第 5 回 独立栄養細菌の保存法について

1．はじめに

 独立栄養細菌 Lithoautotrophic bacteria は炭酸固定 能を有する細菌である．呼吸あるいは光合成でエネル ギーを獲得し，無機物を酸化することで必要な電子を 得る．

 呼吸によりエネルギーを得る化学独立栄養細菌は，

NH3，NO2−，H2，硫黄化合物，鉄（Fe^2＋）など酸化 される無機物（電子供与体）の種類で分類される （e.g. 

硫黄を酸化する場合，硫黄酸化細菌），また，電子受 容体として O₂を利用する好気性細菌，O₂以外の物質

（硝酸など）を利用する嫌気性細菌が存在する．光合 成独立栄養細菌については，嫌気・光条件下で H2や 硫黄化合物等を電子供与体として利用するものが知ら れている．

 分離株を得るのに大変な時間と労力を要する独立栄 養細菌だが，分離後は脆弱となり死滅する危険性が高 まる．継代維持する場合もあるが，継代中に突然増殖 活性がなくなることもしばしばである．分離株の中に は，①増殖速度が遅い，②収量が得られない，③有機 物による増殖阻害がかかる，④自ら産生する強酸に悪 影響を受ける，⑤凍結や乾燥に対する感受性，⑥コロ ニー形成出来ない，などの性質を有し，培養・保存（継 代維持）・管理が困難なものも多い．それゆえに，適 切に保存し，安定的に株を維持することが，独立栄養 細菌の研究を行うための必要条件であると考える．

 本稿では，特に保存が難しいとされる，硝化細菌と，

好気性好酸性の硫黄酸化細菌

と鉄酸化細菌 の

保存を中心に解説する．また嫌気性細菌の培養・保存 に役立つ，平板培養時のガス組成の設定方法について 紹介する．

2．硝化細菌の保存について

 窒素循環における硝化反応（NH₃→ NO₂⁻→ NO₃⁻） を担うアンモニア酸化細菌と亜硝酸酸化細菌は，近年 の環境問題への関心の高さを反映して益々その重要性 を増しているが，取扱いの難しさが研究の妨げとなっ ている．表 1 のように分類学的基準株でさえ十分な研 究の態勢にあるとは言い難く，この状況が硝化細菌の 保存の難しさを物語っている．

 この項では，NBRC で行っている L‑乾燥保存と，

既報の様々な保存法について紹介する．

1）L‑乾燥保存

 硝化細菌の分散媒は，坂根ら（1996）が検討した SM8（表 2）を使用している．アドニトール（radical  scavenger）とシステインの組合せは変異防止剤とし て有効だが，保護効果を現すためにはグルタミン酸ナ トリウムを含むリン酸緩衝液に添加されることが必要 である（坂根ら，1982；1985）．硝化細菌はグルタミ ン酸ナトリウムやリン酸で増殖阻害がかかる場合があ るので，一般的な従属栄養細菌用の分散媒 SM1 より

第 5 回  

独立栄養細菌の保存法について

内野佳仁

独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門（NBRC） 

〒292‑0818 千葉県木更津市かずさ鎌足 2‑5‑8

Preservation of lithoautotrophic bacteria

Yoshihito Uchino

NITE Biological Resource Center (NBRC), Department of Biotechnology,   National Institute of Technology and Evaluation  

2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu, Chiba 292-0818, Japan

E-mail: uchino@nbrc.nite.go.jp 連載「微生物資源の保存技術講座」

低濃度に設定している．定常期初期まで培養（Griess 比色法やセルカウント等で判断）した菌体を SM8 に 懸濁し，L‑乾燥に供する．菌液の細胞濃度は出来る だけ高く 10⁹〜 10¹⁰ CFU/m を目安とする．硝化細 菌は通常の培養法では菌密度が得られないので，大量 の培養液を遠心などで濃縮することで対応する．復元 する際には，グルタミン酸ナトリウムによる増殖抑制 を避けるため，分散媒から持ち込まれるグルタミン酸 ナトリウムを 50 

mg/m 以下に希釈して培養，また，

過剰な O2の存在も抑制に働く場合があるので静置培

養する．

 同法は分散媒のグルタミン酸ナトリウムを低濃度と することで保護効果が減少するという面もあり（坂根，

今井，1986），増殖阻害のない保護効果を有する物質 について今後検討の余地があると考える．

2）凍結保存について

 細菌の凍結保存法としては，低濃度の凍結保護剤を 細胞に浸透させた後，緩慢な凍結で細胞内を脱水する ことで凍結保護剤を濃縮し，保護効果を高める緩慢凍 表1 硝化細菌の分類学的基準株

Ammonia-oxidizing bacteria

(Migula 1900) Buchanan 1925 no culture isolated (Watson 1965) Watson 1971 ATCC 19707 Winogradsky and Winogradsky 1933 no culture available (Watson  . 1971) Head  . 1995 ATCC 25196, C-71 (ex Harms  . 1976) Head  . 1995 Nv-1

Koops  . 2001 Nm 36

Koops  . 2001 Nm 2

Winogradsky 1892 ATCC 25978

Koops  . 2001 Nm 57

Koops  . 2001 Nm 1

Koops  . 2001 Nm 22

Koops  . 2001 Nm 90

Koops  . 2001 Nm 45

Koops  . 2001 Nm 10

Nitrite-oxidizing bacteria

Sorokin  . 1999 AN1, LMD 97.163

Bock  . 2001 DSM 10229, X14

Bock  . 2001 DSM 10236, Z

Winslow  . 1917 ATCC 25391, DSM 10237, CIP 104748 Watson and Waterbury 1971 ATCC 25380, CIP 104751

Watson and Waterbury 1971 no culture available

Watson  . 1986 ATCC 43039

Ehrich  . 2001 DSM 10035 (not available from the DSMZ), NSP M-1 2008 年 3 月現在，アンモニア酸化細菌は 3 属 14 種，亜硝酸酸化細菌は 4 属 8 種が記載されている．うち基準株が利用出来 ないものが 3 種．異なる国のカルチャーコレクション 2 機関で保存されていないものが 16 種（細菌命名規約に抵触）．

属 8 種と の基準株は，論文著者のグループ（University  of  Hamburg,  Germany）でのみ 保存している．

表2 独立栄養細菌のL‑乾燥保存に用いられる分散媒

SM1: Sodium  glutamate  3  g,  Adonitol  1.5  g,  Cysteine  HCl  0.05  g,  0.1M  Phosphate  buffer  (KH2PO4‑ K2HPO4, pH 7.0) 100 m .

SM5: Sodium glutamate 3 g, Adonitol 1.5 g, Sorbitol 1 g, Ethylenediamine 2HCl 0.4 g, 0.1M Phosphate  buffer (KH2PO4‑K2HPO4, pH 7.0) 100 m .

SM8: Sodium  glutamate  0.5  g,  Adonitol  1.5  g,  Cysteine  HCl  0.01  g,  0.02M  Phosphate  buffer  (KH2PO4‑ K2HPO4, pH 7.0) 100 m .

SM9: Sodium glutamate 0.5 g, Sucrose 0.2 g, 0.02M KH2PO4 solution 100 m .

The solution is pH adjusted to 4.0 by adding of 5% phosphate solution, and sterilized by filtration.

結法が一般的であるが（Pegg, 1976），これを硝化細 菌に適用するのは難しい．例えば

 NBRC 14298 の場合，定常期初期の菌体を 10％

DMSO-HEPES 培地（NBRC medium No. 829）に懸 濁，−80℃ディープフリーザーで凍結し，そのまま保 存すると，失敗する．

 硝化細菌の凍結保存が難しいとされるのは，凍結障 害を受けやすい部位（細胞膜など）の損傷が硝化細菌 にとって致命的となるからだろう．それでも保護剤の 種類・濃度，凍結速度，プログラムフリーズ（Nishii ＆  Nakagiri, 1991），あるいは瞬間凍結による細胞試料の ガラス化など検討し，最適条件を見出すことが出来れ ば保存は可能なはずと考える．

3）既報の保存法

（1）流動パラフィン重層法

 細菌の保存法は大きく 2 つ，①細胞内外の水の状態 を凍結や乾燥で限定する方法と，②水の動きを止めず 細菌の代謝活性を低下させて生存期間を長くする方法 がある．硝化細菌のように凍結や乾燥保存が難しい場 合は継代維持するしかないが，死滅とコンタミの危険 性を低くするためにも継代間隔を長くする②の方法は

重要である． はアンモニア供給を制限

すると休眠状態となり長く保持されるとの報告がある が（Johnstone ＆ Jones, 1988）， 保 存 法 と し て は Klein（1957）と Gundersen（1957）の流動パラフィ ンを使った報告がある．Klein（1957）は

を培養後，培地を流動パラフィンでカバーすると 室温で 3 〜 7 ヶ月間保存できると報告した．また，

Gundersen（1957）は植菌後すぐにミネラルオイルで カバーしたものでも保存可能であるとした．植菌後し ばらく増殖するが，培地内の O₂を消費した後は増殖 がストップするとある．

（2）シリカゲルを用いた凍結保存法

 本法はリン酸緩衝液（0.05M, pH 8.0）に懸濁した菌 液を脱水したシリカゲルパウダーに吸着させ，−80℃

で保存する方法である（Tokuyama, 1994）．シリカゲ ル吸着時の発熱をドライアイス−アセトン浴で抑え る．菌液に対するシリカゲルの量は発熱量に関わるの で注意が必要である．簡便ではないが Tokuyama ら のグループはこの方法で多様な分離株を保存してお り，実績がある．シリカゲルの作用機作は不明．

（3）凍結乾燥保存

 上記と同じ Tokuyama らのグループが用いている 方法（Satoh  ., 2004）．10％スキムミルク＋1％ピ

ルビン酸（菌種によっては 1％グルタミン酸）を蒸留 水に溶かして分散媒とする（pH 9）．緩衝剤は入れな い．スキムミルク分散媒の滅菌は 105℃，8 分のオー トクレーブで行う．乾燥標品は−80℃で保存．シリカ ゲルストックより有効とされる．

3．硫黄酸化細菌，鉄酸化細菌の保存について  硫黄化合物を酸化して呼吸によりエネルギーを獲得 する細菌は非常に多様であり，数多くの好気性あるい は嫌気性細菌が報告されている．ここでは特に保存が 難しいとされる好気好酸性の

と を中心に述べる．分離株の多

くが凍結保存あるいは乾燥保存が可能だが，難しい場

合もあり， 属の保存法は大いに参考

になると考える．嫌気性細菌については下記 4 で述べ る．

1） ,  , 

の L‑乾燥保存

  と 用の分散媒は硝化

細菌と同様 SM8 を用いる． の中には 中性域 pH に感受性の菌種があり（NBRC 14246 等）， 

pH 4 に 調 製 し た SM9 を 用 い る（Imai ＆ Sakane,  1985; 坂根，今井，1986）．pH 4 でオートクレーブす るとグルタミン酸ナトリウムが分解されるので分散媒

の滅菌はろ過で行う． の保存には分散媒

SM5 を用いる．エチレンジアミン二塩酸は細胞膜の 保護効果を有し，ソルビトールと併用すると相乗的な 高い効果が得られる（坂根，今井，1988）．振とう培 養する場合は容器壁面に付着しやすい硫黄ではなくチ オ硫酸塩や四チオン酸塩等を用いる．定常期初期まで 培養（吸光度 OD₅₀₀で判断可能）（Gupta ＆ Agate,  1986; Barron ＆ Lueking, 1990）した菌液から鉄や硫 黄等の夾雑物を低速遠心や傾斜により取り除き，菌体 を 1 〜 2 回分散媒で洗浄することで硫酸等を取り除い てから分散媒に懸濁，L‑乾燥に供する．

と の復元培養時に分散媒から持

ち込まれる有機物に留意する点，静置培養とする点は 硝化細菌と同じである．

2）既報の保存法

（1）凍結保存法

 Manchee（1975）は凍結保護剤処理をせずに の培養液（30 m）を直接液体窒素に滴下 する超急速凍結法について報告し，10⁹ CFU/m の菌

液を保存した場合，3 年後，10⁷ CFU/m （1％）生存 していることを示した．また，Gupta ＆ Agate（1986）

は，菌体を洗浄，5％グリセロール処理した菌液をキャ ピラリーに充填し液体窒素に浸漬する方法が有効であ ることを示した．低濃度の凍結保護剤を用いてはいる が Gupta ＆ Agate の方法は Manchee と同様に超急 速凍結によりガラス状凍結を行う方法である．

（2）低温での保持

  と は継代により維持

される場合が多いが，エネルギー源の枯渇や生成され る硫酸の影響を考慮して短い間隔で植継ぎをしなけれ ばならない．培養液を冷蔵することで長く生育活性を 保つことはできるが，硫黄酸化能，鉄酸化能は急速に 退行する．Gupta ＆ Agate（1986）は，菌液に黄銅 鉱 chalcopyrite ore（CuFeS2）を混ぜることで，

と を 8℃で，硫黄・鉄酸

化能を高く保ったまま維持できることを示した．

（3）グリシンベタインを保護剤とした L‑乾燥保存  American Type Culture Collection（ATCC）の Cleland ら（2004）は，細胞の浸透圧に関連のある物

質グリシンベタインが， の L‑乾燥保

護剤としても有効であることを示した．

4．嫌気性独立栄養細菌について

 化学独立栄養細菌のエネルギー源となる物質の多く は自然界の嫌気的な環境で作られ蓄積・拡散される．

酸素呼吸を行う独立栄養細菌は，O2が存在する環境 下で H₂や硫黄化合物の非生物的な自動酸化と競争し つつそれらを利用するため，好気性ではあるが好気 ‑ 嫌気の狭間に生息する宿命を持つ．

 化学独立栄養細菌は嫌気環境と関係が深い．実際，

嫌気性化学独立栄養細菌は数多く分離されている．ま た，光合成独立栄養細菌（Photolithoautotroph）は基 本的に嫌気性である．

 嫌気性細菌の保存法については，本連載「第 3 回  極限環境微生物の長期保存法」（森，2007）に詳細が あるので参照されたい．本項では嫌気性細菌の平板培 養時のガス組成の設定方法について紹介する．

1）平板培地周りのガス組成を設定する方法

 分離株を保存管理する上でコロニー形成ができるか 否かは非常に重要である．ガス組成を変えることで独 立栄養細菌の増殖が改善される場合があり，固体培地 周りのガス組成を細かく設定する方法は有益である．

ブチルゴム栓付バイアル瓶内で固体培養するのが確実 だが，もし平板培地を使う場合は図 1 のように，アネ ロパックのパウチ袋（三菱ガス化学）に粘着シール付 ラバーセプタム（PBI-Dansensor A/S, Denmark）を 貼ったものを使用する．ガスはセプタムを通して注射 針を刺入し封入する．CO₂を使用する場合は pH 変化 を液体培地で確認した上で行う．

2）スルフィドを電子供与体として利用する菌株の場 合

 スルフィドを利用する細菌の場合は，嫌気ジャー内 でチオアセトアミドを酸加水分解し，硫化水素を発生 させる方法が有効である（図 2）．スルフィドは平板 培地に浸透し，酸化還元電位は下がりレサズリンは無 色となる．著者は，絶対嫌気性である緑色硫黄細菌の 平板培養をこの方法で行っている．

図1 ラバーセプタムを貼りつけたアネロパックパウチ袋 図2 2.5 L 角型ジャー

a：アネロパック・ケンキ，b：試験管（チオアセトア ミド 100 mg＋0.5N HCl 1 m ）

5．おわりに

 保存が難しいとされる独立栄養細菌でも菌体量を得 ることが出来れば，少なくとも死滅は免れるような保 存処置を施すことが出来る．独立栄養細菌の保存で一 番難しいのは，保存そのものよりも培養，菌体量を得 ることである．

 本稿で紹介した方法は培養が比較的容易な菌種につ いてのものであり，最も重要な「培養」には触れてい ないことを最後に付言しておきたい．

謝 辞

 独立栄養細菌の保存についてご指導ご鞭撻を賜りま した坂根 健氏と中川恭好博士，また，いつも適切な 助言を頂いている森 浩二博士に心から感謝いたしま す．

文 献

Barron,  J.L.  &  Lueking,  D.R.  (1990).  Growth  and  maintenance  of    cells. 

Appl. Environ. Microbiol. 56: 2801-2806.

Cleland,  D.,  Krader,  P.,  McCree,  C.,  Tang,  J.  & 

Emerson,  D.  (2004).  Glycine  betaine  as  a  cryopro- tectant for prokaryotes.  J. Microbiol. Methods 58: 

31-38.

Gundersen,  K.  (1957).  Preservation  of  .  Nature 179: 789.

Gupta,  S.G.  &  Agate,  A.D.  (1986).  Preservation  of   and 

 with activity check.  Antonie van Leeuwen- hoek 52: 121-127.

Imai, K. & Sakane, T. (1985). Preservation of chemoli- thotrophic bacteria by L-drying,   Fundamentals  and  applications  of  freeze-drying  to  biological  materials,  drugs  and  foodstuffs,  p.  233-234,  International Institute of Refrigeration, Paris.

Johnstone,  B.H.  &  Jones,  R.D.  (1988).  Physiological  effects  of  long-term  energy-source  deprivation  on  the survival of a marine chemolithotrophic ammo- nium-oxidizing  bacterium.    Mar.  Ecol.  Prog.  Ser. 

49: 295-303.

Klein,  R.  (1957).  Preservation  of  .  Nature 179: 1200.

Manchee,  R.J.  (1975).  Long  term  storage  of  .  J. Appl. Bacteriol. 38: 191-192.

森 浩二（2007）．極限環境微生物の長期保存法─高 度好塩性古細菌，好熱性好酸性古細菌，メタン生成 古細菌─．日本微生物資源学会誌 23：17‑21.

Nishii, T. & Nakagiri, A. (1991). Liquid nitrogen stor- age  of  oomycetous  fungi:  examination  of  cooling  rates and improvement of the freezing tube case. 

Bull. Jpn. Fed. Cult. Coll. 7: 90-96.

Pegg,  D.E.  (1976).  Long-term  preservation  of  cells  and tissues: a review.  J. Clin. Pathol. 29: 271-285.

坂根 健，今井 紘（1986）．L‑乾燥法による細菌株 の保存（第 2 報）．凍結及び乾燥研究会会誌 32： 

47‑53.

坂根 健，今井 紘  (1988)． 属細菌の L‑乾燥保存における二塩酸エチレンジアミンの保 護効果．凍結及び乾燥研究会会誌 34：60‑65.

坂根 健，坂野 勲，飯島貞二（1982）．L‑乾燥保存 における変異を防止する保護剤．凍結及び乾燥研究 会会誌 28：77‑82.

坂根 健，今井 紘 & 坂野 勲（1985）．L‑乾燥保 存による変異誘発を防止する保護剤（第 3 報）シス テインの保護作用．凍結及び乾燥研究会会誌 31： 

27‑35.

坂根 健，西井忠止，伊藤忠義，見方洪三郎（1996）．

L‑乾燥法による微生物株の長期保存法．日本微生 物資源学会誌 12：91‑97.

Satoh,  K.,  Tanaka,  T.,  Oguro,  Y.,  Takahashi,  R.  & 

Tokuyama, T. (2004). Improvement of preservation  method for ammonia-oxidizing bacteria by freeze- drying.  Soil Sci. Plant Nutr. 50: 777-781.

Tokuyama, T. (1994). A method for long-term preser- vation  of  a  chemoautotrophic  ammonia-oxidizing  bacterium,    using  silica  gel  powder. 

Bull. Jpn. Soc. Microbiol. Ecol. 9: 119-123.

  （担当編集委員：岡根 泉）