Validasi Metode Analisis Kafein dengan HPLC

LAPORAN PRAKTIKUM

KIMIA PEMISAHAN DAN PENGUKURAN

PERCOBAAN II: VALIDASI METODE ANALISIS KAFEIN (UJI KESESUAIAN SISTEM, PRESISI, AKURASI, DAN LINEARITAS)

Diajukan untuk memenuhi tugas mata kuliah Praktikum Kimia Pemisahan dan Pengukuran Dosen Pengampu:

Dr. Soja Siti Fatimah, S.Si, M.Si.

Drs. Asep Suryatna, M.Si

Tanggal Awal Praktikum: Kamis, 07 Maret 2024 Tanggal Akhir Praktikum: Kamis, 07 Maret 2024

Disusun oleh:

Hana Isnaila Qonita (2200825) Anggota Kelompok 2 Hana Isnaila Qonita (2200825) Khairin Kusuma Dewi (2200693)

Ramiz Hasbi (2200973)

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA

BANDUNG

2024

HPLC: Validasi Metode Analisis Kafein

(Uji Kesesuaian Sistem, Presisi, Akurasi, dan Linearitas)

Tanggal Percobaan : Awal: Kamis, 07 Maret 2024 Akhir: Kamis, 07 Maret 2024 A. Tujuan Percobaan

1. Melakukan validasi metode analisis kafein dalam minuman kopi (SNI 2983: 2004) 2. Menentukan uji kesesuaian system, presisi, akurasi, dan linearitas

B. Dasar Teori

Kromatografi merupakan suatu metode pemisahan yang didasarkan atas distribusi diferensial komponen-komponen sampel di antara dua fasa, yaitu fasa diam (stationary phase) dan fasa gerak (mobile phase). Sebagai fasa diam dapat berupa zat cair atau zat padat yang terikat pada permfukaan padatan (kertas atau suatu adsorben), sedangkan fasa geraknya dapat berupa cairan sebagai eluen atau pelarut atau gas pembawa yang inert.

Gerakan fasa gerak ini mengakibatkan terjadinya migrasi diferensial komponenkomponen dalam sampel (Permanasari, 2008).

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau yang paling dikenal dengan nama HPLC (High Performance Liquid Chromatography) adalah jenis kromatografi elusi yang paling banyak dan paling luas digunakan. Teknik pemisahan ini digunakan oleh para ilmuwan di dunia untuk memisahkan komponen-komponen dalam sampel-sampel cair dan padatan serta material biologi untuk banyak sekali keperluan seperti analisis lingkungan, farmasi dan obat-obatan, analisis forensik, analisis pangan, keperluan toksikologi, dan keperluankeperluan lainnya (Bohari, 2021: 153).

Prinsip dasar HPLC adalah fase gerak cair dialirkan menggunakan pompa melalui kolom ke detektor . Lalu, cuplikan dimasukan ke aliran fase gerak dengan cara disuntik.

Di dalam kolom, terjadi pemisahan komponen zat cair dikarenakan adanya perbedaan kekuatan interaksi antara salut-salut terhadap fase diam yang akan keluar terlebih dahulu dan sebaliknya. Setiap komponen campuran yang keluar dari kolom akan dideteksi oleh detektor dan akan direkam dalam bentuk kromatogram. (Lestari, 2014).

Prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut: dengan bantuan pompa, fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor, cuplikan dimasukkan ke dalam fasa gerak dengan penginjeksian. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam.

Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu, sebaliknya solut-solut yang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar dideteksi oleh detektor. Kemudian, direkam dalam bentuk kromatogram. Kromatogram HPLC serupa dengan kromatogram gas. (Hendayana, S, 2006: 69).

Komposisi solven atau fase gerak adalah salah satu faktor yang mempengaruhi pemisahan dalam kromatografi cair. Solven yang digunakan untuk HPLC bervariasi, tetapi ada beberapa sifat umum yang disukai, yaitu fasa gerak harus :

1. Murni tidak ada kontaminan 2. Tidak bereaksi dengan wadah 3. Sesuai dengan detektor

4. Melarutkan sampel

5. Memiliki viskositas yang rendah 6. Harga di pasaran murah

(De Lux Putra, 2004).

Komponen-komponen dalam HPLC, diantaranya:

1. Resevoir (wadah pelarut atau cairan)

2. Pompa

3. Sistem injeksi sampel

4. Kolom terdiri dari kolom analitik/kolom utama, dan termostat

5. Detektor

6. Komputer (pengolahan data)

Gambar 1. Skema Alat HPLC

(Budhiraja, 2004).

Resevoir adalah wadah yang menampung cairan-cairan yang akan digunakan dalam pemisahan. Cairan-cairan ini berupa pelarut. Katup berpotongan terhubung ke masing-masing resevoir untuk mengontrol cairan yang masuk atau dipompa ke dalam kolom. (Budhiraja,2004).

Dengan menggunakan pompa, pelarut dimasukan ke kolom melalui pipa atau selang. Hal ini terjadi karena pelarut dipompa dari resevoir yang memungkinkan sampel dibawa ke kolom. Kriteria yang harus dipenuhi oleh pompa HPLC, yaitu:

1. Harus memiliki aliran terkontrol yang “reproducible”

2. Harus menghasilkan aliran yang tidak menghasilkan gelembung 3. Hold-up volume (volume tampungan) kecil

(Budhiraja, 2004).

Sampel tidak dapat diinjeksikan dengan cara yang sama seperti kromatografi gas sehingga sampel dimasukan melalui loop injektor karena HPLC menggunakan tekanan yang tinggi. Sampling loop terbuka terhadap atmosfer pada posisi terisi, menghindari fase gerak. Sampel dimasukan ke dalam loop menggunakan syringe yang memiliki kapasitas beberapa kali lipat dari sampling loop. (Harvey, 2000).

Kolom baja tahan karat (stainless steel) yang paling umum digunakan untuk HPLC memiliki panjang sekittar 30 mm hingga 300 mm dan diameter internal antara 2,1 mm dan 4,6 mm. Di dalam kolom ini, terdaoat 3-10 µm partikel silika berpori yang dapat berbentuk bulat atau tidak rata. Kolom ini berfungsi sebagai lokasi proses pemisahan berlangsung. (Harvey, 2000).

Sampel yang telah dipisahkan, dibawa ke detektor. Data dapat diolah dan ditampilkan melalui sinyal yang diberikan oleh detektor. Detektor yang dapat digunakan dalam HPLC, yaitu detektor spektroskopi (adsorpsi sinar UV) dan detektor kimia. Selain itu, ada juga detektor yang menggunakan pengukuran pada perubahan index refraksi fase gerak. Namun, detektor ini kurang efektif untu elusi gradien kecuali komponen fase gerak memiliki index refraksi yang sama. (Harvey, 2000).

HPLC dapat dianggap sebagai pengganti kromatografi gas. Dalam banyak kasus, kedua metode ini dapat digunakan untuk mendapatkan efek pemisahan yang sama efektif.

Jika derivatisasi diperlukan pada GC, HPLCdapat menganalisis zat yang tidak diderivatisasi. Meskipun demikian, HPLC akan memiliki peran yang lebih besar bagi para analis, bukan berarti menggantikan GC. Derivatisasi menjadi populer pada HPLC karena metode ini dapat meningkatkan sensitivitas detektor UV Visbel yang biasa digunakan.

Beberapa keuntungan lain dari HPLC, yaitu : 1. Waktu analisis cepat

2. Detektor absorbsi UV pada HPLC dapat mendeteksi kadar dalam nano gram, detektor fluorosensi dan elektrokimia dalam piktogram

3. Kolom dapat digunakanan kembali 4. Recovery sampel menjadi lebih mudah.

(De Lux Putra, 2004).

Validasi metode uji kafein dalam minuman kopi yang mengacu pada SNI 2983 : 2004. Validasi ini diperlukan karena metode ini merupakan metode baku yang dimodifikasi dan mengalami perubahan pada jumlah dan jenis sampel, pereaksi, dan laju alir yang digunakan.

Gambar 2. Stuktur Kafein

Kafein merupakan senyawa terpenting dalam uji kopi yang banyak terkandung di dalamnya. Kafein dapat mempengaruhi aroma dan cita rasa dalam kopi. Kafein ini lah yang mempengaruhi cita rasa kopi menjadi pahit. Kafein murni berupa serbuk berbentuk jarum halus berwarna putih yang mengkilat, tidak berbau, rasanya pahit, dan dapat meleleh pada suhu 236,5°C. Kafein bermanfaat secara klinis, seperti menstimulasi susunan sel saraf pusat, merelaksasi otot polos bronkus sehingga mengakibatkan penurunan mocus dan menstimulasi otot jantung. (Ramayulis, 2014).

C. Alat dan Bahan Alat:

1. Labu Erlenmeyer 250 mL (3 buah) 2. Gelas Kimia 50 mL (1 buah) 3. Pipet Ukur 5 mL (1 buah) 4. Labu Ukur 100 mL (5 buah) 5. Labu Ukur 25 mL (1 buah) 6. Labu Ukur 10 mL (6 buah) 7. Botol vial 2 mL (8 buah) 8. Filter Membran PTFE

Bahan:

1. Standar kafein (50 mg)

2. Sampel minuman kopi kapal api (secukupnya)

3. Larutan Pb asetat 23% (11,5 g/ 20 mL aquades)

4. Metanol (secukupnya) 5. Aquabides (secukupnya)

D. Set Alat

Gambar 1. Set Alat HPLC

E. Langkah Kerja dan Pengamatan

Pruang : Truang :

No. Langkah Kerja Pengamatan

PREPARASI LARUTAN STANDAR DAN SAMPEL 1. Preparasi Larutan Induk Kafein Wujud awal

- Kafein: padatan kristal putih, tidak berbau.

- Larutan sampel: cairan berwarna cokelat gelap, berbau seperti kopi - Aquabides: cairan tidak berwarna,

tidak berbau

- Pb asetat: cairan tidak berwarna, berbau seperti cuka

- Methanol: cairan tidak berwarna, berbau alcohol

Preparasi Larutan Induk Kafein 100 ppm

- Massa kafein: 2,5 mg - Methanol: ± 10 tetes

- Volume total larutan: 25 mL

- Kafein + methanol + aquabides = cairan tidak berwarna, tidak berbau - Konsentrasi = 100 ppm

2. Pembuatan Standar

- Pembuatan Standar 100 ppm

- Pembuatan Deret Standar

Tabel Deret Standar

ppm V larutan 100 ppm (μL)

5 500

10 1000

15 1500

20 2000

25 2500

- Volume total tiap deret = 10 mL (diukur dengan labu ukur 10 mL) - Larutan 100 ppm + aquabides =

larutan tidak berwarna, tidak berbau

3. Preparasi Larutan Sampel tanpa Spike

Preparasi Larutan Sampel tanpa Spike

- Sampel + aquabides + Pb asetat 23

% = larutan berwarna cokelat kekuningan, terdapat bulir-bulir kecil di dalam larutan

- Setelah dipanaskan = larutan menjadi berwarna kuning samar dan terbentuk kerak pada dinding labu Erlenmeyer serta padatan berwarna cokelat tua

4. Preparasi Sampel dengan Spike Standar 80 %, 100 %, dan 120 % Konsentrasi Standar

Preparasi Sampel dengan Spike Standar 80 %, 100 %, dan 120 % Konsentrasi Standar

- Larutan sampel berwarna hitam 3 mL + 0,067 mL larutan induk (80 %)

= Larutan berwarna hitam keruh - Ditambah aquabides 50 mL = larutan

berwarna hitam keruh

- Ditambah 1 mL Pb asetat 23 % =

larutan berwarna hitam kekuningan - Dipanaskan di suhu 100 ℃ selama

11 menit

- Didinginkan di suhu ruang, lalu di waterbath

- Ditambah aquabides ± 100 mL - Didekantasi, lalu difiltrasi

- Diulangi pembuatan larutan dengan jumlah larutan induk yang berbeda, yakni 0,083 mL (100 %) dan 0,1 mL (120 %)

Hasil: Didapatkan larutan spike standar 80 %, 100 %, dan 120 % berwarna kuning kehitaman

PERSIAPAN PENGAMBILAN DATA ANALISIS 1. Uji Kesesuaian Sistem

*Batas keberterimaan metode:

Presisi ¿ 2/3 CV Horwitz, factor tailing T ≤ 2

2. Linearitas

*Keberterimaan nilai korelasi:

Lebih dari (_¿) 0,990 3. % Recovery

*Batas keberterimaan % Recovery:

80 % - 115 %

F. Data Pengamatan

1. Larutan Induk 100 ppm

Konsentrasi (ppm) Waktu Retensi (min) Area

100 3,11 19101950

2. Larutan Deret Standar

Konsentrasi (ppm) Area Kafein

5 962384

10 1844337

15 2809867

20 3755489

25 4693534

3. Injeksi Larutan Standar 10 ppm

Pengulangan Absorbansi (Area) Konsentrasi (ppm)

1 1854923 9,888762409

2 1837658 9,796667182

3 1903634 10,14859737

4 1815517 9,678562322

5 1841417 9,816718497

6 1848820 9,856207693

4. Larutan Sampel tanpa Spike

Absorbansi (Area) Konsentrasi (ppm)

600280 3,1962

5. Larutan Sampel dengan Spike (80 %, 100 %, dan 120 %)

Repetisi Absorbansi (Area) Konsentrasi (ppm)

80 % 100 % 120 % 80 % 100 % 120 %

1 526994 546556 522957 2,8053 2,9097 2,7838

2 508523 533386 529886 2,7068 2,8394 2,8207

G. Perhitungan

1. Perhitungan Konsentrasi Larutan Induk Kafein (ppm) ppm=2,5mg

0,025L=100ppm

2. Perhitungan Volume Deret Standar

Konsentrasi 5, 10, 15, 20, dan 25 ppm dari larutan standar 100 ppm V₁=10mL

 10mL×5ppm=0,5mL=500μL

 10mL×10ppm=1mL=1000μL

 10mL×15ppm=1,5mL=1500μL

 10mL×20ppm=2mL=2000μL

 10mL×25ppm=2,5mL=2500μL 3. Perhitungan persentase recovery

%Recovery=Crerata spike

C_non−spike×100 %

 % Recovery Spike 80 %

%Recovery=

2,8053+2,7068 2

3,1962 ×100 %=86,23 %

 % Recovery Spike 100 %

%Recovery=

2,9097+2,8394 2

3,1962 ×100 %=89,94 %

 % Recovery Spike 120 %

%Recovery=

2,7838+2,8207 2

3,1962 ×100 %=87,67 %

 Rata-rata % Recovery

%Recovery_rerata=86,23 %+89,94 %+87,67 %

3 =87,95 %

4. Analisis Data

a. Uji Kesesuaian Sistem

1) Penentuan Presisi Rumus:

RSD=standar deviasi rata−rata ×100

CV Horwitz=2(1−0.5 log logC)

Perhitungan:

RSD=29382,50591

1850328,167×100=1,587961878

CV Horwitz=2(1−0.5 log 9,864252579)=1,41713

2) Efisiensi Kolom (jumlah plat teoritis) Rumus:

N=16( tr W )² Perhitungan:

N=16

(

^3,46170,72

)

^2=369,84988

3) LOD dan LOQ

Konsentrasi (ppm) absorbansi

x y y' y-y' (y-y')^2

5 962384 938431,6 23952,4 573717465,8

10 1844337 1875776,6 -31439,6 988448448,2

15 2809867 2813121,6 -3254,6 10592421,16

20 3755489 3750466,6 5022,4 25224501,76

25 4693534 4687811,6 5722,4 32745861,76

JUMLAH 1630728699

b. Uji Linearitas c. Akurasi d. % Recovery

%Recovery=Crerata spike

C_non−spike×100 %

 % Recovery Spike 80 %

%Recovery=

2,8053+2,7068 2

3,1962 ×100 %=86,23 %

 % Recovery Spike 100 %

%Recovery=

2,9097+2,8394 2

3,1962 ×100 %=89,94 %

 % Recovery Spike 120 %

%Recovery=

2,7838+2,8207 2

3,1962 ×100 %=87,67 %

 Rata-rata % Recovery

%Recovery_rerata=86,23 %+89,94 %+87,67 %

3 =87,95 %

H. Pembahasan

Pada percobaan yang berjudul “Validasi Metode Analisis Kafein (Uji Kesesuaian Sistem, Presisi, Akurasi, dan Linearitas)” dengan tujuan melakukan validasi metode analisis dalam minuman kopi (SNI 2983:2004) dan menentukan uji kesesuaian sistem, presisi, akurasi, dan linearitas. Percobaan ini dilakukan dengan menggunakan prinsip fasa terbalik, yaitu penggunaan kolom berisi fasa diam C-18 yang bersifat non polar dan fasa gerak berupa campuran metanol air (35:65) dengan sistem isokratik dimana komposisi fasa gerak selalu sama/konstan selama proses pemisahan. Digunakan fasa terbalik karena senyawa kafein sebagai senyawa yang akan dianalisis cenderung bersifat polar, sehingga tidak digunakan fasa normal karena jika menggunakan fasa normal analit kafein akan terikat kuat pada fasa diam yang menyebabkan waktu pemisahan tidak efektif.

Jumlah data (n) 5

n-1 4

Standar Deviasi 20191,14099

LOD 0,323111677

LOQ 1,077038923

Detektor Instrumen HPLC yang digunakan pada percobaan ini adalah detektor UV (ultraviolet) karena senyawa organik umumnya memiliki gugus kromofor yang mempunyai serapan spesifik, sehingga pada molekul yang mengandung beberapa gugus kromofor, molekul tersebut akan mengabsorpsi cahaya pada gelombang yang hampir sama dengan molekul yang hanya mempunyai satu gugus kromofor tertentu.

Sebelum memulai proses analisis pemisahan, pada percobaan ini dilakukan preparasi larutan standar terlebih dahulu dengan membuat larutan induk standar 100 ppm, caranya dengan menimbang padatan kafein 2,5 mg kemudian dilarutkan ke dalam labu ukur 25 ml dengan aquabides. Sebelum dilarutkan dengan air, kafein diberi cairan metanol beberapa tetes terlebih dahulu karena jika dilarutkan langsung dengan air kafein memiliki kelarutan yang rendah.

Setelah dibuat larutan induk 100 ppm, dibuat deret standar 5, 10, 15, 20, dan 25 ppm untuk uji linearitas. Kemudian dilakukan preparasi larutan sampel dari minuman kopi dengan larutan tanpa spike dan spike. Spiking adalah penambahan larutan sampel dengan larutan standar yang sudah dibuat. Hal ini bertujuan agar konsentrasi analit kafein dalam sampel minuman kopi meningkat, sehingga dapat memudahkan dalam analisis senyawa. Spiking dilakukan dengan konsentrasi standar 80%, 100%, dan 120%.

Setelah preparasi larutan selesai, dilakukan pengkondisian instrumen HPLC dengan mengatur fasa gerak metanol air menggunakan sistem isokratik, mengatur laju alir fasa gerak 0,75 mL/menit. Hal ini bertujuan agar fasa gerak dapat mengelusi analit yang lebih terikat pada fasa diam dengan lebih baik. Kemudian diatur detektor UV pada HPLC dengan panjang gelombang 272 nm. Volume larutan standar dan sampel yang diinjeksikan sebesar 20 µL.

volume larutan yang diinjeksikan tidak boleh terlalu banyak karena dapat menyebabkan band broadening (pelebaran puncak) pada kromatogram, lalu pada saat cuplikan diinjeksikan dengan syringe, tidak boleh terdapat gelembung udara. Jika terdapat gelembung udara pada syringe, akan menyebabkan puncak kromatogram menjadi tidak simetris. Kromatogram yang baik adalah kromatogram yang mempunyai puncak-puncak yang sempit dan simetris. Sebelum melakukan injeksi, syringe harus dibilas terlebih dahulu dengan larutan cuplikan yang akan diinjeksikan agar tidak terdapat kontaminan yang berpotensi masuk ke dalam proses pemisahan. Pada saat penginjeksian digunakan tipe valve injektor dimana cuplikan disuntikkan dalam posisi load kemudian kran diputar segera untuk mengubah posisi load menjadi posisi inject.

Metode analisis kualitatif dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi puncak- puncak analit dalam kromatogram larutan standar dan larutan sampel. Waktu retensi analit-

analit pada larutan standar dijadikan pembanding awal untuk menentukan adanya analit-analit yang serupa pada larutan sampel.

Analisis larutan standar 100 ppm

Berdasarkan hasil yang didapat, pada kromatogram larutan induk 100 ppm terdapat puncak utama yang menunjukkan area paling tinggi yang mana hal tersebut membuktikan bahwa senyawa kafein ditunjukkan dengan waktu retensi 3,11 menit. Waktu retensi dari senyawa kafein ini yang nantinya akan menjadi acuan pada cuplikan larutan sampel yang diuji menunjukkan waktu retensi spesifik dari senyawa kafein.

Ditunjukkan adanya beberapa puncak yang muncul pada kromatogram selain puncak khas senyawa kafein, artinya adalah masih ada zat pengganggu yang masuk pada proses pemisahan.

Analisis validasi metode

Validasi metode dilakukan sebagai analisis kuantitatif melalui uji kesesuaian sistem, perhitungan linearitas, limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ), presisi, dan akurasi.

1. Uji kesesuaian sistem

Uji kesesuaian sistem bertujuan untuk memastikan sistem kromatografi atau instrumen sudah berjalan dengan baik, efektif dan memberikan hasil analisis yang valid untuk pengujian. Uji kesesuaian sistem dilakukan dengan cara menginjekkan larutan baku standar sebanyak 6 kali ke dalam sistem HPLC. Larutan yang digunakan adalah larutan deret standar 10 ppm. Komponen penentuan uji kesesuaian sistem yang dilakukan meliputi presisi dan jumlah plat teoritis.

a. Presisi metode

gambar 1. Kromatogram larutan induk 100 ppm

Presisi adalah suatu ukuran yang mengacu pada kedekatan hasil yang diperoleh dari pengukuran berulang pada sampel yang sama dengan menggunakan metode yang sama.

Sederhananya, presisi menunjukkan seberapa konsisten suatu metode dalam menghasilkan hasil pengukuran. Penentuan presisi dilakukan dengan cara membandingkan nilai RSD (relative standard deviation) terhadap CV Horwitz. Dihitung dengan rumus sebagai berikut.

RSD=standar deviasi rata−rata ×100 CV Horwitz=2^{(1−0.5 logC)}

Berdasarkan perhitungan dari data yang diperoleh didapat nilai %RSD sebesar 1,587961878 dan CV Horwitz sebesar 1,41713. Dari hasil tersebut menunjukkan bahwa presisi dapat dikatakan baik karena nilai %RSD yang diperoleh < 2%.

a. Jumlah plat teoritis

Jumlah plat teoritis (N) adalah banyaknya distribusi keseimbangan yang terjadi pada suatu kolom. Plat teoritis digunakan untuk menunjukkan efisiensi kolom. Efisisensi kolom berhubungan dengan pelebaran puncak dari pita awal keetika melewati kolom. Efisisensi kolom dikatakan baik jika didapatkan N > 2000. Semakin besar nilai N, maka semaikn baik pemisahannya. Jumlah plat teoritis dapat dihitung dengan persamaan sebagai berikut

N=16

(

^wt

)

²

Tabel 1. Data hasil penentuan nilai presisi

Keterangan:

N : jumlah plat

Tr : waktu retensi (menit) W : lebar puncak

pengulangan Absorbansi konsentrasi (ppm)

1 1854923 9,888762409

2 1837658 9,796667182

3 1903634 10,14859737

4 1815517 9,678562322

5 1841417 9,816718497

6 1848820 9,856207693

Rata-rata 1850328,167 9,864252579 standar deviasi area 29382,50591

rata-rata area 1850328,167

%RSD 1,587961878

Cvhorwitz 1,41713

pengulangan waktu retensi kafein lebar puncak

1 3,59 0,72

2 3,11 0,7

3 3,39 0,69

4 3,52 0,75

5 3,57 0,72

6 3,59 0,74

rata rata 3,461666667 0,72

Efisiensi kolom 369,84988

Berdasarkan hasil perhitungan, didapat jumlah palt teoritis untuk kafein sebesar 369,84988.

Hasil ini menunjukkan nilai yang kecil dari syarat keberterimaan (N > 2000), sehingga dapat disimpulkan efisiensi kolom tidak baik dalam memisahkan komponen analit.

1. Uji Linearitas

Dalam uji validasi metode, linearitas mengacu pada kemampuan suatu metode analisis untuk menghasilkan respon yang proporsional dengan konsentrasi analit dalam sampel.

Linearitas penting untuk memastikan bahwa hasil analisis akurat dan dapat diandalkan. Uji linearitas dapat dilakukan dari hasil data deret standar yang sudah diinjeksikan, kemuadian dibuat kurva kalibrasi. Berikut adalah hasil kromatogram dari deret standar.

Tabel 2. Data perhitungan jumlah plat teoritis

Gambar 2. Kromatogram deret standar 5 ppm Gambar 3. Kromatogram deret standar 10 ppm

Uji linearitas dapat diperoleh dari kurva kalibrasi. Kurva kalibrasi dapat diperoleh berdasarkan data pada Tabel 3 dengan membuat plot konsentrasi kafein dari deret standar dengan area absorbansinya.

Pada gambar 7, menunjukkan hubungan linear antara kadar kafein (ppm) dengan absorbansi area kafein. Hubungan ini dapat dirumuskan dengan persamaan y = 187469x + 1086,6. Nilai + 1086,6 pada persamaan menunjukkan kepekaan analisis, terutama pada instrumen yang digunakan. Nilai koefisien determinasi kurva linearitas (R²) adalah 0,9998 dan nilai koefisien

Gambar 4. Kromatogram deret standar 15 ppm

Gambar 5. Kromatogram deret standar 20 ppm

Gambar 6. Kromatogram deret standar 25 ppm Tabel 3. Data analisis larutan deret standar

0 5 10 15 20 25 30

0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000

f(x) = 187469.04 x + 1086.60000000009 R² = 0.99981443246633

Kurva Kalibrasi

konsentrasi (ppm)

absorbansi

konsentrasi (ppm) absorbansi

x y

5 962384

10 1844337

15 2809867

20 3755489

25 4693534

korelasi sebesar 0,999899995 Ini menunjukkan bahwa linearitas metode ini sangat baik, karena memenuhi syarat keberterimaan validasi yaitu R² > 0,99.

3. Limit of detection (LOD) dan limit of quantification (LOQ)

LOD adalah batas terendah konsentrasi analit yang dapat dideteksi dengan tingkat keyakinan tertentu. LOQ adalah batas terendah konsentrasi analit yang dapat dikuantifikasidengan tingkat presisi dan akurasi yang dapat diterima. LOD dan LOQ dapat dihitung berdasarkan standar deviasi dari kurva kalibrasi. Berikut adalah data perhitungan LOD dan LOQ.

Berdasarkan perhitungan didapat hasil LOD sebesar 0,323111677 ppm dan LOQ sebesar 1,077038923ppm. Nilai LOD artinya batas terendah dari konsentrasi kafein yang masih dapat terdeteksi adalah sebesar 0,323111677 ppm, sedangkan nilai LOQ sebesar 1,077038923 ppm artinya batas terendah konsentrasi kafein yang masih dapat dikuantifikasi, dapat terdeksi oleh detektor dengan tingkat presisi dan akurasi yang dapat diterima.

4. Akurasi metode

Akurasi adalah suatu ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Akurasi dapat dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (%

recovery) analit yang ditambahkan. Pendekatan uji akurasi yang dilakukan pada percobaan ini adalah dengan cara melakukan spiking larutan standar (80%, 100%, 120%) pada sampel.

Berikut adalah data kromatogram hasil analisis sampel non spike dan sampel dengan spiking.

Berdasarkan perhitungan, diperoleh persen recovery rata-rata dari ketiga larutan spike standar 80%, 100%, dan 120% sebesar 87,95%. Hal ini menunjukkan bahwa hasil analisis metode yang digunakan memiliki tingkat akurasi yang cukup baik.

Pada percobaan ini terdapat beberapa faktor kesalahan yang mempengaruhi analisis data. Terdapat 3 jenis kesalahan, yaitu gross error, systematic error, dan random error. Gross error terjadi akibat tidak kompetennya praktikan, terutama pada preparasi larutan sampel yang dilakukan oleh beberapa praktikan yang berbeda, sehingga mendapatkan perlakuan yang berbeda pula dan memengaruhi hasil analisis data yang diperoleh. Systematic error terjadi akibat alat ukur yang memiliki akurasi rendah, pengaruh kondisi lingkungan pengujian, seperti tekanan dan suhu pada ruangan tempat instrumen HPLC. Kemudian random error atau kesalahan acak yang mungkin dapat terjadi salah satunya karena adanya fluktuasi listrik dari alat instrumen.

I. Kesimpulan

Pada percobaan yang berjudul “Validasi Metode Analisis Kafein (Uji Kesesuaian Sistem, Presisi, Akurasi, dan Linearitas)” dengan tujuan melakukan validasi metode analisis dalam minuman kopi (SNI 2983:2004) dan menentukan uji kesesuaian sistem, presisi, akurasi, dan linearitas. Validasi metode dilakukan dengan beberapa parameter melalui uji kesesuaian sistem, perhitungan linearitas, limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ), presisi, dan akurasi. Pada uji kesesuaian sistem, dilakukan uji presisi metode dan menghitung jumlah plat teoritis. Uji presisi dilakukan dengan membandingkan nilai %RSD dengan CV Horwitz. Berdasarkan perhitungan dari data yang diperoleh didapat nilai %RSD sebesar 1,587961878 dan CV Horwitz sebesar 1,41713. Dari hasil tersebut menunjukkan bahwa presisi dapat dikatakan baik karena nilai

%RSD yang diperoleh < 2%. Pada perhitungan jumlah plat teoritis diperoleh hasil nilai

(N) sebesar 369,84988. Hasil ini menunjukkan nilai yang kecil dari syarat keberterimaan (N > 2000), sehingga dapat disimpulkan efisiensi kolom tidak baik dalam memisahkan komponen analit. Untuk uji linearitas diperoleh nilai koefisien determinasi kurva linearitas (R²) adalah 0,9998 dan nilai koefisien korelasi sebesar 0,999899995 Ini menunjukkan bahwa linearitas metode ini sangat baik, karena memenuhi syarat keberterimaan validasi yaitu R² > 0,99. Pada uji LOD dan LOQ didapat hasil secara berturut-turut sebesar 0,323111677

ppm

dan 1,077038923 ppm. Kemudian pada uji akurasi metode, melalui perhitungan didapat persentase recovery dari ketiga larutan spike standar (80%, 100%, dan 120%) sebesar 87,95%. Hal ini menunjukkan bahwa hasil analisis metode yang digunakan memiliki tingkat akurasi yang cukup baik.

Faktor kesalahan yang terjadi pada praktikum ini terdapat 3 jenis kesalahan, yaitu gross error, systematic error, dan random error. Gross error terjadi akibat tidak kompetennya praktikan. Systematic error terjadi akibat alat ukur yang memiliki akurasi rendah, pengaruh kondisi lingkungan pengujian. Kemudian random error atau kesalahan acak yang mungkin dapat terjadi salah satunya karena adanya fluktuasi listrik dari alat instrumen.

J. Daftar Pustaka

Bohari. (2021). Kimia Pemisahan. Bogor: IPB Press

Budhiraja. (2004). Separation Chemistry. New Delhi: New Age International

De Lux Putra. (2004). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi. Jurnal Halaman 8

Harvey, David. (2000). Modern Analytical Chemistry. USA: McGraw-Hill

Hendayana, S. (2006). Kimia Pemisahan: Metode Kromatografi dan Elektroforesis Modern.

Bandung: PT. Remaja Rosdakarya

Lestari. (2014). Validasi Metode Penetapan Kadar Dalam Plasma Darah Secara In Vito Menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Jakarta : UIN Syarif Hidayatullah

Permanasari, Anna, dkk. (2008). Kimia Analitik 2. Tangerang Selatan: UT Ramayulis. (2014). Detox Is Easy. Jakarta : Penebar Swadaya Grup

K. Lampiran

CORET CORET PEMBAHASAN

1. Pembukaan (jgn lupa sebutin SNI 2983: 2004) 2. Analisis kualitatif (pembuktian kadar kafein),

penjelasan waktu retensi kafein.

3. Analisis kuantitatif

4. Validasi metode (UKS: PRESISI (untuk %rsd dan cv hormitz, factor tailing), AKURASI, DAN LINEARITAS) 5. LINEARITAS

- YG DIPLOT SAMA IRIN (LOD DAN LOQ) 6. LOD DAN LOQ

7. AKURASI DARI %RECOVERY 8. Faktor kesalahan

- Proses injeksi dilakukan oleh orang2 yg berbeda, maka perlakuannya juga berbeda sehingga

menghasilkan kromatogram yang kurang baik - Proses pengenceran tidak dilakukan dengan

benar

- Praktikan yang belum berpengalaman - Alat yang kurang bersih karena proses

pembersihan kurang maksimal

-