재료 및 방법

Ⅶ. 도심권 4개 국립공원 멧돼지 배설물

2) 멧돼지 배설물내 DNA 추출 및 타겟 염기서열 증폭

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각 국립공원의 지역별(북한산, 경주, 계룡산, 무등산의 임연부와 임내) 멧돼지 배설물분석은 시료 채취, DNA추출, 차세대염기서열분석으로 진행되었다(그림 Ⅶ-2). Genomic DNA를 추출하기 위해 DNeasyPowerSoil Kit(Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하였다. 추출된 genomic DNA의 농도는 Quant-IT PicoGreen (Invitrogen, CA, USA)을 이용하여 측정하였고 최종 농 도 1.0 ng/ul 이상인 샘플만 실험에 사용하였다. 추출된 DNA에서 진균군집은 Fungal ITS 2 region을 타겟으로, 식물군집은 엽록소내 rbcL 유전자를 타겟으로 하는 primer set을 이용하여 PCR을 수행하였다. 추출된 total genomic DNA를 주형으로 ITS 염기서열을 증폭하기 위해 ITS3 (GCATCGATGAAGAACGCAGC), ITS4 (TCCGCTTATTGATATGC)와 rbcL 염기서열을 증폭하기 위해 rbcLaF (ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC), rbcLR506 (AGGGGACGACCATACTTGTTCA) primer set을 사용하여 1차 PCR을 진행하였고, PCR 산 물은 AMPure beads (Agencourt Bioscience, MA, USA)를 이용하여 정제되었다. 정제된 1 차 PCR 산물은 Nextra XT index kit을 사용한 2차 PCR을 통해 Barcode가 부착된 sequencing library를 제작하였으며, 정제된 2차 PCR 산물은 TapeStation DNA ScreenTape D1000 (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)을 이용하여 증폭산물의 길이와 농도를 측정하였다. 최종 PCR 산물은 MiSeq^TM platform (Illumina, CA, USA)을 이용 하여 염기서열을 분석하였고 제조사의 프로토콜에 따라 마크로젠 (Seoul, Korea)에서 수행되었 다.

3) 멧돼지 배설물내 차세대 염기서열 분석

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MiSeq raw data는 sequencing이 완료된 후, 인덱스(Index) 서열을 이용하여 시료별로 분류하고, 시료별 FASTQ 파일을 생성하였다. FASTP 프로그램을 이용하여 어댑터 서열을 제거하고, 두 Read가 겹치는 영역에 대해서 오류 교정 (error-correction)을 진행하였다 (Chen et al., 2018). 각 시료별로 구분된 paired-end data는 FLASH 1.2.11를 사용하여 하나의 서열로 조립하였다 (Magoc and Salzberg, 2011). 하나로 조립된 서열의 길이가 300bp미만, 500bp 초과인 서열들은 제거하였다. 얻어진 서열은 CD-HIT-EST기반의 OTU (Operational Taxonomic Unit)분석 프로그램인 CD-HIT-OTU를 이용하여 sequencing error로 간주되는 낮은 품질의 서열, Abbiguous서열, chimera서열 등을 제거한 후, 97% 이상의 서열 유사성을 갖는 서열끼리 군집화하여 종 수준의 OTU를 형성하였다 (Li et al., 2012). 각 OTU의 대표서열은 Reference DB (UNITE 7.2 2017-12-01 + INSD Fungi DB)에 UCLUST를 수행하여, 유사성이 가장 높은 subject의 organism 정보로 taxonomic assignment를 수행하였다.

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얻어진 OTU 정보로 QIIME (v1.9)을 이용하여, 두 수종의 부위별 진균 군집의 비교 분석을 수행하였다 (Caporaso et al., 2010). 시료내 진균 군집의 종 다양성 및 균등도를 확인하기

위해, Shannon Idex와 Inversed Simpson Index를 구하고, Rarefaction curve와 Chao1 richness값을 통해 alpha diversity 정보를 확인하였다. Weighted and unweighted UniFrac distance를 기반으로 시료간의 Beta diversity를 구해 그룹 내 샘플간의 다양성 정보를 principal coordinates analysis (PCoA)로 분석하고 UPGMA tree를 통해 시료간의 유연관계를 시각화하였다 (Caporaso et al., 2010). 두 수종간 다양성 비교는 student‘s t-test (P<0.05)를 통해 분석하였다.

[그림 Ⅶ-2] 멧돼지 배설물 수집 및 메타제노믹 분석 과정