脂溶性化合物を輸送するトランスポーター

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ビタミン B¹発見 100 周年祝典・記念シンポジウム

鈴木梅太郎博士

記念シンポジウム

はじめに

アミノ酸，糖類，そしてビタミンなどの食物中の栄養素は，小腸から吸収され肝臓に運ばれた後，全身の細胞へと血流に乗って運ばれ利用される．特に，ビタミンB 類，ビタミンCをはじめ水溶性栄養素は，細胞を取り囲む細胞膜を自由拡散では通過できないため，小腸から吸収されるには，これらを選択的に輸送するトランスポーター蛋白質が必要である．たとえば，ビタミンB1は小腸上皮細胞に存在するTHTR-2という名のトランスポーターによって体内へ輸送されており，この蛋白質の遺伝子を欠損させたマウスでは，食物中のビタミンB1が吸収されずその欠乏症が発症する^（1）．

一方，脂溶性ビタミンであるA, D, E, Kなどは細胞膜の脂質に自由に溶け込むため，自由拡散で吸収され，全身の細胞へと循環すると長い間考えられてきた．しかし最近，ビタミンEの吸収に，小腸上皮細胞に発現する NPC1L1とABCA1の2つの脂質トランスポーターが関与していることが示唆され，脂溶性ビタミンの吸収や体内循環にも選択的な輸送体が必要であると考えられ始めている．本稿では，さまざまな脂溶性化合物を輸送する ABC （ATP Binding Cassette）蛋白質と名付けられた一群のトランスポーターの生理的役割をまず紹介し，特

に動脈硬化症を防ぐ上で重要な，コレステロール恒常性維持の鍵を握るABCA1について説明する．

多剤排出ポンプMDR1

日本人の死因で最も多いのは癌であり，3割近くに達する．癌は，外科的な摘出や抗癌剤で治療できればそれほど怖くはない．しかし，抗癌剤治療によって癌が治癒し退院した後でも，数年あるいは10年後に残念ながら再発してしまうことが多い．再発したとき，癌は転移している上に，治療に用いた抗癌剤だけでなく構造の異なる他の抗癌剤に対して耐性であることが多い．それを癌の獲得多剤耐性と呼び，癌による死亡の大半に関係する．

筆者は，抗癌剤の作用機構の研究^（2, 3）で博士号を取得した後，癌の多剤耐性を研究していた米国のPastan博士とGottesman博士のグループに1985年に加わった．

そして，多剤耐性となった癌細胞で過剰発現している膜蛋白質の遺伝子を単離することに成功した^（4）．その遺伝子は，多剤耐性（MultiDrug Resistance）の頭文字をとってと名付けられた．MDR1は，細胞膜上で ATP加水分解に依存してさまざまな構造の抗癌剤を排出する多剤排出ポンプという興味ある活性を発揮し，細

農芸化学の伝統と先端生命科学の進展

健康をまもるABC蛋白質

植田和光

京都大学大学院農学研究科，京都大学物質-細胞統合システム拠点

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胞を多剤耐性にすることが明らかになった^（5）．さらに，

MDR1は食物中に含まれるさまざまな脂溶性有害物の小腸からの吸収を抑制するとともに，それらの肝臓や腎臓を介した体外への排泄や，脳，精巣，胎児などの有害物に対する防御に関わっている．このようにMDR1は，

多くの薬剤の小腸からの吸収性や薬物動態に大きな影響を与え，薬物相互作用に関与している．

MDR1が低親和性で多種類の脂溶性物質を認識し輸送するということは，それまでの生化学の常識を破る2 つのことを示した．1つ目は，自由拡散で細胞膜を通過すると考えられてきた脂溶性化合物の輸送や体内動態にもトランスポーターが関与しているということであり，

2つ目は，生理的に重要な反応は特異性が高く親和性が高いという生化学の常識はいつも正しいとは限らないということである．

では，MDR1はどのようなメカニズムでさまざまな構造の化合物を認識し，輸送しているのだろうか？それは，MDR1の発見以来25年間謎につつまれたままである．筆者らは，10年以上にわたって，京都大学大学院薬学研究科の加藤博章教授と構造解析の努力を重ねてきた．最近，pH1.5, 水温45℃という環境で生育する単細胞真核生物のもつMDR1類縁蛋白質の解析に，筆者らのグループの小段篤くんが成功した（投稿準備中）．今

後，ABC蛋白質の基質認識機構や輸送機構の理解が深まると期待している．

ABC蛋白質と疾病

ゲノム解析の結果，ヒトの染色体上には約50のABC 蛋白質遺伝子がコードされていることが明らかになった．それらは，いずれも12 〜17の膜貫通

α

ヘリックスと2つのATP結合ドメインをもち，ハーフサイズのものはホモ二量体あるいはヘテロ二量体として機能する．

ATP結合領域のアミノ酸配列の相同性によってAから Gまで7つのサブファミリーに分けることができ，

MDR1はBサブファミリーの1番ABCB1という統一名が与えられている（図

1

_）．これらの多くは，MDR1と同様にATP依存排出ポンプとして機能し，膜脂質や代謝産物などの内在性の脂溶性物質を輸送し，我々の健康をまもっている．

事実，ABC蛋白質の異常はさまざまな疾病と関係している^（6）．たとえば，ABCG2の異常は痛風リスクを大きく上昇させる．特に日本人にはABCG2の機能不全をひき起こす一塩基多型の比率が高く，痛風のリスクが世界の中でも高い民族である．痛風の予防は日本人にとって重要な問題である．ABCC7 （CFTR）の異常は，白人

図1^■ヒトABC蛋白質のサブグループと典型的な2次構造

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に最も多い遺伝病である嚢胞性繊維症をひき起こすが，

この病気は日本人にはほとんどない．ABC蛋白質は糖尿病とも関係する．

また，ABCA3は呼吸器の病気，ABCA12は皮膚の病気，ABCA7, ABCA13は神経変性疾患と関連する．

ABCA4は眼においてビタミンAの代謝回転に関係しており，その異常によってひき起こされる黄斑変性症は老人性の失明の原因となる．ABCC6の異常は筋繊維の石灰化をひき起こす．ABCA1の異常は動脈硬化と密接に関係している．

ABCA1と動脈硬化症

コレステロールは，細胞膜の成分やビタミン・ホルモンの前駆体として私たちの身体に必須な物質であり，肝臓で合成されるほか，食物として摂取している．食物中のコレステロールは小腸から吸収され，肝臓に運ばれた後，超低密度リポ蛋白質（VLDL），低密度リポ蛋白質

（LDL）として全身の細胞に運ばれる．しかし，コレステロールの過剰な蓄積は細胞にとって有害であり，末梢細胞で過剰になったコレステロールは善玉コレステロールとして知られる高密度リポ蛋白質（HDL）として肝臓へ戻される（図

2

_）．このHDL形成にABCA1は必須であり，ABCA1に異常があるとHDLが産生されない遺伝病タンジール病がひき起こされる．過剰になったコレステロールによってマクロファージの泡沫化が進み，血管壁に沈着してプラークが形成されると，動脈が閉塞，

血栓によって血流障害が生じ心不全，心筋梗塞，脳卒中などがひき起こされる．日本人の死因のうち脳と心臓の

血管系の疾患は合わせると約3割となり，癌に匹敵する値となる．

2011年に米国において疫学調査が行なわれ，冠動脈疾患のリスクファクターが調べられた．1番が糖尿病，

2番が高血圧，3番が喫煙と，予想通りであったが，いわゆる悪玉コレステロールLDL量はリスクではなかった．冠動脈疾患のリスクが減るファクターとしては，血中HDL量がリスクと逆相関することは予想通りであったが，それよりもマクロファージからのコレステロール排出活性が，冠動脈疾患のリスクと最も逆相関するファクターであった^（7）．すなわち，ABC蛋白質を介したコレステロール排出が動脈硬化の予防に非常に重要であるということが示唆された．

ABCA1によるHDL形成機構

HDLは，血漿中の両親媒性

α

へリックスに富むアポ A-I蛋白質に，ABCA1の働きによって末梢細胞のリン脂質とコレステロールが受け渡され形成される．しかし，そのメカニズムの詳細はいまだ不明である．筆者らは，ABCA1の機能をさまざまな方法で研究してきた．

たとえば，蛍光標識したアポA-Iを培地中に加えると，

ABCA1発現細胞の細胞表面に結合することが観察できる．代謝阻害剤によって細胞内ATPを欠乏させるとアポA-Iは結合しなくなる．このとき，培地中にグルコースを添加し細胞内のATP濃度を高めると，アポA-Iは再度細胞表面に結合する^（8）．つまり，アポA-I結合には細胞内ATPが必要であることがわかる．ABCA1の2つのATP結合ドメインそれぞれに変異を導入してATP加

図2^■体内のコレステロールの循環

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水分解活性を消失させた変異体はアポA-Iを結合できない．つまり，アポA-I結合にはABCA1による加水分解が必要である．

ABCA1は，約600アミノ酸と300アミノ酸からなる大きな細胞外ドメインをもつことが特徴である（図1）．全長が2,261アミノ酸なので，分子の約半分が細胞外ドメインである．アポA-I蛋白質がこの細胞外領域と直接結合することは，細胞非透過の架橋剤を用いたクロスリンク実験により示されている．また，ABCA1の2つの細胞外領域は2本のジスルフィド結合によって架橋されており，これらのジスルフィド結合が形成できない ABCA1は，アポA-Iと結合できない^（9）．さらに，

ABCA1の細胞外領域のリシン残基を一級アミン修飾試薬で修飾すると，アポA-Iとの結合活性が失われる^（10）．結晶構造解析から，アポA-Iの表面に負電荷のアミノ酸からなる領域が存在することが報告されている．HDL 形成の第1ステップはアポA-IのABCA1細胞外ドメインとの静電相互作用であると考えられる．

一方，細胞外ドメインにエピトープタグを挿入し，抗体との反応性を調べることによって，ABCA1の2つの ATP結合領域でのATP加水分解によって細胞外ドメインが大きく構造変化することが明らかになった^（8）．また，その抗体の反応性とアポA-I結合活性が相関することから，ATP加水分解に依存した構造変化によってアポA-I結合部位が細胞外領域に形成されると予想された．以上の知見から，筆者らは以下のようなモデルを考えている．①ABCA1がATP加水分解を繰り返すことによって，リン脂質とコレステロールを輸送する．②それによって細胞外ドメインが大きな構造変化を起こし，

アポA-I結合部位が細胞外ドメインの表面に現われる．

③アポA-IはABCA1の細胞外ドメインと相互作用することによって，脂質を結合できる構造に変化する．④アポA-IがABCA1から脂質を受け取り，新生HDLが形成される．

ABCA1の活性制御

遺伝子の転写は，核内リセプターである LXR （Liver X Receptor）

β

と RXR （Retinoid X Recep- tor）のヘテロダイマーによって制御されている．細胞内に過剰なコレステロールが蓄積すると，オキシステロールの細胞内濃度が上昇し，LXRにリガンドとして結合することによってABCA1やABCG1などの転写を活性化する．発現したこれらABC蛋白質によって過剰なコレステロールは細胞外へ排出される．しかし，コレステロールは細胞にとって必須の構成成分であり，コレステロールを排出しすぎることがないように，ABCA1 の活性は分解などのさまざまなメカニズムで制御されている．そこで，ABCA1の翻訳後制御に関わる相互作用蛋白質を見つけるため，ABCA1のC末端領域を用いて酵母ツーハイブリッドスクリーニングを行なった．その結果，まずC末端のPDZモチーフに結合する

α

1-シントロフィンが見つかり，その相互作用がABCA1の分解を抑制しHDL形成を促進することを明らかにした^（11）．そのスクリーニングでは，同時に，核内リセプターであり ABCA1の転写を制御するLXR

β

がABCA1と相互作用する可能性が示された．筆者らは驚き，慎重に実験を開始した．その結果，次のようなまったく予期しない LXR

β

の生理的役割が明らかになった（図

3

_）^{（12, 13）}_．

細胞内に過剰なコレステロールが存在しない状態で

図3^■核内受容体LXRβ/RXRヘテロダイマーによるABCA1の転写制御と翻訳後制御

（A）細胞内に過剰なコレステロールの蓄積がないとき，遺伝子は転写されない．またLXRβ/RXRヘテロダイマーがABCA1に結合し，不活性ABCA1が細胞膜に保持される．

（B）細胞内に過剰なコレステロールが蓄積したとき，オキシステロールがLXRβ に結合し遺伝子の転写が活性化される．同時に，オキシステロールが結合したLXRβ/RXR ヘテロダイマーが細胞膜上のABCA1 から遊離する．活性の回復した ABCA1がHDLを産生し，過剰なコレステロールを細胞から除去する．

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は，細胞膜上のABCA1のC末端部分の2つのロイシン残基を介して，LXR

β

/RXRヘテロダイマーがABCA1 と直接結合する．この結合によって，ABCA1は何らかの構造変化を起こしてATP結合活性を失い，ABCA1 の2つの活性，アポA-I結合とコレステロール排出の両方が阻害される．さらにABCA1の分解が抑制され，不活性な状態のABCA1が細胞膜上に保持される．コレステロールが過剰蓄積すると，細胞内で生成したオキシステロールがLXR

β

に結合し，LXR

β

/RXRヘテロダイマーはABCA1から解離する．すると，ABCA1の活性がただちに回復し，過剰なコレステロールは細胞外へ排出される．つまり，LXR

β

はこれまで考えられてきたように，核内に常に存在し，リガンドであるオキシステロールの核内濃度が上昇したときに働く転写因子としての役割だけでなく，リガンドが存在しないときには核外にも存在すること，さらに細胞膜上の蛋白質と直接相互作用することによって，翻訳後制御にも関わっていることが明らかになった^{（12, 13）}．これは，これまでの常識を覆す発見であった．

マクロファージにおいて過剰になったコレステロールは，ABCA1によって血中のアポA-Iに受け渡され，

HDLとして肝臓へ逆輸送される．この反応は動脈硬化の予防にとって重要である．しかし，ABCA1の蛋白質としての半減期は2時間以内と短く，過剰のコレステロールを蓄積していない状態ではABCA1は速やかに分解されてしまう．ABCA1は2,261アミノ酸の膜蛋白質であり，転写，翻訳され細胞膜上に現われるまでには数時間は要する．それ故，たとえばマクロファージがアポトーシス細胞を貪食し，細胞内コレステロール濃度が急上昇したとき，オキシコレステロールをリガンドとする LXR

β

によって遺伝子の転写が活性化され，

ABCA1が細胞膜上で働くまでには，最低数時間が必要である．そこで，細胞内に過剰なコレステロールが存在しないときに，不活性なABCA1を細胞膜上に安定に保つことは，このタイムラグを埋めるために重要となる．

コレステロールが過剰蓄積したとき，細胞はすぐに過剰なコレステロールを排出し始めることができる．この機構は，転写活性化機構が過剰コレステロールに対応する

までのラグタイムを埋めるための即時応答機構であると予想される．

おわりに

食物中の栄養素を吸収し全身に届けるため，重要な代謝物を必要な場所へ届けるため，また老廃物や有害物質を体外へ排出するため，私たちの体ではさまざまなトランスポーターが働いている．これらの輸送体は，私たちの身体を健康に保つために懸命に働いている．しかし，

むやみに複数の薬を服用したり，サプリメントなどとして一度に高濃度の物質を摂取すると，トランスポーターが充分に機能を発揮できない事態が発生することが懸念される．また，ABCA1が排出できる限度をこえてコレステロールを摂取することも控えたほうがよい．毎日の生活で，これら輸送体のことをもう少し気にかけていただければありがたい．

文献

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