PENGEMBANGAN KANDIDAT SENYAWA OBAT TURUNAN
NAFTOKUINON SEBAGAI INHIBITOR VIRUS HEPATITIS B
Firdayani1∗, Rilianawati1, Susi Kusumaningrum1, Mutia Hardhiyuna1, Siska Andrina Kusumastuti1, Asep Saepudin1, Pertamawati1, Hasan1, Kara Fabiola1, Harry Noviardi1, Didin Mujahidin2,
Rukman Hertadi2, dan Muhammad Ali Zulfikar2 1Pusat Teknologi Farmasi dan Medika, Dep.Bid TAB - BPPT Gedung II BPPT Lantai 15 Jl. MH. Thamrin 8, Jakarta Pusat 10340
2Departemen Kimia Institut teknologi Bandung Jl. Ganeca 10 Bandung
∗
e-Mail: firdayani@bppt.go.id, telp: (021) 3169505 Disajikan 29-30 Nop 2012
ABSTRAK
Usaha penemuan dan pengembangan obat baru pada umumnya bersifat coba-coba (trial and error) sehingga dibutuhkan biaya yang besar dan waktu yang lama. Untuk itu perlu terobosan dan inovasi agar pengembangan dan penemuan obat tetap layak secara ekonomi antara lain dengan melakukan penelitian sejumlah kecil senyawa yang terpilih sebagai penuntun dan mer-ancangnya dengan lebih baik. Cara rasional yang dapat dilakukan antara lain melakukan pendekatan pengembangansenyawa yang telah ada, yang sudah diketahui struktur molekul dan aktivitas biologisnya, kemudian dilakukan modifikasi molekul atau mensintesis sejumlah turunannya. Dengan berkembangnya teknologi komputer, rancangan obat rasional mempunyai prospek yang cerah dalam pencarian obat baru. Dalam penelitian ini senyawa yang digunakan sebagai senyawa penuntun adalah turunan naftokuinon yang dari beberapa publikasi diketahui mempunyai aktivitas menghambat virus hepatitis B. Penelitian diawali dengan melakukan simulasi docking dan dinamika molekul senyawa-senyawa turunan naftokuinon menggunakan pe-modelan molekuler untuk memprediksi interaksinya dengan reseptor yang bertanggungjawab dalam pertumbuhan dan replikasi VHB. Berdasarkan hasil simulasi, dipilih derivat yang potensial untuk selanjutkan dilakukan semisintesis guna mendapatkan senyawa tersebut. Setelah dilakukan pemurnian dan konfirmasi struktur hasil sintesis, derivat-derivat tersebut diujikan aktivi-tasnya membunuh atau menghambat replikasi VHB secara in vitro. Data-data yang diperoleh selanjutnya dianalisa hubungan kuantitatif struktur aktivitasnya (HKSA) untuk memperoleh kepastian struktur senyawa terbaik sebagai kandidat senyawa inhibitor virus hepatitis B baru dari derivat naftokuinon.
Kata Kunci: Kandidat obat, turunan naftokuinon, virus hepatitis B
I.
PENDAHULUAN
Hepatitis B merupakan masalah kesehatan global, diperkirakan sekitar 2 miliar penduduk dunia pernah terpapar virus hepatitis B (VHB). Angka prevalensi in-feksi VHB di Asia Pasifik cukup tinggi yaitu melebihi 8% dan penularannya pada umumnya terjadi secara vertikal (pada periode perinatal) dan horizontal (pada masa anak-anak) oleh karena itu risiko menjadi kronis cukup besar. Diperkirakan lebih dari 350 juta di an-taranya menjadi kronis yang berisiko tinggi meninggal dunia akibat penyakit hati kronis. Sekitar 75% pengi-dap hepatitis B kronis karier berada di Asia Pasifik. Pada saat ini sekitar 1 juta kematian per tahun akibat penyakit hati berhubungan dengan VHB. Sirosis hati, gagal hati, atau kanker hati dapat terjadi pada 15 ∼40% penderita dengan infeksi hepatitisB kronis. Di negara
berkembang orang dewasa sangat berisiko tinggi untuk terkena hepatitis B. Terlebih di negara miskin dengan endemis tinggi, hepatitis B cukup banyak ditemukan pada anak-anak. Oleh sebab itu, tingginya morbiditas dan mortalitas akibat hepatitis B, penyakit ini sangat mengancam dunia.
Prevalensi infeksi HBV berbeda-beda di seluruh dunia. Kategori daerah endemis terbagi menjadi ren-dah, sedang, dan tinggi. Indonesia masuk dalam kelompok prevalensi sedang sampai tinggi. Data Or-ganisasi Kesehatan Dunia, WHO, menyatakan virus hepatitis B 50∼100 kali lebih menular daripada virus yang menyerang sistem imunitas, HIV. Penularan-nya terjadi lewat darah dan cairan tubuh.Kelompok berisiko tinggi adalah anak yang dilahirkan oleh ibu dengan virus HbsAg, virus penanda adanya hepatitis
positif.[1]
Tujuan utama pengobatan hepatitis B kronis adalah untuk mengeliminasi atau menekan secara permanen proses replikasi virus yang akan mengurangi pato-genitas serta infektivitas dan pada akhirnya dapat menghentikan atau mengurangi keradangan hati se-hingga progresivitas menjadi sirosis dan kanker hati da-pat dicegah.
Obat-obatan yang dipakai untuk hepatitis B kronis ada dua pilihan.Pilihan pertama yaitu obat yang dapat menekan replikasi virus sekaligus untuk memodulasi sistem imun penderita, yang dikenal dengan nama terferon. Yang sekarang dipakai adalah pegylated in-terferon yang memberikan hasil memuaskan. Keun-tungan obat ini dapat menekan replikasi virus dalam jumlah yang besar, lama pemakaian tertentu (6 bu-lan sampai1 tahun), relatif aman, dan ditoleransi baik oleh pasien yang sudah mengalami sirosis khususnya yang masih terkompensasi. Namun harga obat ini masih cukup mahal. Pilihan kedua adalah dari golon-gan analog nukleosida yang dapat menekan replikasi virus. Diantaranya adalah lamivudine, adefovir, ente-cavir dan masih dalam tahap ujicoba adalah telbivu-dine dan tenofovir. Pemakaian obat-obat ini relatif lebih lama (lebih dari 1 tahun) dan dapat terjadi resistensi virus hepatitis B terhadap obat tersebut, khususnya lamivudine yang mencapai angka 70% setelah pemaka-ian 5 tahun.
Angka keberhasilan terapi hepatitis B kronis dengan menggunakan obat-obatan golongan nukleosida yang kini beredar masih di bawah 20%. Hingga kini belum dipasarkan obat dari golongan nonnukleosida. Dengan demikian, masih diperlukan usaha dan penelitian un-tuk mencari dan menemukan obat baru unun-tuk men-gatasi penyakit akibat virus hepatitis B ini.
Usaha penemuan dan pengembangan obat baru pada umumnya bersifat coba-coba (trial and error) sehingga dibutuhkan biaya yang besar dan waktu yang lama. Untuk itu perlu terobosan dan ino-vasi agar pengembangan dan penemuan obat tetap layak secara ekonomi. Dalam upaya merancang dan mengembangkan obat baru untuk penyakit infeksi VHB ini, langkah awal yang dilakukan antara lain de-ngan mengembangkan kandidat obat yang telah ada, yang sudah diketahui struktur molekul dan aktivi-tas biologisnya, untuk dijadikan sebagai senyawa pe-nuntun atas dasar penalaran yang sistematik dan ra-sional dengan mengurangi faktor coba-coba semini-mal mungkin. Teknik-teknik komputasional yang di-gunakan dalam desain obat berbasis struktur menjadi teknik yang efisien untuk pengembangan dan optimasi senyawa obat agar menghasilkan obat yang lebih poten. Selain itu teknik ini dapat memberikan gambaran dan prediksi yang lebih detail tentang mekanisme aksi suatu obat dalam mengatasi suatu penyakit.
Telah diketahui bahwa senyawa yang terkandung dalam produk alami mempunyai potensi untuk dikem-bangkan sebagai obat. Dengan berkembangnya tek-nologi komputer, rancangan obat rasional mempunyai prospek yang cerah dalam pencarian obat baru. Dengan bantuan program pemodelan dan dinamika molekul, dan telah diketahui sruktur molekul tiga dimensi enzim sebagai reseptor target, akan dapat diketahui cara kerja obat pada tingkat molekul dan peran berbagai keku-atan sifat fisika dan kimia pada proses interaksi obat-reseptor.[7]
Dalam riset terapan ini dipilih senyawa 1,4-nafokuinon sebagai senyawa penuntun untuk dikem-bangkan sebagai kandidat senyawa obat untuk infeksi VHB. Berdasarkan literatur diketahui beberapa turunan senyawa ini mempunyai aktivitas yang luas antara lain sebagai antikanker, antifungal, antibakteri dan antivi-ral. Crosby et al.(2011) menemukan bahwa derivat naftokuinon yang berbentuk trimer mempunyai ak-tivitas antivirus hepatitis B dengan EC50sebesar 0,009
µM dan senyawa kecil monomernya juga menghambat bahkan terhadap virus yang resistant terhadap analog nukleosida golongan cytidine (3TC).[8]
Berbagai macam kemungkinan turunan naftokuinon hasil modifikasi digambar dan diprediksi kemungki-nannya sebagai inhibitor VHB secara in silico. Senyawa naftokuinon dan turunannya ini kemudian disintesis dan diuji aktivitas penghambatannya secara in vitro ter-hadap enzim glikohidrolase dan reverse-transkriptase serta terhadap kultur sel hati yang telah terinfeksi virus hepatitis B. Hasil pengujian selanjutnya dianalisa hubungan kuantitatif struktur dengan aktivitas untuk melihat sifat kimia fisika yang berperan, substituen atau gugus yang memberikan aktivitas dan memprediksi senyawa dengan struktur ”terbaik” sebagai kandidat senyawa antivirus hepatitis B turunan naftokuinon. De-ngan demikian kegiatan riset ini merupakan inovasi dalam penemuan obat dimana dilakukan kombinasi an-tara kegiatan komputasi dengan laboratorium. Dalam riset ini dikurangi faktor coba-coba untuk mendap-atkan obat baru sebagai antivirus hepatitis B sehingga menghemat biaya dan waktu yang biasa diperlukan un-tuk pengembangan obat.
II.
METODOLOGI
• Simulasi dengan pemodelan molekular senyawa-senyawa derivat naftokuinon dalam berinteraksi dengan reseptor target secara komputasi dilakukan menggunakan program Autodock vina dan Am-ber.
• Senyawa terpilih disintesis dalam beberapa tahap, senyawa hasil sintesis dimurnikan dengan khro-matografi atau rekristalisasi dan dianalisa sifat fisikokimianya. Konfirmasi dan identifikasi struk-tur senyawa hasil sintesis dengan metoda khro-matografi dan spektrofotometri antara lain dengan GS-MS, LC-MS, FTIR dan NMR.
• Pengujian aktivitas menghambat enzim gliko-hidrolase dan reverse transcriptase dari naftokuinon dan derivatnya menggunakan metode spektrometri.
• Analisis hubungan kuantitatif struktur - aktivitas untuk mengetahui sifat fisikokimia yang berperan dan mekanisme aksi dalam aktivitas menghambat replikasi virus hepatitis B serta menentukan struk-tur ideal struk-turunan naftokuinon sebagai kandidat an-tivirus.
III.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Telah dilakukan simulasi docking dengan ligan naftokuinon dan turunan-turunannya ke dalam reseptor-reseptor target protein atau enzim yang berperan dalam proses replikasi virus hepatitis B yaitu: HBx, glikohidrolase dan reverse transcriptase. Hasil simulasi docking ke dalam reseptor target antivirus hepatitis B tertera padaTABEL1.
Adapun pola interaksi antara senyawa 2HNDIG dengan reseptor-reseptor tersebut dapat dilihat pada
GAMBAR1,GAMBAR2danGAMBAR3.
Simulasi dinamika ligan 2HNDIG dalam enzim re-verse transcriptase menunjukkan terjadinya pelemahan ikatan yang diakibatkan respon reseptor.
Dari gambar di atas dapat terlihat bahwa interaksi ligan-reseptor terdiri dari tiga ikatan hidrogen (ngan Lys350 dan Tyr336) dan interaksi hidrofobik de-ngan 3 residu asam amino (His96, Trp266, dan Lys353). Sedangkan pola interaksi setelah simulasi dinamika molekul ditunjukkan padaGAMBAR5.
Hasil simulasi dinamika menunjukkan pengurangan ikatan hidrogen dan penambahan jumlah residu-residu yang berinteraksi hidrofobik. Pengurangan jumlah ikatan hidrogen ini berperan dalam pelemahan inter-aksi ligan-reseptor. Senyawa terpilih selanjutnya disin-tesis dan dikonfirmasi strukturnya pada tiap-tiap tahap. Pada tahun pertama ini sintesis yang telah dilakukan belum sampai pada senyawa diharapkan, melainkan baru diperoleh senyawa antara/ intermedietnya antara
GAMBAR1: Pola interaksi 2HNDIG dengan protein HBx
GAMBAR2: Pola interaksi 2HNDIG dengan enzim glukohidrolase
lain 2-hidroksi-3-bromo-1,4-naftokuinon yang dihasil-kan dari reaksi brominasi 2-hidroksi-1,4-naftokuinon.
Untuk mengetahui hubungan kuantitatif struktur-aktivitas, dilakukan uji aktivitas penghambatan be-berapa senyawa turunan naftokuinon terhadap en-zim yang berperan dalam replikasi virus mengguna-kan metode spektrofotometri UV/visual. Pada peneli-tian ini, dilakukan uji penghambatan virus hepati-tis B terhadap enzim α dan β-glukosidase menggu-nakan senyawa turunan naftokuinon dengan metode in vitro enzimatis. Uji ini didasarkan pada reaksi substrat enzim yang akan menghasilkan produk p-nitrophenyl. Produk ini akan menghasilkan warna kekuningan yang kemudian diukur dengan spektro-fotometri dengan panjang gelombang 400nm. Sema-kin bening suatu larutan maka semaSema-kin aktif sam-pel tersebut menghambat enzim α-glukosidase dan β-glukosidase.
GAMBAR3: Pola interaksi 2HNDIG dengan enzim reverse
tran-scriptase
GAMBAR4: Pola interaksi senyawa 2HNDIG dengan reverse
tran-skriptase sebelum simulasi dinamika
Berdasarkan data di atas, diketahui bahwa turunan naftokuinon mempunyai potensi sebagai penghambat enzim yang terlibat dalam replikasi virus antara lain α-glukosidase dan β-glukosidase. Enzim-enzim ini merupakan penyusun enzim glikohidrolase, yaitu
en-GAMBAR5: Pola interaksi senyawa 2HNDIG dengan reverse
tran-scriptase setelah simulasi dinamik
TABEL2: Nilai IC50 senyawa turunan naftokuinon terhadap enzim
α- dan β-glukosidase
zim yang berperan dalam pembentukan amplop virus-dan bertanggung jawab terhadap glikohidrolasi pro-tein. Virus Hepatitis B merupakan salah satu virus be-ramplop yang terdiri dari membran lipid yang dibtuk dari sel inang yang terinfeksi. Penghambatan en-zim glikohidrolase dapat menghambat pembentukan amplop virus hepatitis B sehingga replikasi virus men-jadi tidak sempurna dan pada akhirnya virus akan mati. Dari data penghambatan enzim -glukosidase derivat naftokuinon dilakukan analisis HKSA yang melibatkan parameter-parameter fisika kimia yang diperoleh dari perhitungan teoritis. Data-data tersebut diolah dengan regresi linear dan non linear menggunakan program
SPSS sehingga didapat persamaan HKSA yang akan mengetahui parameter yang mempunyai hubungan de-ngan aktivitas. Beberapa persamaan diperoleh meli-batkan sifat hidrofobik dan sterik dalam aktivitas an-tikanker turunan naftokuinon adalah sebagai berikut:
Log 1 IC50 = 0, 03M R − 2, 61 (1) R2= 0, 497 F = 4, 946 s = 0, 546 Log 1 IC50 = 0, 02M R − 1, 85 (2) R2= 0, 545 F = 5, 995 s = 0, 519 Log 1 IC50 = −0, 58ClogP + 0, 01CM R − 2, 91 (3) R2= 0, 797 F = 7, 830 s = 0, 389 Log 1 IC50 = 0, 045logP2− 0.048logP − 1, 084 (4) R2= 0, 436 F = 1, 548 s = 0, 650 Log 1 LC50 = −0, 079logP2− 0, 048logP − 1, 084 (5) R2= 0, 436 F = 1, 548 s = 0, 650 − Log 1 LC50 = −0, 08ClogP2 0, 373ClogP − 2, 365 (6) R2= 0, 677 F = 4, 189 s = 0, 490 Log 1 LC50 = 0, 031logP2+ 0, 222logP + 0, 032M R − 3, 155 (7) R2= 0, 982 F = 55, 415 s = 0, 132 Berdasarkan hasil analisa hubungan kuantitatif struktur-aktivitas tersebut terlihat bahwa parameter hidrofobik logP dan sterik M R mempunyai peranan dalam aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase pada tu-runan naftokuinon. Persamaan tersebut, terutama
PERS. (7) yang memiliki parameter statistik optimal, dapat digunakan untuk merancang struktur turunan naftokuinon yang berpotensi antivirus dengan aktivitas maksimal.
IV.
KESIMPULAN
Desain struktur senyawa hasil simulasi docking dan dinamika dalam reseptor target memberi me-nunjukkan bahwa senyawa 2HNDIG memiliki potensi menjadi kandidat obat turunan naftokuinon sebagai in-hibitor virus hepatitis B. Hingga saat ini proses sintesis
senyawa ini masih dalam tahap pengerjaan dan telah dihasilkan beberapa senyawa intermediet Sementara itu, untuk mengetahui hubungan struktur naftokuinon dengan aktivitas antivirus telah dilakukan uji peng-hambatan terhadap enzim alfa dan beta glukosidase de-ngan metode spektrofotometri. Pada tahun berikutnya disarankan untuk melanjutkan sintesis hingga diper-oleh senyawa yang diinginkan dan dilakukan optimasi kondisi-kondisi prosesnya. Senyawa yang dihasilkan selanjutnya diuji aktivitas inhibisi virus secara in vitro menggunakan sel yang telah ditransfeksi plasmid DNA virus hepatitis B.
DAFTAR PUSTAKA
[1] World Health Organization,
Hep-atitis B. World Health
Organiza-tion Fact Sheet no. 2004. available at http://who.int/mediacentre/factsheets/fs204/en [2] Lafanchy D., Hepatitis B Virus epidemiology, dis-ease burden, treatment,and current and emerging prevention and control measures, J. Viral Hepat. 2004;11:97-107.
[3] Lok A.S., Chronic Hepatitis B. N. Engl. J. Med. 2002;346:1682-3.Hou J, Liu Z, Gu F. Epidemiology and Prevention of Hepatitis B Virus Infection, Int. J. Med. Sci. 2005:2;50-57.
[4] PPHI, Konsensus Penatalaksanaan Hepatitis B Kronik, 2003.
[5] Hernomo K., Perkembangan baru pengobatan hepatitis virus B, Simposium Perkembangan Mu-takhir di Bidang Gastro-hepatologi, Surabaya, 23 Oktober 1999.
[6] Hernomo K, Perkembangan baru dalam penata-laksanaan hepatitis virus B dan C, Pekan ilmiah dalam Acara Peringatan 12 Tahun RS Pupuk Kaltim, Bontang, Kaltim, 10 Agustus 2002. Dalam website:http://www.pgh.or.id
[7] Siswandono, B. Soekardjo, Kimia Medisinal 1, Air-langga University Press, Surabaya
[8] Crosby, et al., Antiviral agents 3. Discovery of a novel small molecule non-nucleoside inhibitor oh Hepatitis B Virus (HBV), Bioorganic & Medicinal Chemistry 21, 2011: 1644-1648
