BAB I BAB I
PENDAHULUAN PENDAHULUAN
II..11 PPrriinnssiip p PPeerrccoobbaaaann
1.
1. BerBerdasdasarkarkan an perperhithitungungan an jumjumlah koloni mikrolah koloni mikroorgorganianisme kualisme kualitattatif if dengdenganan
metode Angka Lempeng Total ( ALT ). metode Angka Lempeng Total ( ALT ).
2.
2. BerBerdasdasarkarkan an perperhithitungungan an jumjumlah koloni mikrolah koloni mikroorgorganianisme kualisme kualitattatif if dengdenganan
metode Angka Paling Mungkin ( APM ). metode Angka Paling Mungkin ( APM ).
3.
3. BerBerdasdasarkarkan jumlan jumlah dan atau massah dan atau massa melea melebihi yanbihi yang ada di g ada di daldalam inokuam inokulumlum
asalnya. asalnya.
II..22 TTuujjuuaan n PPeerrccoobbaaaann
1.
1. MaMampmpu u memempmpreredidiksksi i jujumlmlah ah mimikrkroboba a dadalalam m susuatatu u sasampmpel el dardari i alalam am yanyangg
belum dan sudah mengalami pengenceran. belum dan sudah mengalami pengenceran.
2.
2. MaMampmpu u memembmbanandidingngkan kan jujumlmlah ah mimikrkroboba a yanyang g tutumbmbuh uh dardari i susuatatu u sasampmpelel
dalam media Nutrient Agar dan Lactose Broth. dalam media Nutrient Agar dan Lactose Broth.
3.
3. MamMampu memapu memahamhami teknii teknik k perperhithitungungan kolonan koloni baktei bakteri dengari dengan metodn metode e ALTALT
( Angka Lempeng Total ) dan APM ( Angka Paling Mungkin ). ( Angka Lempeng Total ) dan APM ( Angka Paling Mungkin ).
BAB II BAB II
TINJAUAN PUSTAKA TINJAUAN PUSTAKA
Pengukuran kuantitatif pertumbuhan sebagaimana digunakan pada bakteri yang Pengukuran kuantitatif pertumbuhan sebagaimana digunakan pada bakteri yang
mengacu pada perubahan dalam populasi total dan bukannya perubahan dalam suatu mengacu pada perubahan dalam populasi total dan bukannya perubahan dalam suatu
individu organisme saja. Tambahan pula, pada kondisi pertumbuhan seimbang ada individu organisme saja. Tambahan pula, pada kondisi pertumbuhan seimbang ada
suatu pertambaham semua komponen selular secara teratur. Akibatnya, pertumbuhan suatu pertambaham semua komponen selular secara teratur. Akibatnya, pertumbuhan
dapat ditentukan tidak hanya dengan cara mengukur jumlah sel, tetapi juga dengan dapat ditentukan tidak hanya dengan cara mengukur jumlah sel, tetapi juga dengan
mengukur jumlah sebagai komponen
mengukur jumlah sebagai komponen selular dan juga produk metabolisme tertentu.selular dan juga produk metabolisme tertentu.
Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui berbagai macam uji seperti uji Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui berbagai macam uji seperti uji
kualitatif koliform yang secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji kualitatif koliform yang secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji
kuantitatif, bisa dengan metode MPN), uji penguat, dan uji pelengkap. Waktu, mutu kuantitatif, bisa dengan metode MPN), uji penguat, dan uji pelengkap. Waktu, mutu
sampel, biaya, tujuan analisis merupakan beberapa faktor penentu dalam uji kualitatif sampel, biaya, tujuan analisis merupakan beberapa faktor penentu dalam uji kualitatif
koliform. Bakteri koliform dapat dihitung dengan menggunakan metode cawan petri ( koliform. Bakteri koliform dapat dihitung dengan menggunakan metode cawan petri (
metode perhitungan secara tidak langsung yang didasarkan pada anggapan bahwa metode perhitungan secara tidak langsung yang didasarkan pada anggapan bahwa
setiap sel yang dapat hidup akan berkembang menjadi satu koloni yang merupakan setiap sel yang dapat hidup akan berkembang menjadi satu koloni yang merupakan
suatu indeks bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang terdapat pada sampel ). suatu indeks bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang terdapat pada sampel ).
Fa
Fardrdiaiaz z (1(1989989) ) memenynyatatakakan an ada ada bebebeberarapa pa carcara a yayang ng dadapat pat didigungunakakan an ununtutuk k
menghitung atau mengukur jumlah jasad renik di dalam suatu suspensi atau bahan, menghitung atau mengukur jumlah jasad renik di dalam suatu suspensi atau bahan,
yang dapat dibedakan atas beberapa kelompok, yaitu : yang dapat dibedakan atas beberapa kelompok, yaitu :
a. Perhitungan Jumlah Sel a. Perhitungan Jumlah Sel
1.
2. Hitungan cawan
3. MPN ( Most Probable Number )
b. Perhitungan Massa Sel Secara Langsung
1. Volumetrik
2. Gravimetrik
3. Kekeruhan ( turbidimetri )
c. Perhitungan Massa Sel Secara Tidak Langsung
1. Analisis komponen sel
2. Analisis produk katabolisme
3. Analisis konsumsi nutrient
Dari metode-metode tersebut, metode hitungan cawan paling banyak digunakan.
Hal ini disebabkan metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif
untuk menghitung jumlah mikroba karena :
1. Hanya sel yang masih hidup yang dihitung
2. Beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus
3. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba karena koloni yang
terbentuk mungkin berasal dari satu sel dengan penampakan pertumbuhan
Prinsip dari metode hitungan cawan adalah menumbuhkan sel mikroba yang
masih hidup pada metode agar, sehingga sel mikroba tersebut akan berkembang biak
dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan
mikroskop. Metode hitungan cawan dapat dibedakan atas dua cara, yaitu :
1. Metode tuang (pour plate)
2. Metode permukaan (surface / spread plate)
Pada perhitungan menggunakan metode cawan, diperlukan suatu pengenceran agar
jumlah koloni mikroba yang ada pada cawan dapat dihitung dan sesuai standar, yaitu
berjumlah 30 – 300 per cawan. Pengenceran dilakukan secara desimal untuk
memudahkan perhitungan. Perhitungan metode cawan menggunakan rumus sebagai
berikut :
Faktor pengenceran = pengenceran x jumlah yamg ditumbuhkan
Jumlah koloni ( SPC ) = jumlah koloni x pengenceran yang diambil
Untuk melaporkan suatu analisis mikrobiologi digunakan suatu standar yang
disebut “ Standard Plate Count ” yang menjelaskan cara menghitung koloni pada
cawan serta cara memilih data yang ada untuk menghitung jumlah koloni dalan suatu
1. Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni
antara 30 sampai 300.
2. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan
koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan, dapat dihitung sebagai
satu koloni.
3. Suatu deretan ( rantai ) koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung
sebagai satu koloni.
Sedangkan data yang dilaporkan sebagai SPC harus mengikuti peraturan sebagai
berikut :
1. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka, yaitu angka pertama
dibelakang koma dan angka kedua dibelakang koma. Jika angka ketiga sama
dengan atau lebih besar dari lima, harus dibulatkan satu angka lebih tinggi pada
angka kedua.
2. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk menanam menghasilkan angka
kurang dari 30 pada cawan petri, hanya jumlah koloni pada pengenceran yang
terendah yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 30 dikalikan
dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus
dicantumkan.
3. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk menanam menghasilkan angka lebih
tertinggi yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari 300 dikalikan
dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus
dicantumkan.
4. Jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni dengan jumlah
antara 30 dan 300, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari
kedua pengenceran tersebut lebih kecil atau sama dengan 2, yang digunakan
adalah rata-ratanya. Jika perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari
kedua pengenceran tersebut lebih besar dari 2, yang dilaporkan hanya hasil
terkecil.
5. Jika digunakan dua cawan petri ( duplo ) per pengenceran, data yang diambil
harus dari kedua cawan tersebut, meskipun salah satunya tidak memenuhi
syarat diantara 30 dan 300.
Koloni adalah kumpulan dari mikroba yang memilki kesamaan sifat-sifat seperti
bentuk, susunan, permukaan, dan sebagainya. Sifat-sifat yang perlu diperhatikan pada
koloni yang tumbuh di permukaan medium adalah :
1. Ukuran ; ada koloni yang hanya serupa suatu titik, namun ada pula yang
melebar sampai menutup permukaan medium.
2. Bentuk ; ada koloni yang bulat, ada yang memanjang, ada yang tepinya rata, ada
3. Kenaikan permukaan ; ada koloni yang rata saja dengan permukaan medium,
ada pula yang timbul, yaitu menjulang tebal di atas permukaan medium.
4. Halus kasarnya permukaan ; ada koloni yang permukaannya halus, ada yang
permukaannya kasar dan tidak rata.
5. Wajah permukaan ; ada koloni yang permukaannya mengkilat, ada yang
permukaannya suram.
6. Warna ; kebanyakan koloni bakteri berwarna keputihan atau kekuningan.
7. Kepekatan ; ada koloni yang lunak seperti lendir, ada yang keras dan kering.
Perhitungan koloni bakteri berdasarkan atas aktivitas bakteri tersebut dalam
melakukan metabolisme. Metode ini disebut juga sebagai MPN ( Most Probable
Number ). Bahan uji yang akan dihitung populasi bakterinya diencerkan beberapa
kali, dilanjutkan dengan inokulasi hasil pengenceran tersebut dalam media cair
tertentu yang dapat mendeteksi adanya aktivitas metabolism bakteri uji. Hasil yang
diperoleh kemudian dirujuk pada tabel APM atau MPN, sehingga populasi dapat
diketahui dengan pendekatan tersebut.
Pemilihan media sangat berpengaruh terhadap metode Angka Paling Mungkin
( APM ) yang dilakukan. Umumnya media yang digunakan mengandung bahan
nutrisi khusus untuk pertumbuhan bakteri tertentu. Media Lactose Broth digunakan
susu. Lactose broth dibuat dengan komposisi 0,3% ekstrak beef; 0,5% pepton; dan
0,5% laktosa.
BAB III
METODE PERCOBAAN
III.1 Alat
1. Tabung reaksi steril
2. Rak tabung
3. Cawan petri steril
4. Pipet ukur steril 1 mL, 15 mL, dan 10 mL
5. Tabung Durham steril
III.2 Bahan
1. Media Nutient Agar steril
2. Media Lactose Broth steril
3. Air steril
III.3 Prosedur Percobaan
1. Disiapkan 4 tabung reaksi steril, 5 cawan petri steril, 1 pipet steril 1 mL,
1 pipet media steril, 40 mL air steril, 75 mL media NA steril, 10 mL air
limbah.
2. Diisikan 9 mL air steril ke dalam 4 tabung dan disiapkan 5 cawan petri.
3. Disiapkan pipet 1 mL dan dilakukan pengenceran terhadap bahan uji air.
4. Dipipet 1 mL bahan uji dari botolnya, dimasukkan ke dalam cawan-1
dan tabung-1 (P-1). Diaduk homogen campuran P-1, kemudian dipipet
masing-masing 1 mL dan dimasukkan dalam cawan-2 dan tabung P-2.
5. Diaduk sampai homogen tabung P-2, dipipet masing-masing 1 mL dan
dimasukkan dalam cawan dan tabung P-3.
6. Diaduk sampai homogen tabung P-3, dipipet masing-masing 1 mL dan
dimasukkan dalam cawan-4 dan tabung P-4.
7. Diaduk sampai homogen tabung P-4, pipet 1 mL dan dimasukkan dalam
cawan-5.
8. Ke-5 cawan ditambahkan masing-masing 15 mL media NA yang telah
bersuhu 45°C dan digeser memutar di atas meja sekitar 30 kali untuk
menghomogenkan campuran di dalamnya.
9. Dilakukan pra-inkubasi selama 15 menit pada suhu ruang, kemudian
diinkubasi semua cawan pada suhu 35 - 37°C selama 24 jam.
10. Dicatat dan dihitung jumlah koloni yang tumbuh pada media pelat NA
11. Dilakukan pengamatan dan perhitungan populasi bakteri pada ke-5
cawan.
III. 3. 2 Perhitungan APM Koloni Bakteri
1. Disiapkan 4 tabung reaksi steril, 15 tabung reaksi steril yang berisi
tabung Durham, 1 pipet 1 mL steril, 1 pipet 10 mL steril, 40 mL air
steril, 150 mL media LB steril, 10 mL air limbah ( sampel yang sama
dengan percobaan untuk perhitungan ALT ).
2. Diisikan 9 mL air steril ke dalam 2 tabung reaksi.
3. Dengan pipet yang sama, diisikan 15 tabung reaksi ( yang berisi tabung
Durham ) dengan 9 mL media LB steril.
4. Dilakukan pengenceran bahan uji dengan memperhatikan teknik
pekerjaan yang aseptis.
5. Dipipet 1 mL bahan uji dari botolnya, dimasukkan dalam tabung LB-1
dan P-1, diaduk homogen dan diusahakan agar cairan dapat mengisi
tabung Durham sehingga tidak ada gas yang terperangkap dalamnya.
6. Dipipet 1 mL campuran P-1 dan dimasukkan ke dalam LB-2 dan
dan usahakan agar campuran cairan tadi secara penuh dapat mengisi
tabung Durham.
7. Dikocok tabung P-2 dengan menggunakan pipet. Pekerjaan yang sama
dilakukan terhadap tabung P-2, LB-2, tabung P-3, LB-3, tabung P-4,
LB-4, dan LB-5. Semua tabung Durham harus terisi penuh dengan
media LB dan tidak boleh mengandung gelembung udara.
8. Semua tabung LB di prainkubasi pada suhu kamar selama 15 menit,
kemudian diinkubasi pada suhu 35-37°C selama 24 jam.
9. Diamati seluruh tabung Durham yang berada dalam tabung LB. Dicatat
jumlah tabung Durham yang berisi gas ( gas (+), dihitung sebagai nilai
= 1 ).
10. Koloni bakteri dihitung dengan menggunakan tabel APM setelah
inkubasi 24 jam.
11. Dibandingkan hasil pengamatannya dengan percobaan untuk
perhitungan ALT.
III.4 Hasil Percobaan
III.4.1 Angka Lempeng Total ( ALT ) Koloni Bakteri
1.
Cawan NA I
-
Koloni bakteri terlihat lebihbanyak
-
Terdapat ± 1238 koloni bakteripada cawan NA I
2.
Cawan NA II
-
Koloni terlihat banyak tetapi lebihbanyak koloni bakteri pada cawan NA I
-
Terdapat ± 412 koloni bakteripada cawan NA II
3.
Cawan NA III
-
Koloni terlihat banyak tetapi lebih sedikit jika dibandingkan dengan koloni yang terdapat pada cawan NA I dan cawan NA II-
Terdapat ± 152 koloni bakteri4.
Cawan NA IV
-
Koloni terlihat sedikit-
Terdapat ± 30 koloni bakteri padacawan NA IV
5.
Cawan NA V
-
Koloni terlihat sangat sedikit-
Terdapat ± hanya 1 koloni bakteripada cawan NA V
III.4.2 Angka Paling Mungkin (APM) Koloni Bakteri
1.
Tabung LBI.1-3
-
Media pada tabung LBI.1-3 terlihat larutan berubah menjadi keruh dan mengandung busa pada tabung LBI.1-3.-
Gas (+) pada LBI.1-3-
Nilai = 32.
Tabung LBII.1-3
-
Media pada tabung LBII.1-3terlihat larutan berubah menjadi sedikit keruh.
-
Gas (-) pada LBII.1-3-
Nilai = 03.
Tabung LBIII.1-3
-
Media pada LBIII.1-3 tidak terlihat larutan menjadi keruh.-
Gas (-) pada LBIII.1-3-
Nilai = 04.
Tabung LBIV.1-3
-
Media pada LBIV.1-3 tidak terlihat larutan menjadi keruh.-
Gas (-) pada LBIV.1-3-
Nilai = 05.
Tabung LBV.1-3
-
Media pada LBV.1-3 tidak terlihat larutan menjadi keruh.-
Gas (-) pada LBV.1-3-
Nilai = 0BAB IV PEMBAHASAN
Prinsip perhitungan koloni bakteri adalah semakin tinggi tingkat pengenceran
semakin rendah jumlah koloni bakteri. Dengan kata lain, tingkat pengenceran
berbanding terbalik dengan jumlah koloni bakteri. Media yang digunakan pada
percobaan ini adalah media Nutrient Agar steril karena merupakan media yang paling
cocok untuk kultur bakteri. Berdasarkan hasil percobaan Angka Lempeng Total,
tidak memenuhi syarat ketentuan, yaitu 25 - 250 atau 30 - 300 koloni pada suatu
media pelat. Jumlah bakteri yang terkandung dalam tiap 1 mL inokulan yang
dipindahkan semakin berkurang akibat pengenceran yang dilakukan. Berbeda dengan
hasil jumlah koloni pada media yang tidak dilakukan pengenceran. Jumlah pada
media ini ± 1238 koloni yang artinya bakteri kurang homogen dengan air steril.
Syarat untuk memperoleh jumlah koloni yang mendekati keadaan nyata adalah 25
-250 koloni pada setiap media plat. Jadi, yang masuk syarat adalah pada NA III ( P-2 )
dengan jumlah koloni ± 152 dan NA II ( P-3 ) sebanyak ± 30 koloni. Yang diambil
yang pertama kali memenuhi syarat yaitu pada media pelat NA III. Media NA III
mengalami 2x pengenceran atau 100x pengenceran dari sampel awal. Jadi, jumlah
populasi = 152 x 102.
Pada percobaan Angka Paling Mungkin, prinsip utama metode ini adalah
mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu sehingga didapatkan konsentrasi
mikroorganisme yang sesuai dan jika ditanam dalam tabung menghasilkaan frekuensi
pertumbuhan tabung positif. Pemilihan media sangat berpengaruh terhadap metode
Angka Paling Mungkin ( APM ) yang dilakukan. Media yang digunakan pada
percobaan ini adalah media Lactose Broth steril yang sebagai media untuk
mendeteksi kehadiran koliform dalam air, makanan, dan produk susu. Bakteri dari
sampel uji tersebut mampu melakukan fermentasi glukosa dalam substrat media cair
dalam tabung Durham dengan posisi terbalik. Pada hasil percobaan APM ini,
pengenceran 2 sampai 5 tidak terdapat gas atau nilainya nol. Hal ini dikarenakan
semakin banyak pengenceran yang dilakukan, maka gelembung gas yang terbentuk
akan semakin sedikit dikarenakan berkurangnya populasi yang terbentuk. Hanya pada
tabung I ( tidak dilakukan pengenceran ) yang terdapat gas positif dengan nilai tiga.
Nilai yang diambil adalah 3 angka sebelum angka nol, sehingga kombinasi yang
dipilih adalah 3-0-0 dengan nilai APM 0,23.
BAB V KESIMPULAN
1. Secara kuantitatif, koloni bakteri dapat dihitung dengan metode Angka
Lempeng Total dan metode Angka Paling Mungkin.
2. Jumlah populasi bakteri dalam sampel pada percobaan ALT adalah 152 x 102
per mL.
3. Jumlah populasi bakteri dalam sampel pada percobaan APM adalah :
= 0,23 x ( 1 / pengenceran yang ditengah ) = 0,23 ( pengenceran ke-1 )
= 2,3
4. Pengenceran merupakan salah satu faktor yang penting dalam penghitungan
koloni.
5. Semakin tinggi tingkat pengenceran, semakin rendah jumlah koloni bakteri.
DAFTAR PUSTAKA
Dwidjoseputro, D. 1978. Dasar - dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan
Dwidjoseputro, Prof. .Dr. D. 1990. Dasar - dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan
Fardiaz, S. 1993. Analisis Mikrobiologi Pangan. Jakarta : PT. Raja Grafindo Persada
Pelczar, Michael J., Jr. dan E.C.S. Chan. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta :
Universitas Indonesia Press
Schlegel, H. G. 1994. Mikrobiologi Umum. Yogyakarta : Gadjah Mada University
Suriawiria, Unus. 1985. Pengantar Mikrobiologi Umum. Bandung : Angkasa
Waluyo, L. 2004. Mikrobiologi Umum. Malang : Universitas Muhamadiyah Malang
Press
LAMPIRAN
1. Apakah prinsip percobaan ALT dan APM ?
Jawab :
Prinsip ALT : metode penentuan angka lempeng total ini digunakan untuk
menentukan jumlah total mikroorganisme aerob dan anaerob yang terdapat
dalam suatu produk yang diuji.
Prinsip APM : mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu sehingga
didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang sesuai dan jika ditanam dalam
tabung menghasilkaan frekuensi pertumbuhan tabung positif.
2. Apakah persamaan dan perbedaan percobaan ALT dan APM ?
Jawab :
- untuk menentukan jumlah mikroba ( kuantitatif )
Perbedaan :
ALT : menghitung jumlah koloni bakteri pada media pelat ( cawan petri )
APM : memperkirakan jumlah koloni bakteri berdasarkan adanya gas pada
tabung Durham ( tabung reaksi )
3. Apakah yang menjadi kelemahan kedua percobaan di atas ?
Jawab :
ALT :
- Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel mikroba yang
sebenarnya karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk
satu koloni.
- Medium dan kondisi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai yang
berbeda.
- Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat
dan membentuk koloni yang kompak dan jelas, tidak menyebar.
- Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi beberapa hari, sehingga
pertumbuhan koloni dapat dihitung.
- Hanya dapat dipakai untuk menghitung populasi mikroba dengan
aktivitas spesifik.
- Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya,
karena hanya merupakan angka pendekatan.
4. Bagaimana cara perhitungan koloni bakteri pada bahan yang berbentuk
padat ?
Jawab :
1. Penghitungan sel mikroba dengan metode langsung
2. Perhitungan total sel mikroba ( Direct Microscopic Count )
3. Perhitungan menggunakan Counting Chamber
Jumlah sel dalam suatu populasi dapat diukur dengan menghitung di
bawah mikroskop.
4. Perhitungan menggunakan membran filter
Pada metode ini digunakan membran filter yang berfungsi
untuk menyaring sel mikroba yang terdapat pada sampel. Arcidine
orange akan mewarnai mikroba danmemancarkan cahaya kuning atau
hijau sehingga sangat mudahuntuk dihitung dengan menggunakan
5. Mengapa perlu dipenuhi jumlah koloni 25 – 250 / cawan pada pengujian ALT
?
Jawab :
Supaya hasil perhitungannya tidak menimbulkan kesalahan statistik yang
serius. Jenis bakteri dapat mempengaruhi ukuran koloni dan jumlah koloni
yang tumbuh pada cawan. Selain itu, komposisi nutrisi dan jarak antar koloni
juga mempengaruhi jumlah koloni per cawan karena koloni tetangga mungkin
