sulphate juga dapat berguna sebagai biomaterial penghantar growth factor seperti VEGF. Pemberian VEGF dalam calcium sulfate dapat membantu proses regenerasi tulang melalui stimulasi proliferasi dan diferensiasi osteoblast serta sintesis kolagen tipe I yang dapat membantu regenerasi tulang yang mengalami defek.
Gambar 3.1. Bagan Kerangka Berpikir
Neovaskularisasi!
Stimulasi!Sel!MSC!
Sel!Osteoblast!
Stimulasi,!Proliferasi,!
Differensiasi,!Kemotaktik.!
Inhibisi!Apoptosis!
Pelepasan!ion!
Calcium!
Stimulasi!
sintesis!kolagen!
tipe!I!
Scaffold!
(calcium sulfate)!
VEGF!
infiltrasi!MSC!ke!
subperiosteal,!
diferensiasi!
osteoblastik!
Sel!Endotel!
S!Aktivasi!ILS1,!ILS6,!
TNF!serta!PAF.!
S!Aktivasi!reseptor!
FltS1!dan!FlkS1!untuk!
angiogenesis.!
Sekresi!EndothelinS1!
Aktivasi!jalur!
signaling!
intraseluler!
(PLCSPKA!
pathway)!
melalui!Calcium!
Channel!
!
!
Induksi!gen!
spesifik!osteoblast!
(NFSkB,!CoxS2!dan!
CREB)!!
!
3.2 Kerangka Konsep
Gambar 3.2. Bagan Kerangka Konsep Calcium Sulfate
FAKTOR INTERNAL
• Strain
• Usia
• Jenis kelamin
• Berat badan
• Hormonal
• Penyakit!
FAKTOR EKSTERNAL
• Nutrisi
• Aktivitas fisik
• Lingkungan!
Defek pada Tulang Femur Tikus yang dilakukan Bone Recycling dengan Nitrogen Cair!
Calcium Sulfate + VEGF
Bone0Healing0 Osteoblas!↑!
!!!!Kolagen!Tipe!I!↑!
!
Bone0Healing0 Osteoblas!!↑↑!
Kolagen!Tipe!I!↑↑!
! TIKUS!PUTIH!
: Variabel Kendali : : Variabel Bebas : : Variabel Tergantung
3.3 Hipotesis
1.! Pemberian VEGF dalam calcium sulfat meningkatkan jumlah sel osteoblast pada defek tulang yang telah dilakukan bone recycling dengan nitrogen cair.
2.! Pemberian VEGF dalam calcium sulfat meningkatkan ekspresi kolagen tipe I pada defek tulang yang telah dilakukan bone recycling dengan nitrogen cair.
BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini bertujuan membuktikan pemberian VEGF dalam calcium sulfate meningkatkan jumlah sel osteoblas dan kadar kolagen tipe I pada defek tulang yang telah dilakukan bone recycling dengan nitrogen cair. Penelitian ini dilakukan dengan rancangan randomized post-test only control group design.
Gambar 4.1 Skema Rancangan Penelitian P = populasi
S= Sampel R= randomisasi
P1= pemberian calcium sulfate
P2 = pemberian calcium sulfate dan VEGF
O1= data akhir kelompok defek tulang yang telah dilakukan bone recycling dengan nitrogen cair dan pemberian calcium sulfate
O2= data akhir kelompok defek tulang yang telah dilakukan bone recycling dengan nitrogen cair dan pemberian calcium sulfate disertai VEGF.
O1
P S R
P1
P2 O2
4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada dua tempat yaitu:
1.! Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedoteran Universitas Udayana, Bali, sebagai tempat perlakuan dan pemeliharan tikus.
2.! Laboratorium Patologi Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana sebagai tempat pemeriksaan histopatologis (jumlah osteoblas) dan pemeriksaan imunohistokimia (ekspresi kolagen tipe I)
Waktu dilaksanakan penelitian mulai bulan Juni 2016 sampai bulan Agustus 2016.
4.3 Penentuan Sumber Data 4.3.1 Populasi
Populasi pada penelitian ini adalah tikus (Wistar rat).
4.3.2 Sampel Penelitian dan Cara Pengambilan Sampel
Sampel dalam penelitian ini adalah tikus yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi.
4.3.2.1 Kriteria inklusi
a.! Tikus jantan jenis Wistar rat berumur 8-12 minggu.
b.! Berat 200-250 gram.
c.! Tikus bergerak aktif dan tidak pincang.
a.! Kriteria eksklusi: tikus sakit (gerakan tidak aktif) dan tidak mau makan saat penelitian.
b.! Kriteria drop-out: tikus mati saat penelitian.
4.4 Besar Sampel Penelitian
Perhitungan besar sampel menurut Federer (Supranto, 2000) (k-1)(r-1) > 15
(2-1)(r-1) > 15
1 (r-1) > 15 (r-1) > 15
r > 16
Dari perhitungan di atas didapatkan besar sampel minimal adalah 16. Dengan pertimbangan kelompok hewan coba ada yang dropout maka ditambahkan pada masing-masing kelompok 10% dari jumlah sampel minimal. Berdasarkan rumus di atas digunakan sampel sebanyak 16 + 10% (16) = 18 ekor hewan coba untuk tiap kelompok. Teknik pengambilan sampel digunakan cara Simple Random Sampling karena populasi relatif homogen.
4.5 Variabel Penelitian 4.5.1 Klasifikasi variabel
a.! Variabel bebas : pemberian VEGF dan pemberian calcium sulfate b.! Variabel tergantung : jumlah sel osteoblas dan jumlah kolagen tipe I
k : Jumlah macam perlakuan
r : Jumlah replikasi untuk tiap kelompok
lingkungan.
4.5.2 Definisi Operasional Variabel
a.! Calcium Sulfate : Bone graft yang berupa pellets dengan merk “PerOssals”
yang merupakan serbuk calcium sulfate alpha-hemihydrate (CaSO4 1/2H2O) yang dicampur dengan nanocrystalline hydroxiapatite (Ca10(PO4)6(OH)2) dengan rasio 48.5–51.5% (solid phase). Dengan ukuran masing - masing pellets 6x6 milimeter.
b.! VEGF : Recombinant Rat Vascular Endothelial Growth Factor 164 (VEGF) yang bersumber dari Mouse Myeloma cell line dengan Accession
#AAL07526.1 dengan nomer katalog 564-RV dan merek R&D Systems.
Dengan dosis 2 mikrogram per mililiter.
c.! Jumlah osteoblas (number of osteoblast per bone surface - N. OB/BS) adalah jumlah sel osteoblast yang ditemukan dalam mikroskop berbanding dengan luas permukaan tulang yang diperiksa dalam jumlah per millimeter (Dempster, et al., 2013).
d.! Kolagen tipe I adalah tipe serat kolagen yang menyusun sebagian besar matriks organik tulang yang diproduksi oleh osteoblas dan dikuantifikasi dari jaringan tulang menggunakan pemeriksaan immunohistokimia yaitu dengan anti-mouse collagen I antibody dan antibodi sekunder anti-mouse IgG/biotin yang telah dikonjugasikan dengan horseradish peroxidase.
(Bode, 2000; Bosetti dkk, 2002). Metode!yang!digunakan!untuk!menilai!
ekspresi!kolagen!tipe!I!pada!penelitian!ini!adalah!dengan!metode!semiS
pada! matrik! ekstraseluler.! Pengamatan! terhadap! adanya! ekspresi!
kolagen! I! pada! kalus! tulang! fraktur! dilakukan! pada! lima! lapang!
pandang.!Adapun!interprestasinya!adalah!sebagai!berikut:!!!
i.! Ekspresi ringan (mild): jika ditemukan adanya ekspresi kolagen terbatas pada 1 spikula.
ii.! Ekspresi sedang (moderate): jika ditemukan adanya ekspresi kolagen pada 1-5 spikula (woven bone).
iii.! Ekspresi padat (severe): jika ditemukan adanya ekspresi kolagen pada ˃ 5 spikula.
e.! Defek tulang femur tikus : adalah defek pada tulang femur tikus dengan ukuran panjang lebih dari 5 mm.
f.! Bone Recycling : prosedur rekonstruksi tulang dengan menggunakan nitrogen cair. Defek tulang femur tikus yang sudah di eksisi direndam dalam nitrogen cair dengan suhu -197°C selama 20 menit, kemudian didiamkan pada suhu ruangan selama 15 menit dan direndam pada cairan normal saline selama 10 menit. Kemudian dilakukan reimplantasi dan fiksasi dengan K- wire.
g.! Strain: adalah satu kumpulan binatang tikus yang memiliki kesamaan genetik. Pada penelitian ini digunakan strain Wistar Rat.
h.! Jenis kelamin: adalah jenis kelamin jantan yang diketahui dari ciri anatomis tikus.
i.! Umur: lama waktu hidup atau ada (sejak dilahirkan atau diadakan) yang diketahui dari dokumen tikus.
dan lain-lain yang diukur menggunakan timbangan merk “Tanita” dengan satuan kilogram.
k.! Makanan: segala bahan yang kita makan atau masuk ke dalam tubuh yang membentuk atau mengganti jaringan tubuh, memberikan tenaga, atau mengatur semua proses dalam tubuh. Diet normal tikus adalah pelet. Pelet yang diberikan mengandung protein (20%), Lemak (5%), Karbohidrat (45%), serat kasar (5%), serta vitamin dan mineral. Masing-masing tikus mendapat diit 12-20 gr/hari (Smith, 1988).
l.! Lingkungan: daerah (kawasan dan sebagainya) yang termasuk didalamnya;
semua yang mempengaruhi pertumbuhan manusia atau hewan. Tikus dipelihara pada kandang ukuran 40x30cm, dialasi dengan gerabah padi dan diberikan diet normal berupa pelet dan air dua kali sehari.
4.6 Alat dan Bahan Penelitian 4.6.1 Alat Penelitian
1. Peralatan bedah minor: pinset anatomis dan sirurgis, scalpel atau mesh no.20, gunting, klem, serta needle holder.
2. Sarung tangan steril 3. Doek steril
4. Bor listrik dan bone saw 5. Kasa Steril
6. Label nomor hewan coba 7. K – wire 1,2 mm
9. Pisau cukur bulu
4.6.2 Bahan Penelitian
1.! Spuit injeksi (1 cc dan 3 cc) 2.! Ketamine
3.! Antibiotik injeksi (Ceftriakson) 4.! Analgetik injeksi (Ketorolac) 5.! Antisepsis (Betadine)
6.! Alkohol 70%
7.! Aquabides
8.! Bone graft Calcium Sulfate/Hydroxiapatite (Perossal) 9.! Rat recombinant VEGF
10.!Nitrogen Cair
4.7 Cara Kerja
1.! Digunakan 30 ekor tikus putih (Wistar Rat) jantan, usia 4-5 bulan, berat badan 200-250 gram dengan kesehatan yang baik yang ditandai dengan gerakan aktif, bulu tidak kusam, serta memiliki respon yang baik terhadap rangsangan sekeliling.
2.! Tikus diadaptasi selama 1 minggu.
3.! Tikus kemudian dibagi menjadi 3 kelompok, yaitu :
P1 : Kelompok Perlakuan 1 (dengan pemberian Calcium Sulfate saja).
P2 : Kelompok Perlakuan 2 (pemberian Calcium Sulfate dan VEGF).
bulu hewan coba pada tungkai bawah kanannya.
5.! Pembedahan dimulai dengan pembiusan menggunakan bius umum dengan ketamine berdosis 45 mg/kg berat badan intramuscular (Santoso, 2011).
6.! Dilakukan disinfeksi pada tungkai bawah kanan hewan coba dengan betadine dan alkohol 70%.
7.! Dilakukan insisi kulit parapatellar median yang dilanjutkan dengan insisi pada kapsul sendinya melalui midline melalui otot vastus medial sampai dengan insersi patellar tendon, kemudian dilakukan retraksi patella ke lateral pada posisi lutut ekstensi.
8.! Dilakukan pembuatan defek hemikortek sepanjang 1 cm pada diafisis tulang femur kanan pada hewan coba dan dilakukan bone recycling dengan nitrogen cair. Kemudian diberikan perlakuan sesuai dengan kelompok hewan coba yang sudah ditetapkan.
9.! Kelompok perlakuan pertama diberikan calcium sulfate (Perossal) sebagai bone graft. Kelompok perlakuan kedua diberikan calcium sulfate yang sudah dicampur VEGF.
10.!Titik insersi fiksasi internal adalah intercondylar notch. Dilakukan insersi K-wire 1,2 mm dengan menggunakan bor secara intramedullar, kemudian wire dicabut. Dilakukan pembengkokan ujung wire secara manual kemudian dipotong ujung wire tersebut. Ujung wire ditanam pada tulang rawan sendi lutut, kemudian luka ditutup dengan benang nilon 4.0.
topikal serta diberikan injeksi antibiotika ceftriaxon 60mg/kg berat badan selama 3 hari secara intramuskular.
12.!Penelitian dilakukan pada pagi hari pukul 09.00 WITA, pada hari pertama penelitian.
13.!Kedua kelompok tikus dikandangkan di Laboratorium Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana dengan kandang ukuran 40x30cm, dialasi dengan gerabah padi dan diberikan diet normal berupa pelet dan air dua kali sehari.
14.!Berat badan masing-masing tikus ditimbang setiap minggu selama penelitian.
15.!Diet normal tikus adalah pelet. Pelet yang diberikan mengandung protein (20%), Lemak (5%), karbohidrat (45%), serat kasar (5%), serta vitamin dan mineral. Masing-masing tikus mendapat diit 12-20 gr/hari (Smith, 1988).
16.!Air minum diberikan secara ad libidum.
17.!Apabila dalam perjalanan tikus jatuh sakit maka tikus tersebut akan di eksklusi dan dikonsulkan ke dokter hewan untuk penanganan lebih lanjut.
18.!Pada hari terakhir minggu ke-4, tikus disuntik sampai mati dengan ketamine dosis lethal, 200 mg/kg berat badan intramuscular (Santoso, 2011).
19.!Femur tikus diambil dan dilakukan pengambilan sampel jaringan pemeriksaan histopatologi untuk menilai jumlah sel osteoblas dan pemeriksaan imunohistokimia untuk menilai kadar kolagen tipe I.
Gambar 4.2 Alur Penelitian
4.9 Analisa Data
Data yang didapatkan pada penelitian dianalisis sebagai berikut : 1.! Analisis Deskriptif
2.! Analisis Inferensial:
a.! Uji Normalitas data dengan menggunakan uji Shapiro Wilks untuk mengetahui normalitas sebaran data penelitian.
b.! Uji Homogenitas data dengan menggunakan uji Levene’s Test untuk mengetahui homogenitas varian data penelitian.
36 Tikus
Diadaptasi Selama 1 Minggu
Dilakukan pembuatan hemidefek pada tulang femur Tikus dan dilakukan bone recycling dengan nitrogen cair
18 Kelompok Kontrol Pemberian Bone graft
Calcium sulfate 18 Kelompok Perlakuan
Pemberian VEGF dalam Bone graft Calcium sulfate
Minggu ke 4, Sakrifasi dan pengambilan jaringan Pemeriksaan kadar Collagen type 1 dan Jumlah sel osteoblas
Analisa Data
dilakukan uji parametrik menggunakan uji independent t-test. Namun bila tidak berdistribusi normal atau data ordinal dapat dilakukan uji non parametrik dengan uji Mann-Whitney U.
HASIL PENELITIAN
5.1 Analisis Sampel
Analisis penelitian mencakup sebaran data secara deskriptif, jumlah osteoblas dan ekspresi kolagen tipe I. Selanjutnya data yang terkumpul dilakukan analisis secara statistik dengan SPSS for Windows version 22.0.
5.1.1 Analisis deskriptif
Analisis data secara deskriptif bertujuan untuk memperoleh gambaran yang lebih jelas mengenai distribusi dan simpangan baku dari masing-masing variabel penelitian.
Tabel 5.1
Distribusi frekuensi subjek penelitian masing-masing kelompok Kelompok Frekuensi (n) Persentase (%) Kontrol
(Kalsium Sulfat)
16 50.00
Perlakuan
(Kalsium Sulfat dengan VEGF)
16 50.00
Total 32 100
Dari distribusi di atas dapat dilihat bahwa total jumlah subjek penelitian adalah sebanyak 32 dengan kelompok kontrol dengan pemberian Calcium sulfate tanpa VEGF adalah sebanyak 16 atau 50.00 % dari total seluruh subjek dan kelompok perlakuan dengan pemberian Calcium sulfate dan VEGF sebanyak 16 atau 50.00%.
Rerata jumlah osteoblas pada masing-masing kelompok
Variabel
Kelompok Kontrol dengan
Kalsium Sulfat (n=16) (Mean ± SD)
Perlakuan dengan Kalsium Sulfat dan
VEGF (n=16) (Mean ± SD) Jumlah Osteoblas 284,937 ± 10,009 387,875 ± 17,587
Rerata jumlah osteoblas pada kelompok kontrol dengan kalsium sulfat adalah sebesar 284,937 ± 10,009 sedangkan pada kelompok perlakuan dengan kalsium sulfat dan VEGF memiliki rerata sebesar 387,875 ± 17,587.
Tabel 5.3
Persentase ekspresi Kolagen tipe I pada masing-masing kelompok
Ekspresi Kolagen Type I
Kelompok Kontrol dengan
Kalsium Sulfat n (%)
Perlakuan dengan Kalsium Sulfat dan VEGF
n (%) Tidak ada ekspresi
Ekspresi Ringan Ekspresi Sedang Ekspresi Padat
16 (100%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)
0 (0%) 16 (100%)
0 (0%) 0 (0%)
Total 16 (100 %) 16 (100 %)
menunjukkan ekspresi ringan sebanyak 100 % (16) sedangkan pada kelompok kontrol dengan kalsium sulfat tidak menunjukkan ekspresi kolagen tipe I.
5.2 Analisis Inferensial
Analisis! ini! bertujuan! untuk! melakukan! generalisasi! hasil! penelitian! ke!
populasi.! Uji! statistik! inferensial! yang! digunakan! pada! penelitian! ini! adalah!
independent0t'test!bila!data!berdistribusi!normal!dan!varian!datanya!homogen.!
Penilaian!hasil!uji!menggunakan!95%!CI!dan!nilai!p!pada!batas!kemaknaan!
0.05.!!
!
!!!!!!!!
5.2.1 Uji normalitas dan homogenitas
Variabel-variabel penelitian pada kelompok perlakuan dan kontrol dilakukan uji normalitas. Dengan jumlah data sebanyak 32 (n < 50), maka uji normalitas yang digunakan terhadap data hasil penelitian adalah Shapiro-Wilk test, sedangkan uji homogenitas varian data dilakukan dengan menggunakan Levene’s test.
Tabel 5.4
Uji normalitas data variable jumlah osteoblas dengan Shapiro-Wilk
Variabel Kelompok N P Keterangan
Jumlah Osteoblas Kontrol 16 0,391 Normal
Perlakuan 16 0,477 Normal
Tabel di atas menunjukkan bahwa data diameter kalus, jumlah osteoblas berdistribusi normal, dimana nilai p > 0,0
Tabel 5.5
Uji Homogenitas varian data variabel-variabel penelitian dengan Levene’s Test
Variabel Kelompok N P Keterangan
Jumlah Osteoblas Perlakuan 16 0,142 Homogen
Kontrol 16
Tabel di atas menunjukkan bahwa data jumlah osteoblas memiliki varian data yang homogen dimana nilai p sebesar 0,142 (p > 0,05).
5.2.2 Uji Independent T-Test
Untuk variabel numerik dilakukan uji kemaknaan untuk data dua kelompok tidak berpasangan yaitu independent t-test untuk data yang berdistribusi normal.
Untuk mengetahui efek dari masing-masing variabel pada kelompok perlakuan dan kontrol dilakukan dengan membandingkan rerata post-test dari masing-masing kelompok.
Tabel 5.6
Hasil uji komparabilitas data post-test variabel penelitian untuk kelompok perlakuan dan kontrol
!
Variabel
Kelompok
Beda rerata
95% CI
Nilai p Perlakuan
dengan Kalsium Sulfat dan
VEGF (n = 16)
Kontrol dengan Kalsium
Sulfat (n = 16) Jumlah
Osteoblas
387,875 ± 17,587
284,937 ± 10,009
102.93 750
92.605 - 113.269
0,000 Tabel di atas menunjukkan bahwa jumlah osteoblas pada kelompok perlakuan lebih banyak dibandingkan dengan kelompok kontrol, dan perbedaan rerata antar
(p< 0,05).
5.2.3. Uji Mann-Whitney U
Untuk variabel ordinal dilakukan uji kemaknaan untuk data dua kelompok dengan uji non-parametrik Mann-Withney U test. Untuk mengetahui efek dari masing-masing variabel pada kelompok perlakuan dan kontrol dilakukan dengan membandingkan mean rank dari masing-masing kelompok.
Tabel 5.7
Hasil uji komparabilitas data post-test variabel penelitian untuk kelompok perlakuan dan kontrol
!
Variabel
Mean Rank Nilai p
Perlakuan dengan Kalsium Sulfat dan
VEGF (n = 16)
Kontrol dengan Kalsium Sulfat
(n = 16)
Ekspresi Kolagen Tipe I
24,50 8,50 0,000
Tabel di atas menunjukkan bahwa ekspresi kolagen tipe I pada kelompok perlakuan memiliki mean rank lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok kontrol, dan perbedaan mean rank antar kelompok perlakuan dan kontrol signifikan secara statistik dengan nilai p = 0,000 (p< 0,05).
PEMBAHASAN HASIL PENELITIAN
Data hasil penelitian yang telah diolah dan dianalisis dengan metode statistik sesuai dengan hipotesis penelitian yang telah dibuat. Berikutnya hasil interpretasi data tersebut akan dibahas untuk mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi hasil penelitian ini.
6.1. Subjek Penelitian
Untuk mengetahui dan menguji efek Vascular Endothelial Growth factor dalam Calcium Sulfat terhadap sel Osteoblas dan Kolagen tipe I pada defek tulang femur tikus setelah dilakukan bone recycling dengan nitrogen cair, maka dilakukan penelitian pada tikus putih jenis wistar dengan jenis kelamin jantan umur 16-20 minggu dengan berat 200-250 gram dan dalam kondisi sehat tanpa cacat.
Sebagai hewan coba digunakan tikus sebanyak 32 ekor yang terbagi menjadi 2 kelompok kelompok kontrol dan kelompok perlakuan masing-masing berjumlah 16 ekor. Penelitian ini merupakan penelitian yang pertama kali dilakukan, sebelumnya belum pernah ada yang meneliti tentang pengaruh Vascular Endothelial Growth Factor dalam Calcium Sulfat terhadap sel Osteoblas dan Kolagen tipe I pada defek tulang femur tikus setelah dilakukan bone recycling dengan nitrogen cair.
6.2. Hubungan VEGF dalam Calcium Sulfat dengan Sel Osteoblas Pada Defek Tulang Femur Tikus Setelah Dilakukan Bone Recycling dengan Nitrogen Cair.
Pada penelitian ini didapatkan rerata jumlah osteoblas lebih banyak pada kelompok perlakuan VEGF dalam Calcium Sulfat pada defek tulang femur tikus setelah dilakukan bone recycling dengan nitrogen cair dan terbukti berbeda secara signifikan dibandingkan dengan kelompok kontrol tanpa pemberian VEGF dengan nilai p = 0,000 (CI 95%: 92.605 - 113.269). Ini menunjukkan bahwa pemberian VEGF dalam calcium sulfate dapat meningkatkan jumlah osteoblas pada defek tulang femur tikus yang dilakukan bone recycling dengan nitrogen cair.
Penelitian ini sesuai sejalan dengan penelitian Liu et al (2014) yang mengemukakan tentang peningkatan pembentukan tulang baru dan angiogenesis yang signifikan secara statistik pada model defek tulang tikus yang diberikan calcium sulfate dengan VEGF. Penelitian ini juga sejalan dengan studi lain oleh Yang et al (2012) juga mengemukakan tentang efek dose-dependent VEGF terhadap stimulasi peningkatan proliferasi osteoblast sampai lebih dari 70%. Pada penelitian ini, jumlah osteoblast meningkat secara signifikan pada pemberian calcium sulfate yang diberikan VEGF. Hal ini menunjukkan adanya peningkatan vaskularisasi pada defek tulang yang dapat membantu meningkatkan proliferasi osteoblast sehingga terjadi peningkatan pembentukan tulang baru.
Mekanisme peningkatan jumlah osteoblast yang dapat meningkatkan pembentukan tulang dapat dijelaskan melalui efek calcium sulfate yang dapat diaugmentasi dengan adanya VEGF. Calcium sulfate dapat meningkatkan formasi
memberikan mekanisme untuk pertumbuhan tulang. Densitas mikrovaskular meningkat pada defek tulang yang diterapi dengan calcium, menandakan efek angiogenesis positif dari calcium sulfate. Di samping itu, ion kalsium dilepaskan pada saat disolusi calcium sulfate, sehingga terjadi peningkatan lokal dari ion kalsium yang akan meningkatkan pembentukan osteoblast dan fungsinya. Calcium sulfat dapat berperan sebagai stimulus diferensiasi osteoblast. Stimulasi mekanoreseptor pada sel osteoblast (integrin dan calcium channels) beserta dengan faktor pertumbuhan (TGF-β, IGF, bFGF, VEGF, PDGF, BMP) akan menginduksi beberapa gen/faktor transkripsi yang mengatur pembentukan dan diferensiasi osteoblast (Papachroni et al. 2009).
Sedangkan vascular endothelial growth factor (VEGF) merupakan factor pertumbuhan angiogenik paling kuat yang dapat menstimulasi pembentukan pembuluh darah baru. Hal ini secara klinis berpengaruh pada proses pembentukan tulang. Penelitian in vitro menyatakan bahwa VEGF dapat memicu proses angiogenesis dalam pembentukan tulang melalui pengaruh bone morphogenetic protein (BMPs) dan aktivasi langsung dari sel osteoblast. Deposisi VEGF pada defek kerusakan tulang telah menunjukan peningkatan dari pembentukan matriks tulang pada defek tulang femur pada tikus dan defek critical-sized dari radius Tikus.
Hal ini mengindikasikan peran VEGF dalam meningkatkan penyembuhan dan regenerasi tulang. Ekspresi faktor pertumbuhan seperti VEGF dapat menstimulasi proses penyembuhan tulang melalui proses angiogenesis dan osteogenesis. VEGF menginisiasi proses angiogenesis melalui invasi pembuluh darah baru (neovaskularisasi) sehingga terjadi rangsangan perekrutan sel mesenkim
memicu sel mesenkim progenitor untuk berdiferensiasi ke arah pembentukan osteoblast. Selain itu, VEGF juga berperan meningkatkan ekspresi faktor pertumbuhan dan sitokin sel endothelial, meningkatkan jumlah nodul dan aktivitas alkaline phosphatase serta sehingga terjadi stimulasi, migrasi, proliferasi dari sel osteoblast. VEGF juga membantu menghambat proses apoptosis sel osteoblast, sehingga mineralisasi matriks osteoid dan bone regeneration akan terjadi. Efek dari VEGF dalam Calcium Sulfat lebih meningkatkan jumlah sel Osteoblas daripada hanya Calcium sulfat saja.
6.3. Hubungan VEGF dalam Calcium Sulfat dengan Kolagen Tipe I pada Defek Tulang Femur Tikus Setelah Dilakukan Bone Recycling dengan Nitrogen Cair.
Dari uji statistik menunjukkan ekspresi kolagen tipe I pada kelompok perlakuan memiliki mean rank lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok kontrol, dan perbedaan mean rank antar kelompok perlakuan dan kontrol signifikan secara statistik dengan nilai p = 0,000 (p< 0,05). Ini menunjukkan bahwa pemberian VEGF dalam calcium sulfat dapat meningkatkan ekspresi Kolagen tipe I pada defek tulang femur tikus setelah dilakukan bone recycling dengan nitrogen cair.
Penelitian ini sejalan dengan studi oleh Maes C. et al (2002) yang mengemukakan pengaruh VEGF terhadap kadar ekspresi Cbfa1 dan mRNA kolagen tipe I. Ekspresi kadar Cbfa1 dan mRNA kolagen tipe I akan menurun bila ekspresi VEGF dihilangkan pada proses pembentukan tulang baru. Pada penelitian Peng et al (2005), penghambatan VEGF dengan sFlt1 pada kasus fraktur femur pada
tulang. Sedangkan pemberian VEGF secara exogenous meningkatkan vaskularitas dan kepadatan mineral pada kalus yang mengalami kalsifikasi. Hal ini menunjukkan peran VEGF dalam meningkatkan pembentukan kolagen tipe I sebagai matriks ekstraseluler untuk membantu pembentukan kalus.
VEGF merupakan mediator penting dalam tahap neovaskularisasi dari pertumbuhan tulang endochondral dan morfogenesis lempeng pertumbuhan. VEGF ini diekspresikan oleh sel-sel di tulang, seperti osteoklas, osteoblast dan kondrosit.
Osteoblas melakukan deposisi matriks tulang yang kaya akan kolagen tipe I, yang mana nantinya akan termineralisasi.
Osteoblas mempunyai precursor mesenkimal yang sama dengan kondrosit dan faktor regulasi yang spesifik. Seperti RUNX2 yang mendominasi control dari diferensisasi osteoblast. Osteoblast yang sudah matang memproduksi matriks tulang dan mengekspresikan kolagen tipe I yang berlimpah.
VEGF mempunyai peranan yang penting dalam fase remodelling dari tulang.
Pada fase remodelling pergantian dari woven bone menjadi lamellar bone memerlukan perpaduan antara resorpsi tulang yang diperantarai oleh osteoclas dan pembentukan tulang oleh osteoblas. VEGF mempengaruhi fungsi dari kedua sel tersebut dan VEGF penting bagi fasa bone remodelling. VEGF berikatan dengan VEGFR1 pada osteoklas dan meregulasi diferensiasi dan aktifasi.
Oleh karena itu, jika kadar VEGF berkurang pada fasa remodelling tulang maka akan mengurangi sinyal dari proses angiogenik dan osteogenik secara tidak langsung melalui inhibisi dari bone resorption.