BAKTERI PEMBENTUK BINTIL AKAR Rast i Saraswat
2.4.4 Analisis Kemampuan Pembentukan Bintil Akar Rhizobium dengan Penanda GUS
Alat dan bahan - Pipet mikro
- Strainbakteri, plasmid, dan media.
Strain Bradyrhizobium dan Escherichia coli S17-1 yang mengandung mTn5SSgusA20
Media untuk donor E. coli adalah medium LB yang disuplementasi dengan spektinomisin (100 µg ml-1). Untuk resipien adalah medium YM (Vincent, 1970) dan medium minimal umum yang mengandung spektinomisin (100 µg ml-1) untuk menumbuhkan transkonjugan.
Prosedur
1) Introduksi transposon ke dalam resipien rhizobia
- Kulturkan resipien strain Bradyrhizobium ke dalam media cair YM pada suhu 30oC selama 3 hari dan kulturkan bakteri donor E. coli
S17-1 yang mengandung mTn5SSgusA20 ke dalam media cair LB pada suhu 30oC selama semalam.
- Lakukan plate mating sesuai Wilson et al. (1994) pada media agar cawan YM pada suhu 30oC.
- Seleksi transkonjugan pada medium GM yang disuplementasi dengan spektinomisin (100 µg ml-1) untuk menyeleksi insersi transposon.
2) Kemampuan membentuk bintil akar.
- Sterilisasi permukaan benih siratro (Macroptilium artropurpureum) dan kedelai (Glycine max) cv. Enrei dengan etanol 70% selama 5 menit, lalu 3% H2O2 selama 1 menit, kemudian cuci dengan akuades steril dan biarkan berkecambah pada agar cawan 2%.
- Tanam kecambah dalam pot -pot tumbuh steril larutan hara bebas N (Akao & Kouchi, 1989), 1 tanaman per pot dan tiga ulangan. - Tumbuhkan inokulan strain Bradyrhizobium tetua dan mutan
sampai fase pertengahan eksponensial dalam media cair YM secara terpisah.
- Setelah tanam 1 hari, inokulasi tanaman dengan masing-masing strain sebanyak 1 ml. Pada siratro, strain tetua dan mutan dikombinasikan dengan perbandingan 1 : 1 dengan konsentrasi 2,1 x 108 ml-1.
- Tumbuhkan tanaman di rumah kaca dengan suhu dan periode cahaya 14/10 jam masing-masing pada siang/malam. Untuk tanaman kedelai liar, strain tipe liar dan mutan dikombinasikan seperti di atas.
3) Asai GUS
- Panen tanaman 3 minggu setelah inokulasi untuk menentukan okupansi strain tetua dan liar yang mempunyai penanda gusA. - Celupkan akar dalam tabung reaksi yang mengandung larutan asai
GUS (5 ml of 0,1 M bufer natrium fosfat pada pH 7,0; 50 µl X-gluc; and 20 µl 10% SDS), vakumkan selama semalam, lalu inkubasi pada suhu 30oC selama 1 jam.
- Catat area yang ditempati warna biru (strain yang ditandai gusA) terhadap total area yang ditempati bakteroid sebagai okupansi bintil akar. Diameter 1 mm bintil akar dihitung sebagai bintil-bintil akar. Gambar 1 berikut adalah contoh dari ekspresi gen GUS
A B C
Gambar 1. (A) mutan Bradyrhizobium japonicum RIFCB-2 yang memiliki aktivitas GUS (berwarna biru) dan tanpa aktivitas GUS (tidak berwarna); (B) akar Siratro dengan bintil akar yang dikolonisasi oleh strain inokulum yang dimarka dengan GUS; (C) lokasi histokimia GUS dalam jaringan bintil akar
DAFTAR PUSTAKA
Akao, S. & H. Kouchi. 1984. Light microscopic observation of root hair curling of soybean induced by Rhizobium infection. Jpn.J. Soil Sci. Plant Nutr 60: 53-55
Allen, O.N. & E.A. Allen. 1981. The Leguminosae. A source book of characteristic, uses and nodulation. The University of Wisconsin Press, Wisconsin.
Barbour, W.M., S.H. Wang, & G. Stacey. 1992. Molecular Genetics of
Bradyrhizobium Symbiosis. In Biological Nitrogen Fixation. G. Stacey, R.H. Borris, and H.J. Evans (Eds.). Chapman & Hall Inc., USA. Burkhard, B., D. Schillik, and A. Puhler. 1987. Physical characterization of
Rhizobium meliloti megaplasmids. Plasmid 17:13-25.
Chen, W.X., G.H. Yan, & J.L. Li. 1988. Numerical taxonomic study of fast- growing soybean rhizobia and a proposal that Rhizobium fredii be assigned to Sinorhizobium gen. nov. Int. J. Sys. Bacteriol. 38:392- 397.
De Lajudie , P., E. Laurent-Fulele, A. Willems, U. Torck R. Coopman, M.D. Collins, K. Kersters, B. Dreyfus, & M. Gilles. 1998. Allorhizobium undicola sp.nov, sp.nov. nitrogen-fixing bacteria that efficiently nodulate Neptunia natans in Senegal. Int. J. Sys. Bacteriol. 48: 1277- 1290.
Fuhrmann, J. 1990. Symbiotic effectiveness of indigenous soybean bradyrhizobia as related to serological, morphological, rhizobitoxine, and hydrogenase phenotypes. Appl. Environ. Microbiol. 56: 224-229. Jordan, D.C. 1982. Transfer of Rhizobium japonicum Buchanan 1980 to
Bradyrhizobium gen. nov., a genus of slow-growing, root nodule
bacteria from leguminous plants. Int. J. Sys. Bacteriol. 32:136-139. Jordan, D.C. 1984. Famili III. Rhizobiaceae Conn 1938, 321AL, p. 234-256.
In N.R. Krieg & J.E. Holt (Eds.) Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, vol. 1. The William and Wilkins Co., Baltimore.
Keyser, H.H., B.B. Bohlool, T.S. Hu, & D.F. Weber. 1982. Fast-growing rhizobia isolated from root nodules of soybeans. Science 215: 1631- 1632.
Kundig, C., H. Hennecke, & M. Gottfert. 1993. Correlated physical and genetic map of Bradyrhizobium japonicum 110 genome. J. bacteriol. 175: 613-622.
Kuykendall, L.D., B. Saxena, T.E. Devine, & S.E. Udell. 1992. Genetic diversity in Bradyrhizobium japonicum Jordan 1982 and a proposal for Bradyrhizobium elkanii sp. nov. Canadian J. Microbiol. 38: 501- 505.
Masterson, R.V., P.R. Russel, & A.G. Atherly. 1982. Nitrogen fixation (nif) genes and large plasmid of Rhizobium japonicum. J. Bacteriol. 152: 928-931.
McClelland, M., R. Jones, Y. Patel, & M. Nelson. 1987. Restriction nucluases for pulse-filed mapping of bacterial genomes. Nucleic Acids Res. 15: 5985-6005.
Scholla, M.H. & G. H. Elkan. 1984. Rhizobium fredii sp nov. a fast-growing spesies that effectively nodulates soybeans. Int. J. Sys. bacteriol. 34: 484-486.
Somasegaran, P. & H.J. Hoben. 1994. Handbook for Rhizobia. Springer- Verlag, New York.
Suwanto, A. & S. Kaplan. 1989. Physical and genetic mapping of
Rhodobacter spaeroides 2.4.2. genome: present of two unique
circular chromosomes. J. Bacteriol. 17: 5850-5859.
Vincent, J.M. 1970. A Manual for the Practical Study of Root Nodule Bacteria. IBP Handbook 15. Blackwell Scientific Publication. Oxford. Willems, A. & M.D. Collins. 1993. Phylogenetic analysis of rhizobia and
agrobacteria based on 16S ribosomal RNA gene sequences. Int. J. Sys. Bacteriol. 43: 305-313.
Wilson, K.J., A. Sessitsch, & A.D.L. Akkermans. 1994. Molecular marker as tools to study the ecology of microorganisms. p. 149-156. In K. Ritz, J. Dighton, & K.E. Giller (Eds.) Beyond the Biomass: Compositioned and Functional Analysis of Microbial Communities. Chickchester. John Willey. New York.
Xu, L.M., C. Ge, Z. Cui, J. Li, & H. Fan. 1995. Bradyrhizobium liaoningensis
sp. nov. isolated from the root nodules of soybean. Int. J. Sys. bacteriol. 45: 706-711.
Yanagi, M. & K. Yamasato. 1993. Phylogenetic analysis of the family
Rhizobiaceae and related bacteria by sequencing of 16S rRNA gene using PCR and DNA sequencer. FEMS Microbiology Lett. 107: 115- 120.
Young, J.P.W., H.L. Downer, & B.D. Eardly. 1991. Phylogeny of the phototrophic rhizobium strain BTAil by polymerase chain reaction- based sequencing of a 16S rRNA gene segment. J. Bacteriol. 173: 2271-2277.
Young, J.P.W. & K.E. Haukka. 1996. Diversity and phylogeny of rhizobia. New Phytol. 133: 87-94.
Zuberer, D.A. & W.S. Silver. 1998. Biological dinitrogen fixation (Acetylene reduction) associated with Florida mangrove. Appl. Environ. Microbiol. 35: 567-575.
2.6