin dengan efek yang lebih kuat dari Fish oil, namun curcumin dan kombinasi fish oil dan curcumin tidak menunjukkan kenaikan ekspresi PPARa. dibanding kontrol mencit HFD saja
PPARa mRNA
1.6 1.4 1.2 :t:: 1 "lG 'ii .. 'iii Cll .. 0.8 Q. "' � w 0.6 0.4 0.2 0NO HFD HFD-FO HFD-CUR HFD-FO+CUR HFD-MET
Grafik 3. Ekspresi PPARa dijaringan hati pada mencit kelompok normal diet
(ND}, tinggi lemak (High fat diet) (HFD), tinggi lemak dengan fish oil (HFD FO), tinggi lemak dengan kurkumin (HFD-CUR), tinggi lemak dengan fish oil
dan kurkumin (HFD-FO+CUR), dan tinggi lemak dengan metformin (HFD
MET). (n = 5-6 mencit. **p<O.Ol)
Eksp resi SREBP1 c di j aringan hati
Ekspresi SREBP1 c di jaringan hati menurun pada kelompok mencit dengan diet tinggi lemak dengan Fish oil (HFD-FO) dan kelompok diet
SREBP1c mRNA
4.5 4 c( z a::: 3.5 E 3 c 13 2.5 ftl cQ 2 � � 1.5 Cl. CIQ w 1 a::: Ill 0.5 0NO HFD HFD-FO HFD-CUR HFD-FO+CUR HFD-MET Grafik 4. Ekspresi SRBPlc dijaringan hatl pada mencit kelompok nonnal diet (ND), tinggi lemak (High fat diet) (HFD), tinggi lemak dengan fish oil (HFD FO), tinggi lemak dengan kurkumln (HFD-CUR), tinggi lemak dengan fish oil
dan kurkumin (HFD-FO+CUR), dan tinggi lemak dengan metfonnin (HFD
MET). (n = 5-6 mencit. **p<O.Ol)
V. 1 PEMBAHASAN
Pada penelitian ini mencit dengan diet tinggi lemak (45% kalori dari lemak) secara signifikan memiliki berat badan yang lebih tinggi dari pada mencit dengan normal diet (10% kalori dari lemak). Meskipun kurkumin dilaporkan menurunkan berat badan (Weisberg dkk, 2008) namun pada penelitian ini tidak ada perbedaan bermakna dengan mencit diet tinggi lemak (HFD). Pada penelitian Weisberg dkk tersebut, mereka menggunakan dosis 60 kali lebih tinggi. Penelitian lain oleh Ejaz dkk dengan dosis yang sama pada penelitian ini menemukan berat badan lebih rendah pada kelompok kurkumin namun pemberian kurkumin dilakukan bersamaan dengan mulai pemberian diet tinggi lemak dan sebelum mencit menjadi gemuk. Hasil ini membuktikan bahwa diperlukan dosis yang jauh lebih tinggi untuk menurunkan berat badan jika sudah terjadi kegemukan. Namun dosis ini sangat tinggi bila diterapkan pada manusia (sekitar 400 tablet kurkuma biasa/hari). Dosis yang lebih rendah
seperti yang digunakan pada penelitian ini dan yang sering dikonsumsi oleh manusia mungkin akan memberikan efek positif jika dikonsumsi dalam jangka panjang.
Pada tes toleransi glukosa dan toleransi insulin diet tinggi lemak juga menyebabkan kadar gula darah yang lebih tinggi pada kelompok mencit tinggi lemak dibandingkan dengan mencit dengan diet normal. Dibandingkan dengan kontrol mencit dengan diet tinggi lemak saja, diet tinggi lemak dengan fish oil justru memiliki kadar gula darah yang cenderung lebih tinggi bahkan dengan diet tinggi lemak kelompok lainnya. Hal ini sejalan dengan laporan sebelumnya bahwa diet fish oil dapat mengganggu toleransi glukosa dan cenderung meningkatkan kadar gula darah (mostad dkk, 2008) meskipun laporan lainnya menyebutkan tidak ada peningkatan gula darah dengan diet fish oil (Galgani dkk, 2008). Kami menemukan tidak ada efek perbaikan pada kelompok mencit dengan diet tinggi lemak dan kurkumin meskipun memiliki kadar gula darah yang sedikit lebih rendah namun tidak signifikan. Kombinasi fish oil dan kurkumin menurunkan kadar gula pada tes toleransi glukosa yang
konsisten dan signifikan pada menit ke-60 dan lebih rendah dibanding kontrol positif metformin sampai menit ke-90. Perbaikan toleransi glukosa ini berhubungan dengan rendahnya ekspresi TNFa pada jaringan lemak intraabdominal pada kelompok ini. Tumor necrosis faktor alpha telah dilaporkan meningkat ekspresinya pada jaringan lemak intraabdomen mencit dan pasien obesitas dan berhubungan dengan resistensi insulin (Hotamisligil dkk, 1993; Khan dkk, 2000). Tingginya ekspresi TNFa. di jaringan lemak menyebabkan resistensi insulin pada jaringan ini dan terjadinya lipolisis dan peningkatan lemak di hati dan jaringan otot. lnflamasi di hati selanjutnya akan menyebabkan resistensi insulin di hati sehingga pembentukan lemak di hati semakin meningkat karena insulin berfungsi mencegah lipogenesis di hati.
Adiponektin merupakan hormon yang disekresi oleh set lemak yang berfungsi meningkatkan efek insulin. Ekspresi adiponektin menurun pada
semua kelompok mencit dengan diet tinggi lemak, hal ini merupakan sebagian penyebab resistensi insulin pada mencit gemuk ini dan tingginya gula darah dibandingkan mencit dengan diet normal.
PPARa merupakan faktor transkripsi yang terutama terdapat di hati dan otot. Faktor transkripsi ini berperan pada oksidasi lemak sehingga menurunkan perlemakan hati dan penimbunan lemak di sel otot yang mengganggu efek insulin sehingga meningkatkan sensitivitas insulin. Ekspresi PPARa menurun pada semua mencit dengan diet tinggi lemak dan meningkat pada kelompok mencit dengan fish oil dan terutama pada kelompok kontrol positif, metformin.
Ekspresi SREBP1 c di hati sebagai faktor transkripsi gen pembentuk enzim untuk lipogenesis pada penelitian ini memperlihatkan pola yang kurang konsisten. Ekspresi SREBP1c hanya menurun pada kelompok mencit dengan fish oil, kurkumin dan metformin yang menunjukkan hambatan per1emakan.
BAB VI KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan pada 30 subyek penelitian untuk mengetahui adanya pengaruh pemberian fish oil, kurkumin dan kombinasi keduanya terhadap mekanisme perbaikan resistensi insulin mencit obes, maka dapat disimpulkan :
1 . Terdapat kenaikan berat badan bermakna pada kelompok mencit dengan diet tinggi lemak (45% kalori dari lemak) dibandingkan dengan normal diet (10% kaslori dasri lemak)
2. Diet Fish oil, kurkumin, kombinasi fish oil+kurkumin dan metformin pada penelitian tidak menurunkan berat badan secara berrnakna
meskipun metformin memperlihatkan berat badan yang cenderung lebih rendah.
3. Diet tinggi lemak menyebabkan gangguan toleran·si glukosa dan resistensi insulin relatif yang ditandai dengan tingginya gula darah pada semua kelompok mencit dengan diet tinggi lemak dibanding diet normal
4. Diet fish oil cenderung memiliki toleransi glukosa dan insulin yang lebih buruk dibanding kelompok mencit diet tinggi lemak
5. Diet kurkumin, Kombinasi fish oil dan kurkumin dan metformin cenderung memperbaiki toleransi glukosa dan insulin
6. Gangguan toleransi glukosa dan insulin pada semua kelom ok mencit dengan diet tinggi lemak dibanding normal di
�
gkin berhubungan dengan tingginya ekspresi TNFa pada jaringan lemak dan rendahnya ekspresi PPARa pada jaringan hati7. Perbaikan toleransi glukosa dan insulin pada kelompok Diet kurkumin, Kombinasi fish oil dan kurkumin dan melform
�
berhubungan dengan rendahnya ekspresi TNFa pada jaringanlemak, rendahnya ekspresi SREBP1 c dan tingginya ekspresi
DAFT AR PUSTAKA
Aggatwal BB, Kumar A, Burr AC. Anticancer potential of curcumin: preclinical and clinical studies. Anticancer Res. 2003;23:363-398. Berg AH, Combs TP, Scherer PE. ACRP30/adiponectin: an adipokine
regulating glucose and lipid metabolism. Trends Endocrinol Metab. 2002; 1 3:84-89.
Bouskila M, Pajvani UB and Scherer PE. Adiponectin: a relevant player in PPARy agonist mediated improvements in hepatic insulin sensitivity? lnt J Obesity 2005; 29:S17-S23
Bray GA. Medical Consequences of Obesity. J Cl in Endocrinol Metab. 2004;89:2583-2589.
Chan NN, Kong AP, Chan. JC, et al. Metabolic Syndrome and Type 2 Diabetes: The Hong Kong Perspective. Clin Biochem Rev. 2005;26:51-57.
Chandran M, Phillips SA, Ciaraldi T, et al. Adiponectin: More Than Just Another Fat Cell Hormone? Diabetes Care. 2003;26:2442-2450. Dyck DJ, Heigenhauser GJF, Bruce CR. The role .of adipokines as
regulators of skeletal muscle fatty acid metabolism and insulin sensitivity. Acta Physiol. 2006; 186:5-16.
Duda MK, 0. K.. Dietary supplementation with {omega}-3 PUFA increases adiponectin and attenuates ventricular remodeling and dysfunction with pressure overload. Cardiovascular Research, 2007;303-310. Ejaz A, Wu D, Kwan P,Curcumin Inhibits Adipogenesis in 3T3-L 1
Adipocytes and Angiogenesis and Obesity in C57 /BL Mice. Journal of Nutrition. 2009;139:91 9-925.
Fernandez-Real J-M, Castro A, Vazquez G. Adiponectin is associated with vascular function independent of insulin sensitivity. Diabetes Care. 2004;27:739-745.
Friedberg C, Janssen M, Heine R, Grobbee D. Fish oil and glycemic control in diabetes. A metaanalysis. Diabetes Care 1998;21 :494 -500.
Fruhbeck G, Gomez-Ambrosi J, Muruzabal FJ, et al. The adipocyte: a model for integration of endocrine and metabolic signaling in energy metabolism regulation. Am J Physiol Endocririol Metab.
2001 ; 280(6): E827 -84 7.
Fujiwara H, Hosokawa M, Zhou X, et al. Curcumin inhibits glucose
production in isolated mice hepatocytes. Diabetes Research and
Clinical Practice 2008;80:185-191.
Galgani JE, Uauy RD, Aguirre CA, Diaz EO. Effect of the dietary fat quality on insulin sensitivity. Br J Nutr. 2008;1 00:471-9.
Gotera W, Aryana S, Suastika K, et al. Hubungan antara obesitas sentral dengan adiponektin pada pasien geriatri dengan penyakit jantung koroner. J Peny Dalam. 2006;7:102-107.
Green A, Talhapak S, Basile R, et al. Curcumin is a Direct Inhibitor of Glucose Transport in Adipocytes. Cooperstown, NY: From the Bassett Research Institute.
Hotamisligil GS, Shargill NS, Spiegelman BM: Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science 259:87-91 , 1993
Hotta K, F. T. Plasma concentrations of a novel, adipose-specific protein, adiponectin, in type 2 diabetic patients. Arteriosc/er Thromb Vase Bioi , 2000 ; 1595-1599.
lkonomov OC, Sbrissa D, Mlak K, et al. Requirement for PI Kfyve enzymatic activity in acute and long-term insulin cellular effects. Endocrinology. 2002;143:4742-4754.
ltokawa H, Hirayama F, Funakoshi K, et al. Studies on the antitumor bisabolane sesquiterpenoids isolated from Curcuma xanthorrhiza. Chern Pharm Bull. 1985;33:3488-3492.
Kahn BB, Flier JS: Obesity and insulin resistance. J Clin Invest 106:473-481, 2000
Kelley D, Mandarino L, . Fuel selection in human skeletal muscle in insulin resistance: a reexamination. Diabetes Care. 2000;49:677-683. Kim HJI T. M. Fish oil feeding decreases mature sterol regulatory element
binding protein 1 (SREBP-1) by down-regulation of SREBP-1c mRNA in mouse liver. A possible mechanism for down-regulation of lipogenic enzyme mRNAs. Kim HJ, Takahashi M, Ezaki 0. Fish oil feeding decreases mature sterol regulatory element-binding protein
1 (SREBP-1) by d J Bioi Chern. 1999 I 25892-8.
Kliewer SA, Fatty acids and eicosanoids regulate gene expression through direct interactions with peroxisome proliferator-activated receptors a and y. Proc Nat/ Acad Sci , 1 997;4318-4323.
Lee YH1 Pratley RE. The evolving role of inflammation in obesity and the metabolic syndrome. Current diabetes reports. 2005;5(1):70-75. Leu TH, Man MC. The molecular mechanisms for the antitumorigenic
effect of curcumin. Curr Med Chern Anticancer Agents. 2002;2:357-370.
Mahesh Tl B. M.Effect of photo-irradiated curcumin treatment against oxidative stress in streptozotocin-induced diabetic rats. J Med. Food
1 2005; 251-255.
Matsuzawa Y1Funahashi T,Nakamura T. Adiponectin and metabolic syndrome. Arterioscler Thromb Vase Bioi. 2004;24:29-33.
Milobedzka Jl K. S. Curcumin. Chern Ber I 191; 2163-2170.
Mostad IL, Bjerve KS, Lydersen S, Grill V. Effects of marine n-3 fatty acid supplementation on lipoprotein subclasses measured by nuclear magnetic resonance in subjects with type II diabetes. Eur J Clin Nutr. 2008;62:419-29.
Mototsugu Takashima, W. 0 . . Regulation of SREBP1c Expression by
mTOR Signaling in Hepatocytes. Kobe J. Med. Sci , 2009; E45-E52.
Murling Ml Mensink RP, Pijl H, Romijin JA, Havekes LMI Voshol VJ. A Fish Oil Does not Reverse Insulin Resistance Despite Decrease Adipose
