MATERI DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Materi

MATERI DAN METODE

Tempat dan Waktu Penelitian

Proses sampling monyet ekor panjang (MEP) yang digunakan pada

penelitian ini terbagi atas dua periode sampling. Periode sampling pertama,

telah dilakukan pada bulan Agustus 2002 sampai September 2005, yang meliputi

kegiatan persiapan hewan penelitian dengan metode perfusi jaringan yang

dilakukan di Pusat Studi Satwa Primata (PSSP) Institut Pertanian Bogor.

Sedangkan periode sampling kedua, dilakukan untuk melengkapi sampel MEP

periode sebelumnya, yang dimulai dari bulan November 2006 sampai Juni 2007.

Adapun kegiatan pada periode tersebut meliputi proses pembuatan preparat

histologi dari jaringan hipofise dan kulit, pewarnaan histokimia, serta pengamatan

hasil penelitian. Kegiatan ini dilakukan di Laboratorium Riset Anatomi,

Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan,

Institut Pertanian Bogor.

Materi

Hewan penelitian

Penelitian ini menggunakan organ hipofise dan jaringan kulit yang diambil

di bagian kepala dan perut MEP. Hewan yang digunakan terdiri atas dua periode

sampel. Sampel periode pertama adalah pemanfaatan hasil sampling MEP yang

diperoleh dari Pusat Studi Satwa Primata Institut Pertanian Bogor. Adapun

tingkatan umur MEP periode pertama terdiri atas: fetus MEP umur 55 hari (F-55)

kebuntingan yang khusus digunakan untuk pengambilan kulit perut, fetus umur

70 hari (F-70), 85 hari (F-85), 100 hari (F-100), 120 hari (F-120) dan 150 hari

(F-150), serta anak umur 1 bulan (P-1) dan 3 bulan (P-3), dengan jumlah satu

ekor untuk setiap tingkatan umur. Pelaksanaan sampling dilakukan dibawah

pengawasan dan persetujuan Komisi Kesejahteraan Hewan (Animal Care and

Use Committee/ACUC) PSSP, LPPM-IPB nomor 02-0030IR.

Sampel periode kedua adalah pengambilan sampel MEP untuk

melengkapi tingkatan umur MEP dari sampel periode pertama, yang terdiri atas:

MEP anak umur 15 bulan (P-15), dewasa umur 50 bulan (P-50) dan 100 bulan

(P-100), dengan jumlah satu ekor untuk setiap tingkatan umur.

Sampel prenatal (fetus) dan postnatal (anak) dari sampel periode

pertama, berasal dari induk MEP yang ditangkap dari alam, yang terlebih dahulu

dikarantina untuk pemeriksaan status kesehatan dan ditempatkan pada kandang

individual. Untuk menentukan umur fetus secara akurat, seluruh induk MEP

dikawinkan dengan metode time mating. Siklus menstruasi MEP betina diamati

melalui teknik usap vagina sebelum dikawinkan. Pada penelitian ini hanya

induk-induk yang memiliki siklus menstruasi yang teratur saja yang dijadikan sebagai

indukan fetus. Induk betina yang terpilih, selanjutnya dipindahkan ke kandang

kawin. Masa subur induk betina ditandai dengan adanya sekresi lendir vagina

yang encer dan bening, kondisi ini biasanya terlihat pada hari ke-11 siklus

menstruasi. Saat betina memasuki masa subur, MEP jantan dimasukkan ke

kandang kawin untuk disatukan dengan induk betina selama 3 hari. Penentuan

hari ke-0 kebuntingan dihitung mulai dari hari ke-2 penggabungan dengan

standar deviasi satu hari. Proses sampling untuk sampel periode pertama

dilakukan oleh PSSP IPB.

Sampel periode kedua, merupakan hasil tangkapan dari alam, kemudian

di tempatkan di kandang individu dan diperiksa status kesehatan serta ditentukan

kisaran umurnya. Penentuan kisaran umur MEP, dilakukan berdasarkan hasil

pemeriksaan terhadap pertumbuhan dan pergantian gigi (Fortman et al. 2002).

Bahan penelitian

Untuk keperluan perfusi, fiksasi, dehidrasi dan parafinisasi jaringan,

secara berurutan digunakan paraformaldehid 0.2% dalam phosphate buffered

saline (PBS) 0.1 M pH 7.4; normal bufer formalin 10%, alkohol bertingkat, silol

dan parafin histoplast dengan titik leleh 56-57

o

_C.

Bahan untuk pewarnaan hematoksilin-eosin (HE) adalah pewarna

hematoksilin delafield, pewarna eosin dalam alkohol dan Entelan

®

_{. Untuk}

pewarnaan Masson’s trichrome (MT) modifikasi Goldner digunakan bahan

pewarna ponceau 2R, orange G dan lightgreen. Sedangkan untuk pewarnaan

imunohistokimia digunakan larutan PBS, aquades, larutan 3% hidrogen

peroksida, larutan 10% normal goat serum (Vector Laboratories, Inc), anti human

ACTH rabbit serum (1:750) (Gift. NIIDK, USA), 0.02 anti rabbit IgG goat serum

(Vector Laboratories, Inc), larutan 0.03% 3.3-Diaminobenzidine (DAB) dan

2% silan (3-aminopropyltrihexysilane/APES) dalam aseton. Sedangkan untuk

pewarnaan latar belakang digunakan pewarna hematoksilin.

Alat penelitian

Adapun alat-alat yang digunakan untuk perfusi dan fikasasi jaringan

terdiri atas 1 set pompa perfusi, jarum kupu-kupu, skalpel, gunting, tang arteri,

needle holder, pinset, spuit suntik, benang cat gut, tampon, gouce dan wadah

penyimpanan jaringan. Untuk proses parafinisasi dan pemotongan jaringan

digunakan gelas piala, inkubator, sliding microtome dan gelas objek. Untuk

pewarnaan HE alat yang digunakan adalah rak, gelas objek dan gelas penutup,

sedangkan kotak lembab, mikropipet dan timer digunakan untuk pewarnaan

imunohistokimia. Selanjutnya untuk pengamatan hasil penelitian digunakan

mikroskop cahaya dan mikrofotografi.

Metode

Pengambilan sampel periode pertama

Induk MEP yang positif bunting terlebih dahulu dibius dan dilakukan

laparotomi medianus untuk mengambil sampel fetus dari uterus. Selanjutnya,

fetus dibius secara intraumbilikal dengan pentobarbital (0.1 ml/kg bobot badan),

sedangkan anak MEP (P-1 dan P-3) dibius dengan anastetikum yang sama

dengan dosis 20 mg/kg bobot badan secara intraperitonial.

Dalam keadaan terbius, fetus MEP dikorbankan dengan cara

mengeluarkan darah secara intrakardial dengan teknik perfusi. Perfusi dilakukan

dengan menggunakan paraformaldehid 0.2% dalam PBS 0.1M, pH 7.4 pada

suhu 37

o

_{C dengan kecepatan antara 15-20 ml/menit sebagai pre-rinse,}

dilanjutkan dengan larutan fiksatif 2% paraformaldehid dalam PBS 0.1M, pH 7.4

dengan suhu 4

o

_{C selama 20 menit pada kecepatan yang sama.}

Perfusi intrakardial terhadap sampel MEP, dilakukan dalam kondisi

hewan terbius, yaitu dengan cara membuka rongga dada, aorta torakalis dijepit

dengan penjepit arteri, kemudian jarum kupu yang telah dihubungkan dengan

pompa perfusi dimasukkan ke dalam ventrikel kiri jantung. Setelah jantung

membesar akibat terisi larutan pre-rinse, atrium kanan disayat agar darah dan

larutan perfusi dapat keluar dari jantung. Apabila larutan perfusi yang keluar

telah jernih, maka larutan perfusi diganti dengan larutan fiksatif paraformaldehid

4% dalam PBS, suhu 4

o

_{C selama 20 menit. Setelah proses perfusi selesai,}

selanjutnya diambil jaringan hipofise dan kulit, yaitu kulit di bagian kepala dan

perut (khusus F-55, untuk pengamatan terhadap perkembangan kulit), dengan

ukuran 0.5 cm

2

_{untuk setiap tingkatan umur MEP. Seluruh sampel jaringan,}

selanjutnya difiksasi dengan larutan paraformaldehid 4%. Sebagai stopping

point, sampel organ dimasukkan ke dalam larutan alkohol 70%.

Pengambilan sampel periode kedua

Sampel periode kedua, terdiri atas seekor anak MEP umur 15 bulan

(P-15) dan dua ekor MEP dewasa (P-50 dan P-100), masing-masing dibius

dengan menggunakan anastetikum zoletil

®

_{dosis 10 mg/kg bobot badan secara}

intramuskular. Dalam kedaan terbius, hewan dikorbankan dengan cara membuka

rongga dada untuk mengeluarkan darah dari jantung. Setelah darah keluar

seluruhnya, dibuka tulang tengkorak untuk mengambil jaringan hipofise. Selain

hipofise, diambil pula jaringan kulit kepala berukuran 0.5 cm

2

_{. Jaringan hipofise}

dan kulit yang diperoleh, dibilas dengan larutan NaCl fisiologis sebelum

dimasukkan ke dalam larutan paraformaldehid 4% selama 24 jam. Sebelum

dimasukkan ke dalam alkohol 70% sebagai stopping point, jaringan dimasukkan

ke dalam larutan asam pikrat tanpa larutan asam asetat glasial selama 3 jam.

Proses pembuatan blok parafin dan pemotongan preparat

Jaringan hipofise dan kulit dimasukkan ke dalam tissue cassette sebagai

tahap awal untuk proses dehidrasi. Sampel jaringan direndam secara berurutan

di dalam larutan alkohol 70%, 80%, 90% dan 95 % masing-masing selama 6 jam

pada suhu kamar, diikuti dengan perendaman dalam larutan alkohol 100%

(1, 2, 3), masing-masing selama 1 jam pada suhu kamar. Proses penjernihan

(clearing) dilakukan dengan larutan silol (1, 2, 3), masing-masing selama

30 menit. Selanjutnya dilakukan proses infiltrasi larutan paraffin dengan tiga kali

pemindahan masing-masing selama 30 menit pada suhu 67

o

_{C. Proses}

selanjutnya adalah pembuatan blok parafin dengan cara merendam jaringan ke

dalam parafin cair dan didinginkan dalam suhu kamar.

Blok parafin jaringan hipofise dari sampel periode pertama dan kedua,

disayat dengan menggunakan sliding microtom dengan ketebalan 10 µm secara

serial dengan berpedoman kepada teknik pembagian daerah pemotongan

hipofise babi (Sasaki et al. 1992). Teknik pemotongan ini dimaksudkan untuk

menujukkan gambaran hipofise secara utuh tanpa harus mewarnai seluruh

sayatan. Sedangkan pemotongan blok jaringan kulit dari sampel periode

pertama dan kedua, dilakukan dengan penyayatan blok secara transversal,

dengan ketebalan 5 µm untuk pewarnaan HE dan MT, serta 10 µm untuk

pewarnaan IHK. Selanjutnya, sayatan jaringan yang diperoleh diletakkan pada

gelas objek yang sebelumnya telah dilapisi (coating) dengan silan

(aminopropyltriehoxysilane/APES), dan ditetesi dengan aquades di atas hot-plate

dengan suhu 37

o

_{C. Setelah kering, gelas objek diinkubasikan pada suhu 37}

o

_C

selama satu malam. Sedangkan untuk keperluan pewarnaan HE dan MT, gelas

objek tidak dilapisi dengan silan.

1

3

2

Gambar 13 Pembagian daerah pemotongan hipofise pada babi. Potongan a, b dan c adalah daerah medial, paramedial dan lateral. 1: neurohipofise, 2: pars intermedia, 3: adenohipofise (Sasaki et al. 1992).

Pewarnaan hematoksilin-eosin, Masson’s trichrome dan imunohistokimia

Sayatan jaringan hipofise dan kulit pada gelas objek selanjutnya

memasuki tahap deparafinisasi dan rehidrasi. Setelah kedua tahap tersebut,

dilakukan proses pewarnaan dengan metode hematoksilin-eosin (HE) (Humason

1967), Masson,s trichrome (MT) modifikasi Goldner (Kiernan 1990) dan

imunohistokimia (IHK) metode avidin-biotin-peroxidase complex (ABC method)

(Hsu et al. 1981). Metode pewarnaan HE dan MT digunakan untuk mengamati

morfologi dan identifikasi sel-sel penyusun PI dan perkembangan buluh darah

dan jaringan ikat secara histologis, sedangkan dengan metode pewarnaan IHK

dapat diketahui perkembangan dan distribusi sel-sel ir-ACTH-MSH di PI serta

aksis antara sel-sel ir-ACTH-MSH PI hipofise dengan melanogenesis pada

melanosit di epidermis dan folikel rambut kulit MEP.

Pewarnaan IHK diawali dengan proses deparafinisasi dan rehidrasi,

kemudian jaringan dibilas tiga kali dengan aquades masing-masing 5 menit.

Aquades yang berada disekitar jaringan pada gelas objek dikeringkan

menggunakan kertas tisu, selanjutnya jaringan dilingkari dengan pena parafin,

gelas objek diletakkan pada posisi mendatar di dalam kotak lembab. Jaringan

diteteskan 3% hidrogen peroksida dalam aquades selama 15 menit pada suhu

kamar. Selanjutnya jaringan pada gelas objek diinkubasikan dengan 10%

normal goat serum (Vector Laboratories, Inc) selama 30 menit pada suhu kamar.

Tahap berikutnya, jaringan pada gelas objek diinkubasikan dengan anti human

ACTH rabbit serum dengan pengenceran 1 : 750 selama 1 malam pada suhu

4

o

_{C. dan diinkubasikan dengan antibodi sekunder, yaitu 0.02% anti rabbit IgG}

goat serum (Vector Laboratories, Inc) selama 30 menit pada suhu 37

o

_{C. Sebagai}

marker digunakan campuran 10 µl avidin dan 10 µl biotin (Vector Laboratories,

Inc) dalam 1 ml PBS. dan diinkubasikan di dalam inkubator dengan suhu 37

o

_C

selama 30 menit. Untuk visualisasi hasil pewarnaan, jaringan diinkubasikan

dengan larutan 0.03% 3.3-diaminobenzidine (DAB) selama 20 menit sambil

diamati di bawah mikroskop, selanjutnya dibilas dengan PBS.

Untuk pewarnaan latar belakang, digunakan pewarna hematoksilin.

Selanjutnya dilakukan dehidrasi dan clearing jaringan, lalu ditutup dengan gelas

penutup (cover glass) dengan menggunakan bahan perekat Entelan

®

_.

Pengamatan

Pengamatan hasil pewarnaan terhadap jaringan hipofise, meliputi:

anatomi dan perkembangan PI hipofise MEP, perkembangan buluh darah dan

jaringan ikat, serta perkembangan dan distribusi sel-sel ir-ACTH-MSH PI

hipofise. Sedangkan pengamatan terhadap kulit meliputi: anatomi dan

perkembangan struktur kulit MEP, perkembangan melanogenesis di epidermis

dan folikel rambut serta aksis sel-sel ir-ACTH-MSH PI hipofise - melanosit kulit

MEP.

Untuk mendeteksi sel-sel ir-MSH di PI hipofise dan melanosit kulit MEP,

dilakukan secara tidak langsung, yaitu melalui reaksi yang terjadi antara anti

human ACTH rabbit serum dengan ACTH. Teknik ini dapat dilakukan, karena

ACTH merupakan prekursor α-MSH, baik di sel-sel melanotrop PI maupun di

melanosit kulit.

Analisis Hasil

Pengamatan kepadatan (densitas) sel dan intensitas warna yang

dihasilkan pada pewarnaan HE dan IHK, buluh darah dan jaringan ikat pada

pewarnaan MT, dilakukan dengan metode skoring. Adapun kriteria pemberian

skor terhadap densitas sel-sel asidofil dan basofil, buluh darah dan jaringan ikat

PI hipofise serta sel-sel ir-ACTH-MSH, berkisar antara negatif (-) untuk sel yang

tidak teramati, positif satu (+) untuk densitas jarang, sampai dengan positif empat

(++++) untuk densitas terpadat. Sedangkan kriteria skor untuk intensitas

pewarnaan pada distribusi sel-sel ir-ACTH-MSH PI hipofise, berkisar antara

negatif (-) untuk warna yang tidak dihasilkan, positif satu (+) untuk intensitas

sangat lemah sampai dengan positif empat (++++) untuk intesitas sangat kuat.

Adapun data mengenai anatomi dan perkembangan struktur kulit MEP serta

aksis sel-sel ir-ACTH-MSH PI - melanosit kulit MEP diolah secara deskriptif.