Berdasarkan pengamatan terhadap gejala klinis pada semua kelompok perlakuan, baik pada kelompok kontrol (P0) maupun pada kelompok perlakuan I, II dan III dari hari pertama sampai pada hari keenam semua itik terlihat sehat, tidak ditemukan adanya gejala klinis. Gejala klinis sinusitis mulai terlihat pada hari ke 8 pada kelompok perlakuan I dan II, dua hari setelah itik ditantang dengan virus H5N1 melalui intranasal dengan dosis 104 EID50 per ekor, sedangkan gejala sinusitis terlihat pada kelompok perlakuan III dihari ke 9. Pada hari ke 10 itik-itik pada perlakuan I, II dan III terlihat mengalami gejala berupa sinusitis dan konjungtivitis, dan pada hari ke 11 semua itik baik pada perlakuan I, II dan III telah menunjukkan gejala berupa sinusitis, konjungtivitis dan diare berwarna putih kecuali pada kelompok kontrol. Selanjutnya semua itik yang menjadi hewan coba dalam penelitian ini baik pada kelompok kontrol dan pada kelompok perlakuan I, II, dan III dilakukan nekropsi.
Hasil pengamatan histopatologi dengan metode HE, pada beberapa organ seperti trakhea, paru-paru, jantung, limpa, hati, usus, pankreas, ginjal, ovarium, dan isthmus serta otak secara umum menunjukkan adanya kongesti vena dan nekrosis endotel buluh darah, selain itu juga terlihat adanya infiltrasi limfosit yang terutama berada disekitar pembuluh darah. Seperti yang dikemukakan oleh Tizard (1987), bahwa inflitrasi sel radang merupakan reaksi tanggap gebal yang terjadi di dalam tubuh untuk mengeliminasi benda-banda asing atau antigen yang masuk, dan sel radang ini akan menginduksi pembentukan antibodi di dalam tubuh. Pada setiap infeksi semua jenis sel radang dilepaskan, tetapi sel radang yang dominan dilepaskan pada setiap infeksi berbeda-beda tergantung dari agen penyebab, apabila infeksi disebabkan oleh virus maka sel radang yang dominan muncul adalah limfosit.
Pada saat suatu mikroba invasif, komponen-komponen spesifik sistem imun melakukan persiapan untuk secara selektif menyerang benda asing tersebut. Sel-sel sistem imun spesifik seperti limfosit, masing-masing dilengkapi dengan reseptor permukaan yang mampu berikatan dengan molekul asing spesifik yang dikenal sebagai antigen. Kemampuan mendeteksi bermacam-macam antigen dari
limfosit tersebut dihasilkan oleh pertukaran acak beberapa segmen gen, disertai mutasi somatik, selama perkembangan limfosit (Barrett 1988).
Kemampuan gerakan amuboid yang dimiliki oleh sel-sel limfosit memiliki kekuatan yang berbeda, mengakibatkan perbedaan dalam pencapaian wilayah yang dapat dijangkau, sel limfosit yang memiliki keterbatasan kekuatan gerakan amuboid akan berkumpul disekitar pembuluh darah. Selain itu infiltrasi sel limfosit disekitar pembuluh darah, juga bisa disebabkan karena virus memang menempati area vaskular tersebut yang menjadi mediator peradangan, dengan adanya sel-sel atau jaringan yang rusak akan menstimulasi pengiriman limfosit ke area tersebut (Smith & Jones 1961).
Pada pemeriksaan imunohistokimia pada kelompok perlakuan I, yaitu pada itik yang divaksin AI inaktif dan 3 hari kemudian ditantang dengan virus AI H5N1 dengan dosis 104 EID50 secara intranasal. Keberadaan virus H5N1 pada kelompok perlakuan ini ditemukan pada jaringan paru-paru, jantung, hati, pankreas, limpa, ginjal, ovarium dan isthmus dalam derajat ringan (+), pada jaringan otak terdapat satu yang menunjukkan positif (+) dan dua jaringan otak lainnya tidak menunjukkan adanya antigen H5N1. Untuk jaringan trakhea serta usus menunjukkan adanya antigen H5N1 dalam jumlah yang sedang (++). Tidak ditemukan adanya antigen virus H5N1 pada otot dada dan otot paha.
Pada pemeriksaan imunohistokimia pada kelompok perlakuan II, yaitu itik tidak divaksin dan ditantang dengan virus AI H5N1, virus AI H5N1 ditemukan pada jaringan paru-paru, jantung, pankreas, hati, limpa, ginjal, ovarium dan isthmus dalam derajat ringan (+) sampai sedang (++), sedangkan pada jaringan otak terdapat dua ekor itik yang menunjukkan positif (+) dan hanya satu jaringan otak yang tidak menunjukkan adanya antigen H5N1. Pada trakhea serta usus berada pada derajat yang tinggi (+++). Sedangkan pada otot dada dan otot paha menunjukkan reaksi yang negatif.
Pemeriksaan imunohistokimia pada kelompok perlakuan III, yaitu itik yang telah berproduksi (tidak divaksin dan ditantang dengan virus AI H5N1), virus AI H5N1 ditemukan pada jaringan paru-paru, jantung, hati, pankreas, limpa, ginjal, ovarium dan ishtmus dalam derajat ringan (+) sampai sedang (++). Pada jaringan otak, ada dua ekor yang menunjukkan positif (+) dan hanya satu jaringan
otak yang tidak menunjukkan adanya antigen H5N1. Keberadaan virus AI H5N1 pada jaringan trakhea serta usus pada kelompok ini menunjukkan derajat yang tinggi (+++). Tidak ditemukan adanya antigen H5N1 pada otot dada dan otot paha.
Tabel 2. Distribusi antigen H5N1 pada organ itik dengan metode imunohistokimia
Organ P0 PI PII PIII
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Otak - - - - + - - + + + + - Trakea - - - ++ ++ ++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ Paru-paru - - - + + + + + + + + + Usus - - - ++ ++ ++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ Pankreas - - - + + + + + + + + + Jantung - - - + + + + + + + + + Ginjal - - - + + + + + + + + + Hati - - - + + + + + + + + + Limpa - - - + + + + + + + + + Ovarium - - - + + + + + + + + + Isthmus - - - + + + ++ ++ ++ ++ ++ ++ Otot dada - - - Otot paha - - -
Antigen H5N1 ditemukan dalam derajat yang tergolong sedang (++) sampai tinggi (+++) pada organ trakhea pada semua kelompok perlakuan (PI, PII dan PIII). Pemeriksaan dengan pewarnaan HE ditemukan adanya proses peradangan yang ditandai dengan infiltrasi sel-sel limfosit disertai dengan nekrosis dan juga telihat adanya kongesti.
Infeksi secara intranasal akan menyebabkan penyebaran virus pada organ saluran pernafasan yang merupakan sasaran utama virus AI, yaitu sel-sel epitel torak dari saluran pernafasan, sel-sel ini rentan terhadap infeksi virus. Reseptor virus adalah penentu tropism (respons organisme terhadap stimulus luar). Pada infeksi AI, tempat ikatan reseptor virus hemaglutinin (HA) diperlukan untuk ikatan ke galaktosa mengikat asam sialik pada permukaan sel-sel hospes (Weis et al.1988).
Virus yang masuk melalui inhalasi akan menembus mukosa saluran pernafasan. Virus melekat pada reseptor galaktosa yang ada pada saluran
proses fusi, genom virus dilepaskan ke sitoplasma sel terinfeksi selanjutnya genom akan bermigrasi ke nukleus. Di nukleus inilah terjadi trankripsi dan replikasi virus (Cross et al., 2001). Ketika virus AI menginfeksi sel-sel epitel pernafasan secara efisien, replikasi terjadi dalam waktu berjam-jam dan sejumlah virion diproduksi (Behrens & Stoll 2007).
Infeksi dan replikasi virus AI dalam saluran pernafasan menimbulkan kerusakan sel yang disebabkan oleh penurunan pengaturan sintesis protein sel hospes dan apoptosis yang disebut juga program kematian sel, yaitu suatu rentetan peristiwa sel yang hasil akhirnya hilangnya sel beserta isinya secara efisien (Willey et al. 2001). Pada penelitian ini pemeriksaan dengan pewarnaan HE, pada jaringan trakea terlihat adanya kongesti, infiltrasi limfosit dan nekrosis sel.
Pada organ paru-paru antigen virus H5N1 terdeteksi dalam derajat yang ringan (+), virus ditemukan di dalam dan di sekitar alveoli, bagian dari paru-paru dimana oksigen bertemu dengan darah. Sedangkan pada pewarnaan HE terlihat adanya kongesti pada vena dan adanya infiltrasi limfosit. Keberadaan virus pada organ ini selanjutnya dapat menyebabkan kerusakan sel sehingga akan mengganggu fungsi kerja dari organ paru-paru. Jaringan paru yang rusak karena infeksi AI berhubungan dengan stress oksidasi seluler, generasi spesies oksigen reaktif (ROs), dan induksi nitric oxide synthetase-2, yang menimbulkan pembentukan nitrogen reaktif toksik menengah (Chen et al. 2001).
Keberadaan antigen virus H5N1 pada organ jantung dalam derajat ringan (+) yang dengan pewarnaan HE ditandai dengan adanya kongesti, turut menjelaskan ditemukannya antigen virus AI H5N1 pada hampir semua organ. Karena jantung merupakan bagian dari sistem kardiovaskular, yang berperan dalam perjalanan penyakit AI sehingga virus dapat menyebar ke semua organ viseral.
Limpa merupakan organ tubuh yang komplek dengan banyak fungsi. Dari fungsinya terdiri atas dua bagian, pulpa putih merupakan sistem kekebalan untuk melawan infeksi dan bagian pulpa merah bertugas membuang bahan-bahan yang tidak diperlukan dari dalam darah (misalnya sel darah merah yang rusak). Sel darah putih tertentu (limfosit) menghasilkan antibodi pelindung dan
memegang peranan penting dalam melawan infeksi. Limfosit dapat dibentuk dan mengalami pematangan di dalam pulpa putih limpa (Anonim 2008b)
Antigen AI H5N1 ditemukan juga pada organ limpa pada semua perlakuan (PI, PII dan PIII) pada derajat ringan (+) dan dengan pewarnaan HE diantaranya terlihat adanya kongesti, infiltrasi limfosit, penebalan dinding pembuluh darah dan nekosis sel. Penyakit AI dapat merusak struktur dan fungsi organ limfoid sekunder yakni diantaranya limpa yang mengakibatkan fungsi organ tersebut berkurang dalam melawan infeksi, sehingga peningkatan resiko untuk menyebabkan infeksi yang lebih parah hingga terjadinya kematian tidak akan berlangsung lama.
Pankreas adalah kelenjar pencernaan yang terdiri atas 2 bagian, endokrin dan eksokrin. Bagian eksokrin menghasilkan NaHCO3 serta enzim-enzim pencernaan yang melalui saluran pankreas menyalurkan enzim-enzim tersebut ke duodenum. Sedangkan pada bagian endokrin terdapat pulau-pulau Langerhans yang menghasilkan hormon-hormon insulin dan glukagon yang akan masuk langsung ke peredaran darah (Frandson 1992). Antigen virus H5N1 ditemukan pada pankreas pada semua perlakuan (PI, PII, dan PIII) pada derajat ringan (+). Dengan pewarnaan HE diantaranya tampak adanya hemoragi dan kongesti pada vena, yang pada akhirnya dapat menyebabkan kerusakan pada sel-sel pankreas, sehingga dapat menurunkan fungsi organ pankreas tersebut dalam menghasilkan enzim pencernaan seperti tripsin, steapsin dan amilopsin yang dapat menyebabkan gangguan pada proses pencernaan dan penyerapan makanan. Selain itu juga akan menurunkan fungsi pankreas yang lain, yakni dalam menghasilkan hormon-hormon yang berperan dalam metabolisme tubuh.
Pada penelitian ini, antigen virus H5N1 dapat dideteksi pada usus dalam jumlah yang cukup banyak (+++). Hal ini sesuai dengan gambaran histopatologi dengan pewarnaan HE terlihat adanya kongesti pada usus yang cukup hebat, infiltrasi limfosit dan nekosis sel. Bila dilihat dari gejala, itik juga mengalami gejala diare berwarna putih, hal ini dikarenakan pada itik yang terinfeksi AI akan diikuti pula dengan adanya gangguan pada fungsi hati dan pankreasnya.
Pada pewarnaan imunohistokimia terlihat adanya antigen virus AI H5N1 dalam derajat yang ringan (+) pada jaringan hati. Didukung oleh pemeriksaan
dengan pewarnaan HE bahwa pada organ tersebut terlihat adanya kongesti vena, dilatasi sinusoid dan infiltrasi limfosit pada sekitar pembuluh darah serta adanya nekrosis sel. Perdarahan yang terlihat pada sinusoid-sinusoid hati merupakan indikasi adanya kerusakan pada pembuluh darah. Keadaan tersebut dapat menyebabkan gangguan pada proses biokimiawi dari organ hati, yang pada akhirnya mengakibatkan gangguan pada metabolisme karbohidrat, protein, dan lemak pada sel. Gangguan metabolisme intraseluler ini akhirnya mengakibatkan perubahan pada struktur sel hati (Darmawan 1994). Hati merupakan kelenjar terbesar dalam tubuh dan sel hati mempunyai daya regenerasi yang sangat besar. Tetapi dalam kasus AI, sel-sel hati yang mengalami kerusakan tidak dapat digantikan karena prosesnya yang akut.
Pada organ ginjal terdeteksi antigen virus AI H5N1 pada derajat yang ringan (+). Pada pewarnaan dengan HE terlihat adanya kerusakan yang terjadi pada glomerulus berupa kongesti yang juga diikuti dengan adanya kongesti pada daerah diantara tubulus atau daerah interstisial. Ginjal merupakan organ tubuh yang mempunyai peranan penting dalam mengatur keseimbangan air dan elektrolit, mengeluarkan sisa hasil metabolisme tubuh yang tidak dibutuhkan serta sebagai tempat pembentukan hormon yang mengatur tekanan darah dan proses pematangan sel darah merah (eritrosit). Adanya gangguan fungsi ginjal dapat menyebabkan gangguan keseimbangan air dan elektrolit, yang akibatnya dapat menimbulkan gangguan pada pengaturan tekanan darah (Striker et al. 1978).
Virus yang telah bereplikasi akan terbawa darah menuju sel target organ, sehingga virus AI tidak hanya ditemukan pada organ respirasi maupun organ pencernaan tapi juga ditemukan pada organ lain, seperti pada organ otak hanya ditemukan pada PII dan PIII dengan derajat yang ringan (+) dan pada organ reproduksi diantaranya ovarium dan isthmus yang ditemukan dalam derajat ringan (+) sampai sedang (++). Pada pewarnaan HE pada ketiga organ tersebut terlihat adanya kongestidan kongesti pada vena
Adanya virus pada organ reproduksi juga akan berpengaruh pada produksi telur, karena keberadaan virus AI akan merangsang sel natural killer. Sel natural killer secara nonspesifik melisiskan dan menghancurkan sel-sel yang terinfeksi virus. Kemampuan virus AI adalah membangkitkan hampir keseluruhan respon
"bunuh diri" dalam sistem imunitas tubuh. Semakin banyak virus itu tereplikasi, semakin banyak pula sitokin protein yang memicu untuk peningkatan respons imunitas yang memainkan peran penting dalam peradangan yang diproduksi tubuh. Sitokin yang membanjiri aliran darah, karena virus yang bertambah banyak, justru melukai jaringan-jaringan dalam tubuh (Achdount et al. 2003).
Pada penelitian ini, dengan terdeteksinya virus AI pada organ reproduksi dari itik pada PIII, yaitu itik yang telah berproduksi maka besar kemungkinan akan adanya virus ini pada telur-telur yang telah dihasilkan. Semua bagian dari telur burung yang terinfeksi, virus AI dapat ditemukan di dalam maupun dipermukaan luar dari telur (FEHD 2005)
Berdasarkan analisis statistik terhadap rata-rata gambaran imunohistokimia dari setiap organ pada penelitian ini dapat ditunjukkan sebagai berikut : pada jaringan otak, hati, otot dada dan otot paha pada penelitian ini, menunjukkan bahwa pada semua kelompok perlakuan (PI, PII, dan PIII) memberikan gambaran yang tidak berbeda nyata dibandingkan dengan kelompok kontrol (P0) (p> 0,05). Hal ini bisa disebabkan karena pada hewan coba itik, telah dilakukan nekropsi pada hari kelima setelah ditantang dengan virus AI, yang baru menunjukkan gejala-gejala pada saluran pernafasan dan pencernaan saja, sehingga antigen hanya ditemui pada organ-organ viseral dan belum terdeteksi pada jaringan otot.
Pada analisis statistik terhadap rata-rata gambaran imunohistokimia pada jaringan paru-paru, pankreas, jantung, ginjal, limpa dan ovarium dapat diketahui bahwa pada kelompok PI, PII, dan PIII memberikan gambaran yang berbeda nyata dengan kelompok kontrol (P0) (p<0,05), tetapi antara PI, PII, dan PIII memberikan gambaran yang tidak berbeda nyata (p> 0,05). Pada gambaran imunohistokimia pada organ-organ tersebut baik pada kelompok P1, PII dan PIII memperlihatkan keberadaan antigen H5N1 dalam derajat ringan (+) dan pada kelompok kontrol P0 tidak terdeteksi adanya antigen H5N1.
Pada jaringan trakhea, usus, dan isthmus berdasarkan analisis statistik menunjukkan bahwa pada kelompok PI, PII, dan PIII memberikan gambaran yang berbeda nyata dengan kelompok kontrol (P0) (p< 0,05), tetapi terdapat perbedaan yang nyata antara kelompok PI dengan kelompok PII dan PIII (p< 0,05).
Gambaran imunohistokimia pada kelompok PII dan PIII berada pada derajat sedang (++) sampai tinggi (+++) pada trakhea dan usus, serta pada isthmus berada pada derajat yang sedang (++). Pada ketiga organ tersebut terlihat bahwa antara kelompok PII dan PIII tidak berbeda nyata (p> 0,05). Sedangkan untuk P1 untuk trakhea dan usus berada pada derajat yang sedang (++) dan untuk isthmus berada pada derajat yang ringan (+). Terdapatnya perbedaan yang nyata antara kelompok P1 dengan PII dan PIII pada jaringan trakhea, usus dan isthmus. Hal ini dapat dijelaskan karena pada kelompok PI, itik telah mengalami vaksinasi, namun dengan selang waktu yang sangat pendek belum memberikan kekebalan protektif terhadap itik, sehingga itik masih dapat terinfeksi. Tapi dari gambaran imunohistokimia dengan pemeriksaan secara semikuantitatif terlihat adanya perbedaan antara PI dengan PII dan PIII dalam banyaknya antigen yang terdeteksi pada ketiga organ tersebut.
Hasil Penelitian ini dapat memberikan berbagai informasi mengenai distribusi virus AI pada jaringan tubuh itik. Virus H5N1 yang diberikan secara intranasal dapat menyebar secara sistemik, sehingga pada hampir semua organ viseral terdeteksi adanya antigen H5N1. Tidak terdeteksinya keberadaan antigen H5N1 pada jaringan otot kemungkinan karena hewan coba telah dinekropsi pada hari kelima pasca pemberian virus, dan itik baru menunjukkan gejala klinis pada saluran pernafasan dan diare berwarna putih. Bila waktu perjalanan penyakit diperpanjang virus akan terus menyebar melalui pembuluh darah dan sistem lymphatik sehingga tidak menutup kemungkinan bahwa pada jaringan otot juga bisa mengandung virus H5N1. Sebuah studi mengenai pengaruh inokulasi terhadap penyebaran virus di tubuh hewan, menginformasikan bahwa lokasi inokulasi virus menentukan jalannya penyebaran virus AI pada tubuh hospes (Flint et al. 2004).
Infeksi virus H5N1 dimulai ketika virus memasuki sel hospes melalui pernafasan ataupun mulut, kemudian menyebar memasuki submukosa melalui sistem peredaran darah atau sistem lymphatic serta menginfeksi berbagai macam tipe sel organ (Radji 2006). Hemaglutinin pada virus AI virulen dapat menempel pada berbagai jenis sel, karena virus AI virulen memiliki multiple basic amino acid pada daerah cleavage site gen HA menjadikannya sensitif terhadap protease
seluler endogen yang tersebar diberbagai tipe sel sehingga virus dapat menyebabkan infeksi sistemik dan dapat menimbulkan kematian (Swayne 1997).
Aktivasi proteolitik protein HA merupakan faktor penting untuk infektivitas dan penyebaran virus ke seluruh tubuh. Perbedaan kepekaan protein HA virus AI terhadap protease hospes akan berhubungan dengan tingkat virulensi. Virus yang termasuk dalam kelompok HPAIV mempunyai hemaglutinin yang sangat peka terhadap protease endogen/seluler hospes, sedangkan pemotongan hemaglutinin pada LPAIV membutuhkan protease ekstra seluler aktif spesifik seperti tripsin (Swayne & Suarez 2000).
Pada penelitian yang dilakukan pada akhir tahun 2002 menginformasikan bahwa virus H5N1 2002 dapat menginfeksi berbagai tipe sel dibandingkan dengan virus H5N1 yang ditemukan tahun-tahun sebelumnya. Meluasnya infeksi pada berbagai jaringan dapat memegang peranan pada peningkatan patogenitas virus (Strum-Ramirez 2004).
Dalam kaitannya dengan kemungkinan tranmisi virus, virus ini akan mati dalam suhu yang tinggi. Oleh karena itu daging, telur, dan hewan harus dimasak dengan matang untuk menghindari penularan. Tidak ada risiko yang ditimbulkan dalam mengkonsumsi produk unggas air dan telurnya yang telah dimasak dengan baik dan matang. Saat ini tidak ada bukti bahwa daging unggas atau produk unggas yang dimasak dengan matang adalah sumber infeksi virus H5N1 keturunan Asia pada manusia. Sebagai aturan umum, WHO merekomendasikan daging harus dimasak lama, sehingga semua bagian dalam daging mencapai suhu 700C. Pada suhu ini, virus influenza tidak aktif, menjadikan semua bagian daging unggas aman dari kontaminasi virus H5N1 (WHO 2005b).
Virus AI dapat menyebar ke manusia yang menangani dan berkontak langsung dengan produk unggas dan telur yang terkontaminasi (FEHD 2005). Pemaparan yang dianggap paling mungkin adalah pada saat proses penyembelihan, pencabutan bulu, pemotongan dan persiapan untuk dimasak, serta pada saat menangani telur mentah baik pada kondisi yang masih utuh ataupun dalam keadaan yang pecah ataupun retak.
