48
PENGARUH MEDIA TERHADAP DAYA TUMBUH EMBRIO
SOMATIK JERUK IN VITRO
Nirmala Friyanti Devy1*, Farida Yulianti1 dan Hardiyanto2 1
Balai Penelitian Tanaman Jeruk dan Buah Subtropika Jl. Raya Tlekung No. 1, Junrejo, Batu, Jawa Timur 65301
2
BPTP Sumatera Barat
Jl. Raya Padang – Solok, KM. 40, Sukarami, Kab. Solok, Sumbar 25001 *e-mail : nfdevy@gmail.com
ABSTRACT
Citrus callus can be produced from nuselus tissue of Siam Kintamani (Citrus nobilis L.), it derived from 14 weeks after anthesis of young seeds that cultured on callus initiation medium Murashige and Skoog's (MS). At a later stage, those callus were used as the plant propagation material. This reseach was conducted at Tlekung Research Station, Indonesian Citrus and Subtropical Fruit Research Institute (ICiSFRI) from January 2011 to December 2013. The objective of this study is to obtain an optimal medium composition for the growth of the embryos and citrus plantlets of Siam Kintamani on propagation via somatic embryogenesis technology (SE). To obtain embryos and plantlets, callus cultured on three types of media composition comprising MS basal media plus malt extract (ME), Benzyl adenine (BA) and carbohydrates (derived from sucrose, sorbitol and galactose). The results showed that highest weight of globular embryos during the three-month cultured was on M3 medium (MS + ME + sucrose) with a 390% increase in weight compared with the control / M1 (MS + sucrose). However, in the next step of the development, percentage of cotiledonary embryos were formed highest in M2 medium (MS + ME + sorbitol + galactose + BA) (90%). In the phase of development of the plantlets, M3 media composition was the most optimal medium for germination and rooting plantlets. It can be concluded, that at every phase of growth in SE, it required propagation media with different compositions.
Keywords : Somatik embryogenesis, embryo, plantlet, media, Siam Kintamani citrus
ABSTRAK
Kalus dapat diproduksi dari jaringan nuselus jeruk Siam Kintamani (Citrus nobilis L.) yang berasal dari biji buah muda umur 14 minggu setelah bunga mekar dan dikulturkan pada media inisiasi kalus Murashige and Skoog´s (MS). Pada tahap selanjutnya, kalus-kalus ini digunakan sebagai bahan perbanyakan tanaman. Penelitian pengaruh media terhadap daya tumbuh embrio somatik in vitro dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan Balai Penelitian Jeruk dan Buah Subtropika (Balitjestro) sejak tahun Januari 2011 sampai Desember 2013. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan suatu komposisi media yang optimal bagi pertumbuhan embrio serta planlet jeruk Siam Kintamani pada perbanyakan melalui teknologi somatik embryogenesis (SE). Untuk mendapatkan embrio serta planlet, kalus dikulturkan pada tiga macam komposisi media yang terdiri dari media basal MS ditambah malt ekstrak (ME), Benzyl Adenin (BA) dan karbohidrat (yang didapat dari sucrose, sorbitol dan galaktose). Hasil penelitian menunjukkan bahwa pertambahan berat embrio globular yang dihasilkan selama tiga bulan tertinggi pada media M3 (MS+ME+sukrose) dengan kenaikan berat 390 % dibandingkan kontrol/M1 (MS+sukrose). Namun pada perkembangan selanjutnja, embrio kotiledonary terbentuk pada media M2 (MS+ME+sorbitol+galaktose+BA) mencapai 90%, lebih tinggi dibandingkan dengan lainnya. Pada fase perkembangan planlet, komposisi media M3 merupakan media paling optimal bagi pertunasan dan perakarannya. Dari penelitian ini dapat disimpulkan, bahwa setiap fase pertumbuhan pada perbanyakan SE diperlukan media dengan komposisi yang berlainan. Dengan mendapatkan media yang optimal pada setiap fase pertumbuhan, diharapkan perbanyakan jeruk melalui teknologi SE akan menghasilkan produk tanaman secara masal dalam waktu yang relatif lebih singkat.
Kata kunci : Somatik embryogenesis, embrio, planlet, media, jeruk Siam Kintamani
PENDAHULUAN
Pertumbuhan dan morpogenesis optimal dari jaringan tanaman berbeda tergantung jenisnya, perbedaan ini akan sangat tergantung kepada kebutuhan nutrisi pada setiap bagian yang dikulturkan (Saad dan Elshahed, 2012). Pada perbanyakan tanaman jeruk melalui teknologi embrio somatik in
vitro, komposisi nutrisi yang dibutuhkan pada setiap tahapannya juga berbeda. Secara praktikal,
embryogenesis somatik dimulai dengan tahapan kultur eksplan bagian vegetative tanaman seperti daun, akar, bunga dari tanaman induknya. Setelah melalui prosedur sterilisasi, bagian tersebut
49
ditanam pada medium yang berbeda-beda untuk induksi kalus, perbanyakan kalus, induksi kalus embrogenik dan diferensiasi serta regenerasi (Gavish et al., 1992; Singh et al., 2006; Niedz et al, 2002; Mendes-da-Gloria et al., 1999; Tomaz et al., 2001; Han et al, 2002).
Pada tanaman jeruk, kalus embrionik jeruk secara umum dapat diperoleh dari berbagai sumber eksplan, namun dari berbagai penelitian yang banyak digunakan adalah jaringan nuselus atau ovul. Kalus-kalus yang tumbuh banyak digunakan pada kegiatan hibridisasi serta penelitian transformasi genetik. Dari penelitian-penelitian tersebut, tahapan embriogenesis merupakan tahapan kunci pada regenerasi tanaman yang berasal dari kalus. Embryogenesis somatik untuk membentuk embrio somatik terjadi ketika sel-sel baru terbentuk dari eksplan, badan-badan globular, heart, torpedo dan kotiledon hingga plantlet dibentuk pada fase tumbuh kalus embriogenik, diferensiasi, dan regenerasi.
Walaupun SE ini secara umum mudah ditemui pada varietas-varietas jeruk yang bersifat poliembrioni, pada prosesnya banyak faktor yang berpengaruh. Media kultur adalah factor utama yang berpengaruh terhadap keberhasilan regenerasi eksplan. Diantara komponennya, karbohidrat adalah komponen utama pada proses metabolisme karbon, dimana jenis maupun konsentarasinya memainkan peran yang sangat penting; sumber karbohidrat untuk media kultur yang umum digunakan adalah sucrose atau glucose. Menurut Cunha dan Fernandes-Ferreira (2010), monosakarida dan disakarida mempengaruhi performan pada efisiensi embryogenesis dan multiplikasi kalus. Pada konsentrasi rendah (1 dan 2%) disakarida lebih efektif dibandingkan monosakarida pada induksi somatic embryogenesis. Hal ini akan sama dicapai bila menggunakan monosakarida dengan konsentrasi 4%. Kenaikan konsentrasi dari disakarida, tidak meningkatkan proses tersebut secara nyata.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan suatu komposisi media yang optimal bagi pertumbuhan embrio serta planlet jeruk Siam Kintamani pada perbanyakan melalui teknologi somatik embryogenesis (SE).
BAHAN DAN METODE
Penelitian dilakukan pada Lab Kultur Jaringan Balai Penelitian Tanaman Jeruk dan Buah Subtropika (Balitjestro) pada bulan Januari 2011 s/d April 2013. Kegiatan penelitian terdiri dari beberapa tahap, yaitu inisiasi kalus, inisiasi embrio somatic, pertumbuhan dan perkembangan planlet secara in vitro serta penyambungan planlet pada batang bawah secara ex vitro. Kegiatan in vitro dilaksanakan di Laminar Air Flow Cabinat (LAFC) Laboratorium Kultur Jaringan, sedangkan kegiatan penyambungan dilakukan di screen house.
Inisiasi kalus :
Eksplan yang digunakan sebagai sumber kalus adalah jaringan nuselus yang berasal dari biji buah jeruk muda yang masih berumur ± 14 minggu setelah bunga mekar yang telah berkembang sempurna. Dalam LAFC biji dikeluarkan dari daging buah yang telah disterilkan dengan menggunakan hypoklorit 15 dan 10 % masing-masing selama 25 menit. Dibawah mikroskop dengan pembesaran 40 kali, calon embrio yang ada dibuang dan jaringan nuselusnya diambil untuk dikulturkan pada media inisiasi kalus (MS standar + 0.7% bacto agar + 3% sukrose), dimana setiap botol yang berisi media 25 cc terdapat 10 jaringan nuselus. Jaringan nuselus akan tumbuh pada kisaran antara 15-45 hari setelah tanam (Devy, 1997). Pertumbuhan nuselus ditandai dengan kalus yang tumbuh dan berkembang pada lapisan permukaan atas dari jaringan. Kalus ini akan digunakan sebagai bahan kegiatan/tahap penelitian berikutnya.
Inisiasi embrio somatik serta perkecambahan embrio :
Kalus yang tumbuh diperbanyak pada media MS +146 mM Sucrose + 3 ppm BA+ 7 g agar, kalus yang tumbuh di sub kulturkan setiap 4 minggu sampai berumur 16 minggu (Devy et al, 2011). Kalus yang tumbuh baik dikulturkan pada media padat perlakuan, yaitu
1. M1 : MS + 500 mg ME L-1 + 146 mM (Sorbitol:Galaktose = 65%:35%) + 3 ppm BA 2. M2 : MS + 146 mM sucrose + 2 X FeEDTA
3. M3 : MS+500 mg ME L-1 + 146 mM sucrose
Pada tahap berikutnya, embrio yang telah terbentuk di sub kulturkan pada media yang sama untuk digunakan sebagai media perkecambahan.
50 Pengamatan :
1. Pertambahan berat kalus (pk) : kalus segar ditimbang pada setiap perlakuan per sub kultur atau setiap 2 minggu sekali, pengamatan dilakukan pada sub kultur I sampai dengan VI. Untuk mendapatkan pertambahan berat kalus pada setiap sub kulturnya, dihitung dengan cara mengurangi berat saat diamati (Sx) dengan berat sub kultur yang lalu (Sx-1) (pk = Sx-Sx-1)
2. Persen embrio yang terbentuk dihitung dengan mengamati 1 mg sampel kalus embrio di bawah mikroskop, dihtung jumlah embrio pada fase kotiledonary yang tumbuh
3. Analisa histology : embrio pada fase kotiledonary dibuat preparat untuk mengamati histologinya dengan metode embedding, yaitu specimen difiksasi dengan FAA selama 24 jam agar mengurangi perubahan-perubahan. Kemudian dicusi dengan alcohol 70% selama 1 jam. Pewarnaan dilakukan dengan safranin (dalam alcohol 70%) selama 24 jam. Selanjutnya specimen dicuci kemudian didehidrasi dengan alcohol seri (70%, 80%, 95%, 100% I, 100% II) masing-masing selama 1 jam untuk menghilangkan air. Perlakuan dealkoholisasi untuk menghilangkan alcohol dengan menggunakan alcohol/xilol (3:1, 1:1, 1:3) masing-masing 1 jam, selanjutnya xilol I, xilol II masing-masing 1 jam. Kemudian dimasukkan dalam paraffin-xilo (9:1) (57oC selama 24 jam). Selanjutnya dilakukan infiltrasi supaya paraffin dapat masuk diantara sel-sel; campuran ini dibuang dan diganti dengan paraffin murni selama 24 jam pada suhu 57oC.
4. Data yang terkumpul dianalisis dengan sidik ragam pada Rancangan Acak Lengkap, dengan 3 ulangan. Bagi parameter yang dipengaruhi secara nyata oleh perlakuan dilanjutkan dengan Uji Jarak Berganda Duncan pada taraf 5%.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Komposisi media yang digunakan pada penelitian ini merupakan komposisi yang telah digunakan pada beberapa penelitian sebelumnya. Dari penelitian Devy dan Sutanto (1997), kalus tumbuh dengan baik dari jaringan nuselus jeruk pada media inisiasi MS+146 mM succ+2X FeEDTA dan kultur kalus MS+500 mg ME L-1+146 mM succr. Pada penelitian pengaruh sumber karbohidrat terhadap pertumbuhan volume kalus didapat bahwa media MS+500 mg ME L-1+146 mM Sucrose + 3 ppm BA dan MS + 500 mg ME L-1 + 146 mM (Sorbitol:Galaktose = 65%:35%) + 3 ppm BA merupakan media yang optimal untuk pertumbuhan volume kalus Siam Kintamani (Devy et al, 2011).
Pertambahan berat kalus embrionik
Dari hasil analisa statistik didapat bahwa pertambahan berat kalus embrionik tertinggi pada perlakuan M3 (MS+500 ppm ME+146 mM sucrose), pertambahan berat per bulan maupun total selama tiga bulan berbeda nyata dengan kedua perlakuan lainnya (Tabel 1; Gambar 1).
Tabel 1. Kenaikan berat per 1000 mg kalus embrionik pada umur 1, 2 dan 3 bulan setelah kultur
Perlakuan**) Kenaikan berat per 1000 mg embrio pada bulan ke
1 2 3 1. M1 2. M2 3. M3 67.6 ab 32.3 b 74.8 a 27.4 b 13.4 c 40.7 a 26.7 b*) 6.6 c 96.6 a CV (%) 28.2 16.3 15.1 *)
angka rerata yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada uji Duncan 5%
**)
M1 : MS + 500 mg ME L-1 + 146 mM (Sorbitol:Galaktose = 65%:35%) + 3 ppm BA
M2 : MS + 146 mM sucrose + 2 X FeEDTA
M3 : MS+500 mg ME L-1 + 146 mM succrose
Menurut Molnar et al. (2011), ME merupakan suatu bahan organic tambahan pada media yang berperan secara spesifik pada kultur jeruk. Merupakan sumber karbohidrat yang dapat menginisiasi proses terjadinya embryogenesis pada eksplan nuselus. Bahan-bahan lain yang teridentifikasi pada ME adalah auxin dan gibberellins. Selain pada kultur jeruk, ME dengan konsentrasi rendah juga berpengaruh positif pada inisiasi dan multiplikasi shoot kultur stevia bila medianya mengandung BAP, Kinetin dan NAA (Sridhar dan Aswath, 2014).
51
Gambar 1. Berat total kalus pada 1-3 bulan setelah kultur
M1 : MS + 500 mg ME L-1 + 146 mM (Sorbitol:Galaktose = 65%:35%) + 3 ppm BA M2 : MS + 146 mM sucrose + 2 X FeEDTA
M3 : MS+500 mg ME L-1 + 146 mM succrose
Menurut Tomaz et al. (2001), tingginya pertambahan kalus ini juga disebabkan daya multiplikasi yang tinggi eksplan pada media yang mengandung sucrose dengan kadar yang optimal. Tingginya pertambahan berat kalus pada perlakuan MI diduga disebabkan media tersebut optimal untuk multiplikasi kalus. Menurut Cunha dan Fernandes-Ferreira (2010), sucrose (disakarida) konsentrasi rendah (1 dan 2%) lebih efektif dibandingkan monosakarida pada induksi somatic embryogenesis. Sehingga pada konsentrasi 146 mM (5%) media tersebut cenderung mendorong terjadinya multiplikasi kalus dibandingkan induksi embrio.
Persen embrio yang terbentuk
Kalus embrionik yang tumbuh bila dikulturkan pada media yang sesuai akan mendorong terjadinya pembentukan embrio (Gambar 2a). Dari analisa histology, terlihat bahwa embrio yang terbentuk sudah dalam fase kotiledonary, dimana calon daun, batang dan akar sudah mulai terbentuk (Gambar 2b).
(a) (b)
Gambar 2. Embrio kotiledonary (a) dan histology embrio yang berkembang dari kalus embrionik (b)
Dari tiga perlakuan media, persen embrio kotiledonary tertinggi terdapat pada perlakuan media M2 (MS + 146 mM sucrose + 2 x FeEDTA) (Gambar 2).
0 50 100 150 200 250 1 2 3 berat kalus (mg) bulan M1 M2 M3
52
Gambar 2. Persen embrio yang terbentuk pada 1-3 bulan setelah kultur
M1 : MS + 500 mg ME L-1 + 146 mM (Sorbitol:Galaktose = 65%:35%) + 3 ppm BA
M2 : MS + 146 mM sucrose + 2 X FeEDTA
M3 : MS+500 mg ME L-1 + 146 mM succrose
Menurut Miah et al. (2002) pada kultur nuselus jeruk Sat Kara (Citrus macroptera) embrio berkembang dan bertunas/berakar dengan baik pada media tanpa penambahan hormone tumbuh. Perkecambahan embrio
Embrio kotiledonary akan berkembang menjadi planlet (tanaman kecil) dengan menumbuhkan daun, batang dan akarnya (Gambar 3). Perkecambahan ini akan terjadi bila lingkungan (media dan lainnya) optimal bagi perkembangannya.
Gambar 3. Planlet yang tumbuh dari embrio
Embrio jeruk Siam Kintamani yang disemaikan di tiga macam media, persen planlet yang bertunas pada umur 1 dan 2 bulan setelah kultur tertinggi pada media M3 (MS+500 mg ME L-1 + 146 mM sucrose), yaitu masing-masing mencapai 64 dan 67,8%, walupun tidak berbeda nyata dengan perlakuan media M1 (MS + 500 mg ME L-1 + 146 mM (Sorbitol:Galaktose = 65%:35%) + 3 ppm BA) (Gambar 4 dan 5).
Gambar 4. Persen planlet bertunas
0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 1 2 3 90.0 20.0 30.0 em b ri o y an g terb en tu k (% ) umur kultur (bl) M2 M1 (Kontrol) M3 64.0 67.8 54.8 61.1 37.6 37.6 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 1 2
% planlet bertunas umur planlet (bulan)
M3 M1 (Kontrol) M2 a cv=16.7% b a b ab a cv=12.3%
53
Gambar 5. Persen planlet berakar
Menurut Wagner dan Kafka (1995) respon eksplan embrio Fraxinus excelsior sangat tergantung pada kondisi morfologi dan fisiologi dari embrio itu sendiri. Secara umum, embrio pada setiap tahapan perkembangannya akan berkecambah lebih baik apabila medianya kaya akan nutrisi. Pada media perkecambahan embrio, hara makro dan mikro serta karbohidrat sangat penting perannya dibandingkan dengan substansi lainnya. Sumber karbohidrat selain sucrose, seperti glycerol, sorbitol, manitol, lactose, glucose dan galactose juga berpengaruh terhadap daya multiplikasi maupun berkecambahnya embrio (Bellettrea et al., 2011; Kayim dan Koc, 2006).
KESIMPULAN
Hasil penelitian menunjukkan bahwa pertambahan berat embrio globular yang dihasilkan selama tiga bulan tertinggi pada media M3 (MS+500 mg ME L-1 + 146 mM succrose) dengan kenaikan berat 390 % dibandingkan kontrol/M1 (MS + 500 mg ME L-1 + 146 mM (Sorbitol:Galaktose = 65%:35%) + 3 ppm BA). Namun pada perkembangan selanjutnja, embrio kotiledonary terbentuk pada media M2 (MS + 146 mM sucrose + 2 X FeEDTA) mencapai 90%, lebih tinggi dibandingkan dengan lainnya. Pada fase perkembangan planlet, komposisi media M3 merupakan media paling optimal bagi pertunasan dan perakarannya. Dari penelitian ini dapat disimpulkan, bahwa setiap fase pertumbuhan pada perbanyakan SE diperlukan media dengan komposisi yang berlainan.
DAFTAR PUSTAKA
Bellettrea, A., Jean-Paul Couillerota, Anne-Sophie Blervacqa, S. Aubertb, E. Goutc, J.ean-Louis Hilberta and J. Vasseura. 2011. Glycerol effects both carbohydrate metabolism and cytoskeletal rearrangements during the induction of somatic embryogenesis in chicory leaf tissues. Plant Physiol. Biochem. 39 (2001) 503−511
Cunha, A. dan M. Fernandes-Ferreira. 2010. Influence of medium parameter on somatic embryogenesis from hypocotyls explants of Flax (Linum usitatissimum L.). E papper.18 pp Devy ,N. F., F. Yulianti dan Hardiyanto. 2011. Pengaruh sumber karbohidrat terhadap induksi embrio
dan daya multiplikasi kalus pada somatik embriogenesis Siam Kintamani (Citrus reticulata). Prosiding seminar Nasional Perhimpunan Hortikultura Indonesia. Balitsa Lembang, 23-24 November 2011. Hal : 647-656
Devy, N.F dan A. Sutanto. 1997. The effect of fruit maturity on the growth of nucellus cultures of some citrus rootstock varieties. J. Bioteknologi Pertanian. 2(2):49-55
Gavish, H., A. Vardi and R. Fluhr. 1992. Suppression of somatic embryogenesis in citrus cell cultures by extracellular protein. Planta. 186: 511-517
Han, S.H., S.K. Kang, H.J. An, and H.Y. Kim. 2002. Effect of embryonic callus conditions on plant regeneration in Satsuma Mandarin (Citrus unshiu Marc.). J. Plant Biotecnology . Vol. 4 (1) : 29-32.
Kayim, M. and N. Kemal Koc. 2006. The effects of some carbohydrates on growth and somatic embryogenesis in citrus callus culture. Scientia Horticulturae. Vol 109 (1):29-34
Mendes-da-Gloria, F.J., F.A.A.M. Filho, C. G.B. Demetrio, B.M.J. Mendes. 1999. Embryogenic calli induction from nucellar tissue of citrus cultivars. Scientia Agricola. Vol 56 (4):1111-1115.
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 1 2 % planlet berakar
umur planlet (bulan)
M3 M1 (Kontrol) M2 c a b c a b cv=16.4% cv=9.3%
54
Miah, M. N., S. Islam and S. Hadiuzzaman. 2002. Regeneration of Plantlets Through Somatic Embryogenesis from Nucellus Tissue of Citrus macroptera Mont. var. anammensis ('Sat Kara'). Plant Tissue Cult. 12(2) : 167-172.
Molnar, Z., E. Virag and V. Ordog. 2011. Natural substances in tissue culture media. Acta Biologica Szegediensis. 55(1) : 123-127 available at : http://www.sci.u-szeged.hu/ABS
Niedz, R.P., S. E. Hyndman, E.T. Wynn and M.G. Bausher. 2002. Normalizing sweet orange (C.
sinensis (L.) Osbeck) somatic embryogenesis with semipermiable membranes. In Vitro Cell
Dev.Bio.-Plant. 38:552-557
Saad, A. I. M. and A. M. Elshahed. 2012. Recent Advances in Plant in vitro Culture. Chapter 2 : Plant Tissue Culture Media. INTECH. Available at : http://dx.doi.org/10.5772/50569.
Singh, B., S. Sharma, G. Rani, G.S. Virk, A.A. Zaidi and A. Nagpal. 2006. In vitro flowering in embryogenic cultures of Kinnow mandarin (Citrus nobilis Lour x C. deliciosa Tenora). African Journal of Biotechnology. 5(16):1470-1474.
Sridhar, T. and C. R. Aswath. 2014. Influence of additives on enhanced in vitro shoot multiplication of
Stevia rebaudiana (Bert.) – an important anti diabetic medical plant. American Journal of Plant Science. Vol 5 : 192-199. Available at http://dx.dot.org/10.4236/ajps.2014.51025
Tomaz, M.L., B.M.J. Mendez, F. De Assis, A.M. Filho, C.G.B. Demetrio, N. Jansakul and A.P.M. Rodriguez. 2001. Somatic embryogenesis in Citrus spp.: Carbohidrate stimulation and histodefferentiation. In vitro Cell. Dev. Biol-Plant. 37: 446-452
Wagner, J. O. and I. Kafka. 1995. Effects of Medium Composition on in vitro Germination of Embryos of Fraxinus excelsior at Different Stages of Development. J. Plant Physiol. Vol. 146 : 566-568
