BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Sintesis BCP dan ACPSintesis BCP dan ACP dilakukan dengan metode yang berbeda, dengan bahan dasar yang sama yaitu CaO dan (NH4)2HPO4. CaO bersumber dari cangkang telur ayam yang telah dikalsinasi 1000o C selama 5 jam berdasarkan penelitian Nurleila et al.10 Proses kalsinasi bertujuan untuk menghilangkan fase karbonat (CO3) dalam cangkang telur yang memiliki kandungan CaCO3 sebesar 94-97% sehingga menjadi CaO.
Penentuan fase pada pola XRD yang diperoleh dibandingkan dengan data JCPDS (Joint Committee on Powder Diffraction Standards) dengan nomor 09-0432 untuk HA, nomor 09-0169 untuk TCP, dan nomor 35-0180 untuk apatit karbonat tipe A (AKA) (Lampiran 7). Pendekatan HA dan TCP digunakan untuk penentuan fase sampel BCP karena BCP mempunyai dua fase yaitu HA dan TCP sedangkan AKA untuk penentuan pola XRD hasil dari sampel ACP.
Sintesis BCP menggunakan metode hidrotermal mengacu pada penelitian Fajriyah27 dengan perbandingan molaritas Ca/P 1,67, 1 M CaO dan 0,6 M (NH4)2HPO4. Hasil karakterisasi XRD pada sampel BCP menunjukkan kedua fase dari HA dan TCP sudah terbentuk dengan derajat kristalinitas yang dimiliki sampel BCP ini sebesar 77,90% (Lampiran 13). Tabel 1 dan Tabel 2 merupakan nilai sudut 2θ yang dimiliki oleh fase BCP dan ACP berturut-turut dengan pola XRD ditunjukkan pada Gambar 9 dan Gambar 10.
Tabel 1 Nilai 2θ pada fase BCP
Puncak fase TCP terletak pada 2θ Puncak fase HA terletak pada 2θ 13,70 31,78 17,09 32,24 25,85 32,90 27,91 39,83 31,11 48,13 32,57 53,04 47,12
Tabel 2 Nilai 2θ pada fase ACP
Puncak fase AKA terletak pada 2θ Puncak fase HA terletak pada 2θ 25,93 28,24 32,19 28,88 39,65 34,15 46,67 49,55
ACP merupakan fase amorf dari kristal apatit HA. Sintesis ACP menggunakan metode presipitasi suhu rendah mengacu pada penelitian Laeny28 dengan perbandingan Ca/P sebesar 1,67. Laeny menggunakan beberapa perbandingan molaritas yaitu 1:0,6, 0,5:0,3, dan 0,1:0,06. Perbandingan molaritas yang digunakan pada penelitian ini adalah 0,1 M CaO dan 0,06 M (NH4)2HPO4. Perbandingan molaritas ini digunakan karena pada penelitian Laeny menghasilkan derajat kristalinitas yang paling rendah yaitu sebesar 14,39%.
Hasil sintesis ACP yang diperoleh pada penelitian ini memiliki derajat kristalinitas yang cukup tinggi yaitu sebesar 62,57% (Lampiran 8). Pada proses pengeringan sampel dengan metode freeze drying, Laeny menggunakan freeze drying dalam proses pengeringan selama 1x24 jam sedangkan dalam penelitian ini freeze drying selama 2x24 jam.
Gambar 9 Pola difraksi XRD sampel BCP.
Gambar 10 Pola difraksi XRD sampel ACP
Hal ini menyebabkan fase amorf dari ACP bertransformasi menjadi fase kristal. Kristal yang terbentuk di antaranya adalah fase kristal HA dan fase apatit karbonat tipe A (AKA). AKA dapat terbentuk karena ion hidroksil (OH) digantikan oleh CO3. Hal ini dapat terjadi karena ACP masih memiliki pengotor seperti CO3 yang dapat mengganggu struktur dari ACP.14
Analisis sitotoksisitas bahan penambal gigi dilakukan melalui pengujian terhadap viabilitas sel fibroblas dengan metode MTT assay. BCP dan
ACP serbuk diuji dalam cell line NHDF yang merupakan prototype dari sel fibroblas pada pulpa gigi manusia.15 Sel yang telah dikultur kemudian dihitung konsentrasinya untuk membuktikan bahwa sel siap untuk dipanen. Konsentrasi sel hasil pengkulturan sel setelah 2 hari adalah 20,8×105 sel/ml diperoleh dari persamaan 3 dengan nilai A, B, C, D, dan E sebesar 11, 12, 11, 7, dan 11. Konsentrasi tersebut mencukupi untuk tahap inkubasi analisis MTT karena melebihi konsentrasi yang diinginkan yaitu 2×105 sel/mL (Tabel 1). Volume sel
11
yang diambil dari larutan sel adalah 1,73 ml dan penambahan medium sebesar 16,27 ml (Tabel 1). Medium dasar berfungsi sebagai media hidup dan nutrisi untuk sel.29
4.2 Pengujian Sitotoksisitas
Analisis sitotoksisitas bahan penambal gigi dilakukan melalui pengujian terhadap viabilitas sel fibroblas dengan metode MTT assay. BCP dan ACP serbuk diuji dalam cell line NHDF yang merupakan prototype dari sel fibroblas pada pulpa gigi manusia.15 Sel yang telah dikultur kemudian dihitung konsentrasinya untuk membuktikan bahwa sel siap untuk dipanen. Konsentrasi sel hasil pengkulturan sel setelah 2 hari adalah 20,8×105 sel/ml diperoleh dari persamaan 3 dengan nilai A, B, C, D, dan E sebesar 11, 12, 11, 7, dan 11. Konsentrasi tersebut mencukupi untuk tahap inkubasi analisis MTT karena melebihi konsentrasi yang diinginkan yaitu 2×105 sel/ml (Tabel 1). Volume sel yang diambil dari larutan sel adalah 1,73 mL dan penambahan medium adalah 16,27 ml (Tabel 1). Medium dasar berfungsi sebagai media hidup dan nutrisi untuk sel.27
Tabel 3 Konsentrasi dan volume kultur sel.
C2 (sel/ml) C1 (sel/ml) V2 (ml) V1 (ml) medium (ml) 2×105 20,8×105 18 1,73 16,27
Analisis sitotoksisitas menggunakan larutan MTT yang bersifat toksik dan berwarna kuning. Reaksi larutan MTT terhadap sel diindikasikan dengan perubahan warna yang menjadi hitam pekat, sedangkan pemberian larutan MTT pada blank tidak menyebabkan perubahan warna (tetap berwarna kuning seperti larutan MTT). Perubahan warna menjadi hitam merupakan terjadinya reduksi MTT menjadi formazan.20 Derajat kepekatan warna hitam sampel setelah pemberian MTT diukur dengan memanfaatkan prinsip absorbansi. Cahaya yang digunakan adalah warna merah 655 nm agar cahaya diteruskan pada sampel berwarna kuning (sampel blank) dan diserap pada sampel yang berwarna hitam (sampel yang mengandung sel). Tabel 2 menunjukkan data hasil pengukuran absorbansi dari spektrofotometer yang merupakan rata-rata dari 3 kali pengulangan untuk tiap hari waktu inkubasi.
Tabel 4 Absorbansi sel pada sel kontrol, sel dengan implan ACP, dan sel dengan implan BCP.
Waktu inkubasi (hari) Absorbansi (OD) Sel ACP BCP 1 2,61 2,221 2,376 2 0,837 0,718 1,807 3 0,714 1,282 1,103
Gambar 11 Viabilitas sel bedasarkan nilai absorbansi
Tabel 5 Viabilitas sel
Waktu inkubasi ( 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 N il ai A b so rb an si
Gambar 11 Viabilitas sel bedasarkan nilai absorbansi.
Viabilitas sel pada sampel dengan perlakuan waktu inkubasi yang berbeda
aktu inkubasi (hari) Sampel Viabilitas sel (%)
1 Sel (kontrol) 100,00 Sel+ACP 85,11 Sel+BCP 91,06 2 Sel (kontrol) 100,00 Sel+ACP 85,76 Sel+BCP 215,76 3 Sel (kontrol) 100,00 Sel+ACP 179,61 Sel+BCP 154,53 1 2 3
Waktu inkubasi (Hari)
sel (kontrol) ACP BCP yang berbeda. (%) sel (kontrol)
0 50 100 150 200 250 P e rs e n tas e ( % )
Gambar 12 Persentase viabilitas sel pada inkubasi 1, 2, dan 3
Hasil pengamatan viabilitas sel memperlihatkan adanya penurunan berdasarkan hasil absorbansi MTT dari kontrol dan sel yang telah diberi implan (persamaan 5). Hal ini disebabkan medium yang tersedia semakin berkurang sehingga nutrisi untuk sel bertahan hidup juga berkurang. Pada inkubasi hari pertama penambahan sampel ACP dan BCP tidak mempengar
Pada hari kedua inkubasi, BCP mampu mempertahankan viabilitas sel dua kali lipat dibandingkan dengan sel kontrol, sedangkan ACP masih belum mempengaruhi viabilitas sel. Pada hari ketiga kedua sampel dapat mempertahankan viabilitas sel d baik karena lebih dari 50% sel mampu bertahan dibandingkan dengan sel kontrol. Hal ini membuktikan bahwa sampel ACP dan BCP bersifat tidak toksik dan mampu mempertahankan viabilitas sel.
4.3 Karakterisasi SEM
Karakterisasi SEM digunakan untuk mengetahui morfologi sampel. Gambar 13a, 13b, dan 13c merupakan foto SEM pada sel NHDF tanpa penambahan bahan implan dengan waktu inkubasi 1, 3 dan 14 hari. Sel NHDF mempunyai struktur seperti bulatan kecil yang teratur da saling merekat satu dengan yang lainnya sehingga membentuk seperti tumpukan butiran yang saling melekat. Hari ke 3 dan 14 inkubasi tampak sel mulai berpolifersi
1 2 3
Waktu Inkubasi (Hari)
sel (kontrol) ACP BCP
Persentase viabilitas sel pada kontrol, sampel ACP, dan sampel BCP setelah waktu inkubasi 1, 2, dan 3 hari.
engamatan viabilitas sel ini memperlihatkan adanya penurunan berdasarkan hasil absorbansi MTT dari sel kontrol dan sel yang telah diberi implan ini disebabkan karena medium yang tersedia semakin berkurang sehingga nutrisi untuk sel bertahan hidup juga berkurang. Pada inkubasi hari pertama penambahan sampel ACP dan BCP tidak mempengaruhi viabilitas sel. Pada hari kedua inkubasi, BCP mampu mempertahankan viabilitas sel dua kali lipat dibandingkan dengan sel kontrol, sedangkan ACP masih belum mempengaruhi viabilitas sel. Pada hari ketiga kedua sampel dapat mempertahankan viabilitas sel dengan baik karena lebih dari 50% sel mampu bertahan dibandingkan dengan sel kontrol. Hal ini membuktikan bahwa sampel ACP dan BCP bersifat tidak toksik dan mampu mempertahankan viabilitas sel.
terisasi SEM
Karakterisasi SEM digunakan untuk mengetahui morfologi sampel. Gambar 13a, 13b, dan 13c merupakan foto SEM pada sel NHDF tanpa penambahan bahan implan dengan waktu inkubasi 1, 3 dan 14 hari. Sel NHDF mempunyai struktur seperti bulatan kecil yang teratur dan saling merekat satu dengan yang lainnya sehingga membentuk seperti tumpukan butiran yang saling melekat. Hari ke 3 dan tampak sel mulai berpolifersi
dan memproduksi matriks ekstra seluler sehingga bentuk sel sudah tidak jelas terlihat. Sel fibroblas merupakan sel pada jaringan ikat sehingga mampu membentuk kolagen.15
terbentuk dalam penelitian ini sudah memiliki derajat kristalinitas sebesar 62.57% sehingga sudah memiliki struktur kristal yang teratur seperti HA sedangkan BCP memiliki kristalinitas yang lebih tinggi sehingga memiliki struktur yang lebih teratur.
Gambar 14 dan 15 merupakan foto SEM sel dengan penambahan implan yaitu BCP (Gambar 14) dan ACP (Gambar 15). Pada hari pertama inkubasi bentuk butiran kristal BCP dan ACP masih jelas terlihat dan interaksi dengan sel juga sudah dapat terlihat, ditunjukkan dengan perlekatan yang hampir menutupi seluruh struktur ACP dan BCP. Morfologi sel dengan penambahan implan ACP dan BCP pada hari ke
menunjukkan hasil yang berbe
hari ke-3 inkubasi belum terlihat adanya perubahan morfologi seperti pada sel dengan implan BCP. Hal ini menunjukkan bahwa BCP lebih mudah berinteraksi dengan sel dibandingkan dengan ACP ditunjukkan pula dengan hasil absorbansi pada analisis sitotoksisitas, BCP pada hari ke-2 inkubasi dapat mempertahankan viabilitas sel dua kali lipat lebih besar dari pada sel kontrol dan sel dengan implan ACP. Selain itu, ACP dan BCP memiliki tingkat kelarutan yang berbeda. BCP 13
sel (kontrol)
BCP setelah waktu
matriks ekstra seluler29 sehingga bentuk sel sudah tidak jelas
fibroblas merupakan sel pada jaringan ikat sehingga mampu
15
ACP yang terbentuk dalam penelitian ini sudah memiliki derajat kristalinitas sebesar 62.57% sehingga sudah memiliki struktur kristal yang teratur seperti HA sedangkan ki kristalinitas yang lebih tinggi sehingga memiliki struktur yang Gambar 14 dan 15 merupakan foto SEM sel dengan penambahan implan yaitu BCP (Gambar 14) dan ACP (Gambar 15). Pada hari pertama inkubasi bentuk butiran kristal BCP dan ACP sih jelas terlihat dan interaksi dengan sel juga sudah dapat terlihat, ditunjukkan dengan perlekatan yang hampir menutupi seluruh struktur ACP dan BCP. Morfologi sel dengan penambahan implan ACP dan BCP pada hari ke-3 inkubasi menunjukkan hasil yang berbeda. ACP di 3 inkubasi belum terlihat adanya perubahan morfologi seperti pada sel dengan implan BCP. Hal ini menunjukkan bahwa BCP lebih mudah berinteraksi dengan sel dibandingkan dengan ACP ditunjukkan pula dengan hasil absorbansi otoksisitas, BCP pada hari 2 inkubasi dapat mempertahankan viabilitas sel dua kali lipat lebih besar dari pada sel kontrol dan sel dengan implan ACP. Selain itu, ACP dan BCP memiliki tingkat kelarutan yang berbeda. BCP
(a)
(a)
memiliki fase TCP yang tingkat kelarutannya lebih tinggi dari HA sehingga lebih cepat
berpolifersi dan mensekresi
kolagen atau membentuk makriks ekstraseluler.30 Sedangkan
membutuhkan waktu yang lebih lama
Gambar 13 Foto SEM dengan 20.000
Gambar 14 Foto SEM hari, dan (c
Gambar 15 Foto SEM (b) 3 hari (a)
(b)
(b) memiliki fase TCP yang tingkat
arutannya lebih tinggi dari HA4 sehingga lebih cepat berinteraksi dan
sekresikan protein atau membentuk makriks Sedangkan ACP membutuhkan waktu yang lebih lama
dibandingkan BCP untuk ber dan memproduksi matriks kolagen
Foto SEM setelah baik pada BCP maupun memperlihatkan terjadinya kolagen dan interaksinya implan (Gambar 14c dan
Foto SEM sel NHDF setelah inkubasi (a) 1 hari, (b) 3 hari 20.000 kali perbesaran.
Foto SEM sel NHDF dengan implan BCP setelah inkubasi c) 14 hari dengan 20.000 kali perbesaran.
Foto SEM sel NHDF dengan implan ACP setelah inkubasi (a) ri, dan (c) 14 hari dengan 20.000 kali perbesaran.
(b)
(c)
(c)
andingkan BCP untuk berpoliferasi sel duksi matriks kolagen.
inkubasi 14 hari maupun ACP semakin terjadinya matriks interaksinya dengan bahan
dan 15c).
ri, dan (c) 14 hari
BCP setelah inkubasi (a) 1 hari, (b) 3
setelah inkubasi (a) 1 hari, (c)
