Laporan Praktikum Bioteknologi Pertanian - Tanaman Analisis DNA Delapan Genotipe Padi (Oryza sativa) Varietas Lokal
Rianne Safitri, 150510210162 ABSTRAK
Praktikum ini dilaksanakan di Laboratorium Lab. Pemuliaan Tanaman, Universitas Padjadjaran, Jatinangor, Kabupaten Sumedang pada tanggal 12 September sampai 03 Oktober 2022. Tujuan dari praktikum ini adalah mempelajari prosedur analisis DNA dan mengetahui kualitas serta sifat atau karakter DNA yang diisiolasi dari kedelapan padi varitas lokal. Terdapat empat prosedur yang harus dikerjakan dalam menganalisis DNA, yaitu isolasi DNA, PCR, elektroforesis, dan visualisasi DNA. Berdasarkan analisis DNA yang dilakukan, didapatkan hasil berupa kualitas DNA yang dihasilkan tidak seluruhnya baik atau bagus, kemurnian DNA rendah, dan ditemukannya kemiripan sifat antara kedelapan genotype padi varietas lokal dengan marka molekuler yang dipakai, yakni RM 7601. Hal ini membuktikan bahwa diperlukan adanya ketelitian dan keahlian khusus dalam melaksanakan analisis DNA sehingga kesalahan dapat diminimalisir.
Kata kunci : Elektroforesis, Isolasi DNA, PCR
PENDAHULUAN
Padi (Oryza sativa) atau beras merupakan sumber makanan pokok masyarakat Indonesia. Saat ini kebutuhan akan padi di Indonesia sendiri terus meningkat seiring dengan bertambahnya jumlah penduduk. Kebutuhannya yang semakin tinggi tanpa diiringi dengan peningkatan produktivitasnya membuat Indonesia masih membutuhkan asupan beras hasil dari impor. Oleh karena itu, diperlukan suatu upaya untuk meningkatkan produktivitasnya.
Salah satu upaya yang dapat ditempuh adalah melalui pendekatan molekuler. Pendekatan molekuler tersebut dapat dilakukan pada padi varietas lokal dengan sifat-sifat unggul yang belum sepenuhnya tereksplorasi. Lebih lanjut, dalam pendekatan molekuler, keberadaan DNA merupakan hal yang sangat penting.
DNA merupakan molekul untai ganda yang mengandung seluruh intruksi genetik yang dibutuhkan oleh semua organisme selama siklus hidupnya (Zein & Prawiradilaga, 2013). Di dalam DNA terkandung gen-gen yang berperan dalam mengendalikan karakter suatu makhluk hidup yang berkaitan dengan morfologi, anatomi, fisiologi, perilaku, dan lainnya.
Dalam bidang bioteknologi pertanian, penggunaan DNA dapat dimanfaatkan untuk meningkatkan kualitas dan kuantitas suatu tanaman. Namun dalam prakteknya, tidak semua DNA yang dipakai memiliki kualitas yang baik sehingga diperlukan suatu analisis yang berguna untuk mengetahui kualitas suatu DNA. Prosedur analisis tersebut dapat dilakukan dengan melalui beberapa tahap, seperti isolasi DNA, PCR, Elektroforesis, dan Visualiasasi DNA.
Menurut Triani (2020), prinsip isolasi DNA adalah memisahkan DNA dari berbagai macam komponen lain, seperti RNA, lemak, protein, dan karbohidrat. Lebih lanjut, isolasi DNA dapat dilakukan menggunakan metode CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) dengan prosesnya yang terbagi menjadi tiga, yaitu lisis (penghancuran), ekstraksi, dan pemurnian.
Setelah proses isolasi DNA selesai dilakukan, maka tahap selanjutnya adalah PCR (Polymerase Chain Reaction). Prinsip teknik PCR adalah memperbanyak molekul DNA dengan bantuan primer-primer. Lebih lanjut, teknik ini dilakukan dengan 20-30 kali pengulangan dengan tahapannya yang meliputi denaturasi, annealing, dan elongasi.
Tahapan berikutnya setelah diperolehnya sampel DNA adalah elektroforesis.
Elektroforesis merupakan suatu metode pemisalahan dengan memanfaatkan medan listrik yag dihasilkan dari elektroda-elektroda yang bersumber dari arus listrik searah maupun arus listrik bola-balik (Harahap, 2018). Teknik elektroforesis dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui kualitas suatu DNA (Triani, 2020). Teknik ini memanfaatkan gel agarose gel
poliakrilamida, dimana gel tersebut akan membentuk pori-pori untuk dilewati DNA sehingga fragmen-fragmen DNA dapat dipisahkan sesuai ukurannya. Menurut Harahap (2018), laju elektroforesis bergantung pada kekentalan medium (n), ukuran atau bentuk (r), dan muatan molekul (q). Tahap terakhir dari prosedur analisis DNA adalah visualisasi, dimana tujuan dilakukannya proses ini adalah untuk mendokumentasikan hasil PCR untuk melihat fragmen- fragmen DNA dari sampel yang kita gunakan.
Hipotesis dari praktikum ini adalah DNA yang diisoalsi dari kedelapan padi varietas lokal memiliki kualitas yang baik, kemurnian tinggi, dan memiliki kemiripan sifat dengan marka molekuler RM 7601. Adapun tujuan dari praktikum ini adalah mempelajari prosedur analisis DNA dan mengetahui kualitas serta sifat atau karakter DNA yang diisiolasi dari kedelapan padi varietas lokal.
BAHAN DAN METODE Waktu dan tempat praktikum
Praktikum ini dilaksanakan di Laboratorium Lab. Pemuliaan Tanaman, Universitas Padjadjaran, Jatinangor, Kabupaten Sumedang pada tanggal 12 September sampai 03 Oktober 2022.
Prosedur praktikum 1) Isolasi DNA
Bahan yang diperlukan adalah 10% SDS, Larutan CTAB, Isopropanol, chloroform, ethanol 70%, buffer TE dan sampel isolasi berupa daun padi dan biji beras varietas lokal dengan 8 genotype berbeda
Tabel 1. Sampel isolasi DNA
Sampel Genotipe
1. Biji beras 2. Daun padi
Klmpk 1 : Cere Hideung Klmpk 2 : Randa Kaya Klmpk 3 : Seksrek Klmpk 4 : Lokcan Klmpk 5 : Cere Paray Klmpk 6 : Cere Bodas Klmpk 7 : Sari Kuning Klmpk 8 : Jidah Nangka
Tahapan yang dilakukan meliputi : (1) sterilisasi alat-alat menggunakan alkohol 70%; (2) memotong serta menggerus sampel menggunakan mortar steril yang buffer ekstraksi larutan CTAB 900; (3) menambahkan larutan SDS 100 µL pada sampel yang sudah halus; (4) memasukan hasil gerusan pada tabung mikro 2 mL untuk diinkubasi dalam waterbath pada suhu 65°C selama 15 menit sambil dilakukan pengocokan perlahan setiap lima menit; (5) menambahkan n CIA (cloroform : isoamil alkohol = 24 : 1) sebanyak 700 µL ke dalam tabung dan kocok hingga rata; (6) suspensi tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit; (7) mengambil supernatant untuk dipindahkan ke tabung mikro 1,5 ml; (8) menambahan isopropanol sebanyak 700 µL ke dalam supernatan dan dicampur perlahan untuk memekatkan DNA; (9) sampel disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 10 menit; (10) mencuci pellet yang diperoleh dengan 100 µL etanol 70%, kemudian diamkan selama 30 menit dalam suhu ruang; (11) campuran disentrifugasi kembali selama 5 menit pada kecepatan 10000 rpm suhu 4°C; (12) mengeringkan pellet dengan angin pada suhu ruangan selama 24 jam; (13) melarutkan pellet yang sudah kering dengan bufer TE yang mengandung ribonuklease sebanyak 100 µL dan didiamkan pada suhu 4°C selama satu hari sebelum digunakan untuk kegiatan selanjutnya.
2) PCR
Bahan yang diperlukan adalah Template (DNA) 1 μl, Primer F dan R 1 μl, MyTaq™ HS Red Mix 25 μl, dan Nuclease free water 50 μl. Tahapan yang dilakukan
adalah : (1) menyiapkan komponen-komponen yang dibutuhkan; (2) mencampurkan semua komponen yang dibuat kedalam tabung sesuai urutan; (3) memasukan sampel ke dalam mesin PCR; (4) mengatur program PCR yang akan digunakan.
Tabel 2. Urutan komponen yang dimasukan ke dalam tabung
Urutan Pipetting Komponen Konsentrasi Akhir Volume
1 Template (DNA) 200 ng 1 μl
2 primer F 0,2 Mm 1 μl
3 primer R 0,2 mM 1 μl
4 MyTaq™ HS Red Mix 1x 25 μl
5 Nuclease free water - Up to 50 μl
Tabel 3. Program siklus running PCR
Tahap Suhu Waktu Siklus
Pre Denaturation 95° 1 min 1
Denaturation 95° 50 sec
25-35
Annealing User determined
(60°, 58°, 55°,55°, 55°, 57°) 15 sec
Extension/Elongation 72° 10 sec
Final Extention/Elongation 72° 5 min
Hold 4° ~
3) Elektroforesis
Bahan yang diperlukan adalah gel agarose 1 gram, 0,5x TBE buffer, microwave, dan tray elektroforesis. Adapun tahapan dalam teknik ini terdiri dari 3 proses, yakni pembuatan agarose, pengisian tangka elektroforesis, dan loading DNA ke sumur elektroforesis dan running elektroforesis. Proses pembuatan agarose meliputi : (1) ,menimbang agarose sebanyak 1 gram; (2) memasukan agarose ke dalam labu erlemeyer dan tambahkan 0,5x TBE buffer yaitu sebanyak 100 ml kemudian masukan kedalam microwave selama 10 menit atau sampai agarose larut (sampai sudah tidak terlihat adanya gumpalan agarose); (3) tuangkan gel agarose yang sudah suam-suam kuku ke dalam tray elektroforesis; (4) memasang sisirnya dan biarkan agarose memadat kemudian cabut secara perlahan apabila sudah memadat
Kemudian, proses pengisian tangki elektroforesis meliputi : (1) menyiapkan 0,5x TBE buffer dengan volume total 2000 ml. Masukan 200 ml 5x TBE buffer ke dalam tabung erlemeyer; (2) lalu menambahkan aquades steril hingga volum mencapai 2.000 ml, lalu masukan ke dalam tangki elektroforesis; (3) Memasang tray yang berisi gel agarose ke dalam tangki elektroforesis. Selanjutnya, pada proses loading DNA ke sumur elektroforesis dan running elektroforesis, tahapan yang dilakukan meliputi : (1) membersihkan sumur gel agarose menggunakan siringe; (2) loading sampel 6 μl hasil PCR dan tambahkan 1 μl loading dye ke dalam sumur gel agarose; (3) running elektroforesis pada 90 volt selama 60 menit.
4) Visualisasi DNA
Setelah running elektroforesis selesai, masukan agarose pada UV transiluminator/gel documentation. Gambar gel diambil dan disimpan dalam format file JGP/TIF/PNG. Pengamatan dilakukan dengan melihat pola pita DNA yang terbentuk.
HASIL DAN PEMBAHASAN Analisis kualitas DNA
Menurut Triani (2020), suatu DNA dapat dikatakan memiliki kualitas yang baik apabila hasil elektroforesisnya menunjukan pita DNA yang jelas. Berdasarkan gambar 1, dapat diketahui bahwa kualitas pita DNA yang dihasilkan menunjukan adanya perbedaan. Beberapa DNA menunjukan pita yang jelas sedangkan yang lainnya kurang atau bahkan tidak jelas padahal kedua sampel tersebut berasal dari genotype yang sama. Dugaan terjadinya hal ini
adalah adanya kesalahan yang terjadi selama proses pemipetan sehingga data yang dihasilkan menjadi berbeda.
Gambar 1. Visualisasi DNA 8 genotipe padi varietas lokal
(Secara berurutan pita kiri ke kanan: Biji sampel 1, Biji sampel 2, Daun sampel 1, Daun sampel 2) Lebih lanjut, kualitas pita DNA yang dihasilkan akan berkaitan konsentrasi yang diperoleh, dimana semakin tebal dan terang pita, maka semakin tinggi konsentrasi yang didapatkan. Sebaliknya, semakin redup atau tipis pita yang dihasilkan, maka semakin rendah konsentrasi yang didapatkannya (Triani, 2020). Hal ini didukung oleh pernyataan Putri (2015), bahwa Konsentrasi DNA yang rendah akan menyebabkan pita DNA yang tipis dan redup.
Tabel 4. Hasil uji kualitas DNA 8 genotipe padi varietas lokal Genotipe
Padi
Pita/Band DNA Smear
Biji Daun Biji Daun
Sampel 1
Sampel 2
Sampel 1
Sampel 2
Sampel 1
Sampel 2
Sampel 1
Sampel 2 Cere
Hideung
Tipis Tebal Redup Tebal Ada Ada Ada Ada
Randa Kaya
Tebal Tebal Tebal Tipis Ada Ada Ada Ada
Seksrek Tebal Tebal Tebal Tebal Ada Ada Ada Ada
Lokcan Tipis Tebal Tebal Tebal Ada Ada Ada Ada
Cere Paray
Tebal Redup Tebal Tebal Ada Ada Ada Ada
Cere Bodas
Tebal Tebal Tebal Tebal Ada Ada Ada Ada
Sari Kuning
Tebal Tebal Tebal Tipis Ada Ada Ada Ada
Jidah Nangka
Redup Tebal Tebal Tipis Ada Ada Ada Ada
Ket : Cere Hideung (Kelompok 1), Randa Kaya (Kelompok 2), Seksrek (Kelompok 3), Lokcan (Kelompok 4), Cere Paray (Kelompok 5), Cere Bodas (Kelompok 6), Sari Kuning (Kelompok 7), Jidah Nangka (Kelompok 8).
Menurut Sadikin dkk. (2021), salah satu indikator keberhasilan proses ekstrasi adalah tingkat kemurnian DNA yang dipengaruhi oleh jenis tumbuhan dan kandungan yang berada pada tumbuhan tersebut. Berdasarkan tabel 4, dapat diketahui bahwa sampel DNA memiliki kemurnian yang rendah sebab ditemukan adanya smear baik pada sampel biji maupun daun.
Menurut Mawardi dkk. (2020), pita DNA yang memiliki smear menandakan bahwa hasil isolasi DNA terdapat kontaminan seperti protein, RNA, DNA yang terdegradasi, ataupun larutan isolasi. Adapun faktor yang menyebabkan rendahnya tingkat kemurnian DNA adalah cara penggerusan yang tidak terlalu kuat sehingga komponen lain seperti protein dan karbohidrat tidak pecah sepenuhnya serta kurang maksimalnya kerja RNAse pada saat tahap purifikasi sehingga muncul kontaminan berupa RNA (Turrahmi dkk., 2021).
Analisis hasil amplifikasi PCR
Prosedur amplifikasi dilakukan pada mesin PCR dengan primer yang digunakan merupakan RM 7601. Menurut Adriansyah dkk. (2018), primer dapat mempengaruhi kualitas
dari pita DNA hasil amplifikasi. Oleh karena itu, pemilihan primer merupakan hal yang penting dalam proses PCR untuk mendapatkan pita yang DNA yang bersih dan bagus. Adapun primer yang baik ditandai dengan dihasilkannya lebih dari tiga pita DNA yang bersih. Selain pemilihan primer yang sesuai, terdapat beberapa faktor lain yang juga mempengaruhi hasil amplifikasi, seperti : (1) kesesuaian suhu selama PCR berlangsung; (2) kondisi deoksiribonukleotida triphosphat (dNTP); (3) DNA template (cetakan); (4) komposisi larutan buffer; (5) jumlah siklus reaksi; (6) enzim yang digunakan; dan (7) faktor teknis dan non-teknis lainnya; misalnya kontaminasi (Yuwono, 2006 dalam Langga dkk., 2012).
Primer RM 7601 diketahui berukuran 133 bp dengan kemampuannya adalah mendeteksi karakter heading date lokus 2a. Lebih lanjut, tanaman padi yang memiliki gen Hd diketahui memiliki potensi untuk memiliki waktu panen yang semakin cepat sebab Hd (Heading date) merupakan gen yang mengendalikan hari berbunga atau keluarnya malai pada tiap individu (Prasetiyono, 2017; Hikam dkk., 2015).
Gambar 2. Marka molekuler RM 7601
Berdasarkan gambar 3, dapat diketahui bahwa pita DNA dari semua sampel menghasilkan amplifikasi yang baik meskipun pita milik kelompok 3 dan 4 kurang jelas atau terang. Menurut Langga dkk. (2012), kemurnian dan konsentrasi DNA cetakan sangat mempengaruhi intensitas pita DNA hasil amplifikasi oleh primer. Konsentrasi DNA cetakan yang kecil dapat menyebabkan redup atau tidak jelasnya pita DNA yang dihasilkan. Selain itu, faktor lain yang dapat menyebabkan banyak atau sedikitnya fragmen DNA yang diamplifikasi adalah sebaran situs penempelan primer pada genom dan terjadinya kompetisi tempat penempelan primer pada DNA cetakan (Langga dkk., 2012; Adriansyah dkk., 2018).
Selanjutnya, teramplifikasinya kedelepan genotype padi dipengaruhi oleh kondisi DNA yang menunjukan adanya kesamaan sekuens antara sampel dengan primer yang digunakan. Hal ini menunjukan bahwa semua genotype padi varietas lokal yang digunakan sebagai sampel dikonfirmasi memiliki gen Hd.
Gambar 3. Hasil amplifikasi PCR 8 genotipe padi varietas local
Disamping itu, dapat dilihat pada tabel 5, bahwa pita/band yang dihasilkan menunjukan sifat monomorfisme dengan jumlah band yang dihasilkan berjumlah 1.
Tabel 5. Hasil amplifikasi PCR menggunakan primer 7601 Genotipe Hasil amplifikasi PCR Jumlah Band
Cere Hideung Monomorfis 1
Randa Kaya Monomorfis 1
Seksrek Monomorfis 1
Lokcan Monomorfis 1
Cere Paray Monomorfis 1
Cere Bodas Monomorfis 1
Sari Kuning Monomorfis 1
Jidah Nangka Monomorfis 1
KESIMPULAN
Analisis DNA yang meliputi isolasi DNA, PCR, dan elektroforesis merupakan kegiatan yang membutuhkan ketelitian dan keahlian khusus sebab apabila tidak dilakukan dengan baik, maka visualisasi yang dihasilkannya akan memiliki kualitas dan kuantitas yang buruk.
Pada praktikum kali ini, sebagian besar kualitas DNA yang dihasilkan adalah cukup baik atau bagus yang ditandai dengan pitanya yang tebal dan sebagian kecil lainnya memiliki kualitas yang rendah dengan ditandai redup atau tipisnya pita akibat kontaminasi komponen lainnya.
Sementara itu, kemurnian DNA yang dihasilkan rendah, dimana diantara semua sampel, tidak ada satupun yang tidak memiliki smear. Namun demikian, tetap diperlukuan adanya perhitungan lebih lanjut berupa pengujian kuantifikasi DNA hasil isolasi untuk mengetahui berapa tepatnya indeks kemurnian DNA. Disamping itu, berdasarkan hasil amplifikasi PCR, dapat diketahui bahwa kedelapan genotype padi varietas lokal memiliki gen Hd yang memiliki kemampuan untuk mengendalikan hari berbunga atau keluarnya malai pada tanaman padi.
Selain itu, diketahui pula bahwa semua pita yang dihasilkan memiliki sifat monomorfisme.
Hasil dari praktikum ini tidak seluruhnya sesuai dengan hipotesis yang telah dibuat.
Lebih lanjut, hasil praktikum yang tidak sesuai dengan hipotesis meliputi kualitas DNA yang dihasilkan tidak seluruhnya baik atau bagus dan kemurnian DNA rendah. Sementara hasil praktikum yang sesuai dengan hipotesis meliputi ditemukannya kemiripan sifat antara kedelapan genotype padi varietas lokal dengan marka molekuler RM 7601 yang menandakan terkandungnya gen Hd (Heading date) dalam sampel padi. Adapun aplikasi dari hasil praktikum ini dapat dimanfaatkan dalam menunjang pembelajaran ataupun kegiatan yang berhubungan kebutuhan analisis DNA.
DAFTAR PUSTAKA
Adriansyah, F., Hanum, L., Muharni, M., & Windusari, Y. (2018). Analisis polimorfisme padi varietas lokal Sumatera Selatan berdasarkan pendekatan PCR-RAPD. Jurnal Lahan Suboptimal: Journal of Suboptimal Lands, 7(1), 50-58.
Harahap, M. R. (2018). Elektroforesis: Analisis elektronika terhadap biokimia genetika. CIRCUIT: Jurnal Ilmiah Pendidikan Teknik Elektro, 2(1).
Hikam, S., Timotiwu, P. B., & Sudrajat, D. (2015). Studi Kemangkusan Varietas Sumber Genetik Lokalpadi Sawah Di Provinsi Lampung Untuk Dimanfaatkan Sebagai Varietas Harapan Dan Tetua Kros.
Langga, I. F., Restu, M., & Kuswinanti, T. (2012). Optimalisasi suhu dan lama inkubasi dalam ekstraksi DNA tanaman bitti (Vitex cofassus Reinw) serta analisis keragaman genetik dengan teknik RAPD-PCR. J Sains & Teknologi, 12(3), 265-276.
Mawardi, A., Maury, H. K. and Maladan, Y. (2020) ‘Analisis Perbandingan Kualitas Produk Amplikon Gen PMSA-2 Antara Spesimen Spot Darah Kering dan Vena’, 12(1), pp. 10–
18.
Prasetiyono, J.(2017). Evaluasi Molekuler Dan Agronomis Tanaman BC3F2 CODE× NIL- QTSN4 Untuk Peningkatan Jumlah Bulir Padi.
Putri, N.P.P.E., dan Junitha, E. I. (2015) Kualitas Dan Kuantitas Dna Darah Kering Pada Besi Dan Kayu Yang Disimpan Dalam Kurun Waktu Berbeda. Jurnal Biologi 19 (1): 21 - 24.
Sadikin, M. I., Swandari, T., & Wilisiani, F. (2021, May). Optimasi Protokol Ekstraksi DNA Kelapa Sawit (Elaeis guineensis Jacq.) pada Umur Tanaman yang Berbeda.
In Prosiding Seminar Nasional Fakultas Pertanian UNS (Vol. 5, No. 1, pp. 1379-1389).
Triani, N. (2020). Isolasi DNA tanaman jeruk dengan menggunakan metode CTAB (cetyl trimethyl ammonium bromide). G-Tech: Jurnal Teknologi Terapan, 3(2), 221-226.
Turrahmi, M., Nurhidayani, N., Hasyimuddin, H., & Pabendon, M. B. (2021). Uji kualitas dan kuantitas tanaman jewawut (setaria italic) di Balai Penelitian Tanaman Serealia Kabupaten Maros. Filogeni: Jurnal Mahasiswa Biologi, 1(2), 57-62.
Yuwono, T. (2019). Bioteknologi pertanian. UGM PRESS.
Zein, M. S. A., & Prawiradilaga, D. M. (2013). DNA barcode fauna Indonesia. Prenada Media.
