야생동물의 유전물질 시료는 집단유전학, 보전생물학, 행동학 등 다양한 분야의 분자연구에서 중요 한 연구재료로 이용되고 있다. 야생동물을 포획할 필요 없이 잔존하는 배설물, 나무껍질에 붙어있는 털 등으로부터 유전물질 시료를 채집하는 비침습적 유전자 샘플링 방법은 야생동물에게 직접적인 위 해를 가하지 않을 뿐만 아니라, 야생동물의 서식지 교란도 최소화 할 수 있기 때문에 최근 들어 DNA에 기반 한 기술의 발달과 함께 선호되고 있는 야생동물 유전자 시료 채집 방법으로 자리 잡고 있다. 특히 진흙목욕 이후 비빔목에 몸을 부비는 습성을 지닌 멧돼지의 경우 배설물은 물론 비빔목 의 나무껍질 사이에 남아있는 털도 비침습적 유전물질 시료의 대상이다.
I. 멧돼지 배설물에서 유전자 시료 채취
※ 사진자료 삽입: 멧돼지 진흙 목욕장에 있는 멧돼지 무리 사진 멧돼지 배설물 사진
1. 멧돼지 배설물 시료의 현장 조사
- 선조사법을 통해 멧돼지 배설물을 수집한다. 선조사 동안 GPS 위치 추적 장치를 통해 조사자의 이동 경로를 확보하고, 배설물 발견 지점을 표지하여, 2차 현장조사에 활용한다.
- 배설물 잔존기간, 신선도 등은 계절별로 차이가 있으며, 특히 겨울철 배설물의 경우 배설 직 후 저온 환경하에 유지되기 때문에 멧돼지의 배설물에 묻어 있는 장내 세포 분해율이 낮아 유전물질을 채취할 확률이 높다.
- 배설물 시료를 확보한 이후 잔존 배설물은 흙에 파묻거나 수거하여 차후 조사에서 재활용되는 것을 방지한다.
- 조사 경로 상 식생 등 미소 환경 유형별로, 24시간 이내 배설한 것으로 추정되는 신선한 배설 물의 경우 분해율을 산정하기 위하여, 해당 배설물을 타임랩스 카메라로 촬영하여 분해 단계 를 촬영하거나 혹은 주기적인 재방문을 통해 분해가 완료되는 시기를 산정한다.
헤어트랩 설치도 비빔목에서 멧돼지 털 수거 - 배설물 발견 시기(계절), 배설물 분해속도 등을 고려해, 발견한 배설물이 배설된 날짜를 추정한
다.
2. 멧돼지 배설물 수집 시기
- 멧돼지의 개체군 변동 추정을 위해서는 번식 계절 이전 및 번식 계절 이후, 겨울 등으로 구분해 배설물을 수집하며, 각 기간별 최소 2차례 이상 방문하여 배설물을 수집한다.
3. 멧돼지 배설물 시료의 수집 및 보관
- 배설물의 표면에 장내 상피세포가 많이 묻어있기 때문에 표면 부분을 채취하며, 이때 공기 중에 노출된 최소 3지점 이상의 배설물 표면에서 시료를 수거한다
- 건조한 배설물의 경우 배설물 표면에 부착된 세포의 유실이 일어나지 않게 조심하면서, 스포이드 등을 이용해 멸균 증류수를 배설물 표면에 떨구어 배설물이 점액성을 갖게 되면 배설물 표면을 채취한다.
- 배설물 표면 시료는 50mL 팔콘튜브에 담아 냉동보관 한다.
II. 멧돼지 털에서 유전자 시료 채취
※ 비빔목 사진과 털 사진 확대, 헤어트랩 사진
헤어트랩 현장 설치 헤어트렙에 포획된 털 그림 12. 헤어트랩과 비빔목의 멧돼지 털(박영철 등 2014)
1. 멧돼지 털 시료의 현장 조사
- 1차 현장 조사에서 멧돼지 비빔목 분포조사를 수행하여, 비빔목에 있는 기존 멧돼지의 털을 제거한다. 비빔목 분포 조사 동안 GPS 위치 추적 장치를 통해 조사자의 이동 경로를 확보 하고, 비빔목 발견 지점의 좌표를 확보한다.
- 1차 현장 조사에서 확인한 멧돼지의 이동로 및 진흙목욕장 주변에 헤어트랩을 설치한다.
- 2차 현장조사에서는 1차 현장 조사에서 발견한 비빔목 혹은 설치해 둔 헤어트랩을 재방문하여 털 시료를 확보한다. 이때 비빔목이나 헤어트랩에 미수거 털이 남아있는지, 꼼꼼히 확인하여 차 후 조사에서 재활용되는 것을 방지한다.
2. 멧돼지 털 시료 수집 시기
- 멧돼지의 개체군 변동 추정을 위해서는 번식 계절 이전 및 번식 계절 이후, 겨울 등으로 구분해 털 시료를 수집한다.
- 각 기간별 최소 2차례 이상 방문한다. 재방문 기간은 털 시료의 수집 성공확률을 높이기 위해 멧돼지가 해당 비빔목이나 헤어트랩을 방문 할 기간 등을 고려해 최소 2주 이상 충분한 여 유를 둔다. 그러나 강우, 바람 및 미소 환경의 변화 등에 의한 모근 세포의 유실 가능성 등을 고려하여 재방문 시기를 결정한다.
3. 멧돼지 털 시료 수집의 및 보관
- 털 시료는 모근 세포가 유실되지 않게 조심하여 비빔목과 헤어트랩에서 수거 지점 부위별로 분 리해 50mL 팔콘튜브에 넣어 운반한 후, 현미경 하에서 모근 세포의 잔존 여부를 확인한다.
- 모근 세포가 부착되어있을 경우, 모근 세포가 부착된 털 뿌리 부분을 가위 등으로 절단하며, 절 단에 사용된 가위는 철저하게 소독하여, 털 시료 간 모근 세포의 교차 감염이 되지 않도록 주의 한다.
그림 3. 1.5ml 튜브속에 담긴 멧돼지 모근 절편(박영철 등 2014)
유전자 부위 Primers (5`
→3`)
미토콘드리아 Control region pigCTR22L : TTCGTATGCAAACCAAAACG pigCTR515H : GCTGATTAGTCATTAGTCC 표 1. 멧돼지 미토콘드리아 DNA의 control region의 PCR 증폭을 위한 탐침 정보
PCR 증폭 조건 (Fickel & Hohmann, 2006)
Temperature (℃) 94 94 52 72 72 4
Time (min) 3' 0.25' 0.5' 1.5' 7'
∞
Cycle x1 x35 x1 x1
표 2. PCR 증폭 조건
- 모근 세포가 부착된 털 뿌리 부분은 1.5mL 멸균 튜브 넣어 냉동 보관한다.
III. Genomic DNA 추출
- 모근 세포는 GenElute™ Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit Protocol (SIgma CO.)를 사용하여, 매뉴얼에 따라 추출한다.
- 배설물은 QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit(Qiagen)를 사용하여 매 뉴얼에 따라 추출한다. DNA추출을 위한 배설물의 시료는 180-220mg이 적 합하다.
- 만약 배설물의 양이 많을 경우, 사용하고자 하는 배설물 양이 충분히 녹을
정도의 멸균 증류수를 넣은 후 약 1-2분 간 vortexer를 이용해 완전히 섞는다. 10000g에 서 30초간 원심 분리하여 배설물 잔유물의 펠렛을 형성시킨 후, 상층액을 별도의 튜브에 수거한다. 항온건조기 혹은 60℃ heating block에서 튜브 뚜껑을 열어 상층액을 증발시키고, DNA 및 세포들은 남긴다. 건조된 튜브를 실내온도 수준으로 냉각시킨 후, 튜브에 Inhibit EX buffer 1.2mL을 첨가하여, vortexer을 통해 벽면과 바닥에 붙은 세포를 녹인다. 이중 1mL을 1.5mL 튜브에 옮긴 후 매뉴얼에 따라 다음 단계를 진행한다.
VI. Genomic DNA 추출 성공 여부 및 종 확인
- 멧돼지의 시료들로부터 Genomic DNA 추출 성공 여부 확인 및 추출한 Genomic DNA가 멧 돼지 종인지를 확인한다.
- 멧돼지의 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 중 control region 부위를 PCR 증폭한 후 전기영동을 실시하여 나타난 증폭된 유전자 밴드를 통해 멧돼지 DNA의 PCR 증폭결과를 확인한다.
(Fickel & Hohmann 2006; 박영철 등 2014)
(Fickel & Hohmann 2006; 박영철 등 2014)
그림 4. 멧돼지 털 시료로부터 추출한 Genomic DNA로부터 미토콘드리아 control region의 PCR 증폭 결과(박영철 등 2014)
- 위 탐침을 활용하여 확보할 수 있는 멧돼지 미토콘드리아 유전자인 control region의 경우 약 500bp의 길이이며, 씨퀀싱을 통해 확보한 염기서열들은 GenBank에서 blast search를 통해 멧돼지의 유전물질임을 확인한다.
- 개체식별, 친자 분석 등을 위해서는 유럽 야생멧돼지에서 개발된 마이크로세틀라이트 마커를 이용한다(Conyers
et al
. 2012; Costaet al
. 2012; Kierepkaet al
. 2016).V. 참고문헌
박영철, 임상진, 김지영, 윤광배, 김혜리, 전미경 등. 2014. 왕피천유역 생태경관보전지역 멧돼지 서 식현황 및 피해 저감방안 연구. 대구지방환경청 보고서.
Conyers CM, Allnutt TR, Hird HJ, Kaye J. 2012, Development of a microsatellite-based method for the differentiation of European wild boar (
Sus Scrofa scrofa
) from domestic pig breeds (Sus scrofa domestica
) in food. Journal of Agricultural and Food Chemistry 60(13):3341-3347.Costa V, Pérez-González J, Santos P, Fernández-Llario P, Carranza J, et al. 2012.
Microsatellite markers for identification and parentage analysis in the European wild boar (
Sus scrofa
). BMC Research Notes 5:479.Fickel J, Hohmann U. 2006. A methodological approach for non-invasive sampling for population size estimates in wild boars (
Sus scrofa
). European Journal of Wildlife Research 52: 28–33Kierepka EM, Unger SD, Keiter DA, Beasley JC, Rhodes OE Jr, Cunningham FL, Piaggio AJ. 2016. Identification of robust microsatellite markers for wild pig fecal DNA. The Journal of Wildlife Management 80(6):1120