AKTIVITAS DEHIDROGENASE
3.3.2 Metode Aktivitas Dehidrogenase Dengan Substrat INT (Von Mersi & Schinner, 1991)
Prinsip
Metode ini berdasarkan inkubasi tanah dengan substrat INT pada suhu 40°C selama 2 jam. INTF yang tereduksi diekstrak dengan dimetil- formamida dan etanol, lalu diukur secara fotometri pada 464 nm.
Alat
- Tabung reaksi bertutup ulir - Labu takar 100 ml dan 250 ml - Pipet 5 ml dan 10 ml
- Inkubator
- Mesin pengocok (shaker)
Bahan
- HCl encer (3 M)
Campur 100 ml HCl pekat (37%) dengan 300 ml akuades. - Bufer Tris (1 M, pH 7)
Timbang 30,28 g tris(hydroxymethyl)aminomethane dalam labu takar 250 ml, lalu larutkan dengan 200 ml akuades dan sesuaikan pH menjadi 7 dengan HCl. Selanjutnya, volume dijadikan 250 ml dengan menambah akuades.
- Larutan substrat
Campur 500 mg INT dengan 2 ml N,N-dimethylformamide dalam labu takar 100 ml, lalu kocok dengan kuat. Buat volumenya menjadi 100 ml dengan menambah akuades. Pelarutan dilakukan dalam ultrasonic bath. Siapkan reagen tersebut setiap akan analisis, dan simpan pada kondisi gelap sampai digunakan.
- Larutan ekstraksi
Campur 100 ml N,N-dimethylformamide dengan 100 ml etanol 96% (v/v).
- Larutan stok standar (100 µg INT ml-1)
Timbang 10 mg iodonitrotetrazolium formazan (INTF) dalam labu takar 100 ml, larutkan dengan 80 ml larutan ekstraksi, kemudian lengkapi volumenya dengan larutan ekstraksi.
Kurva kalibrasi
- Pipet 0 (blanko), 1, 2, dan 5 ml larutan stok standar INTF ke dalam 4 tabung reaksi, lalu tambahkan 13,5 ml larutan ekstraksi. Standar kalibrasi sesuai dengan 0, 100, 200, dan 500 µg INTF.
Prosedur
- Timbang masing-masing 1 g tanah lembap ke dalam 3 tabung reaksi, lalu tambahkan 1,5 ml bufer Tris dan 2 ml larutan substrat. Tutup tabung reaksi, kocok sebentar, lalu inkubasi selama 2 jam pada suhu 40°C pada kondisi gelap.
- Siapkan kontrol dengan tanah yang diautoklaf (20 menit; 121°C; 0,1 MPa) dan perlakukan seperti terhadap contoh tanah.
- Setelah inkubasi, tambahkan 10 ml larutan ekstraksi pada masing- masing tabung. Untuk ekstraksi INTF yang terbentuk simpan tabung selama 1 jam pada suhu ruang pada keadaan gelap, lalu kocok dengan kuat setiap 20 menit.
- Segera setelah penyaringan, ukur kandungan INTF contoh, kontrol dan standar kalibrasi secara fotometri pada 464 nm terhadap blanko reagen. Perhitungan
Aktivitas dehidrogenase diekspresikan sebagai µg INTF per gram berat kering dan waktu inkubasi.
Aktivitas dehidrogenase (INTF µg.g-1 bk 2h-1) = (S1 – S0)/ bk S1 = INTF contoh (µg)
S0 = INTF kontrol (µg ) Bk = berat kering 1 g tanah
3.3.3 Ulasan
Beberapa catatan berikut penting untuk diperhatikan dalam analisis dehydrogenase, yaitu:
- Umumnya garam tetrazolium TTC , TPF, dan INTF sensitif cahaya sehingga untuk seluruh prosedur harus dilakukan dalam ruangan dengan lampu difusi.
- Metode reduksi TTC yang telah diuraikan membutuhkan standarisasi ketat tentang kondisi reaksi untuk mendapatkan hasil yang dapat dibandingkan. Bahkan hubungan antara berat tanah dan diameter tabung reaksi adalah penting karena perbedaan aerasi.
- Aktivitas dehidrogenase dengan TTC pada tanah-tanah anaerobik tidak disarankan sebagai ukuran untuk aktivitas biologi tanah karena komponen abiotik seperti senyawa-Fe(II) atau sulfida dapat mereduksi TTC.
- Nilai pH contoh dan suhu inkubasi sebaiknya tidak lebih dari pH 9 dan suhu 60°C untuk menjamin reduksi TTC hanya aktivitas dehidrogenase. Persentase tertinggi reduksi secara kimia ditunjukkan pada pH 12 dan suhu inkubasi 40°C. Pada pH 13 tidak ada aktivitas reduksi TTC secara kimia.
- Pengukuran intensitas warna TPF pada contoh limbah yang mengandung Cu dapat menghasilkan kesalahan baca karena terbentuk komplek Cu formazan yang mengurangi warna merah.
- Ukuran perbandingan O2 yang dipakai dan CO2 yang dikeluarkan memperlihatkan bahwa hanya 2-3% hidrogen yang dihasilkan termasuk dalam reduksi TTC. Hal ini disebabkan sbb:
TTC menghambat turnover hidrogen oleh mikroba karena toksisitasnya.
Hidrogen total tidak ditransfer ke TTC. TTC dihambat secara kompetitif sebagai penerima hidrogen dan reduksi terjadi hanya setelah penerima hidrogen lain habis.
Suatu sel hanya mengambil TTC dalam jumlah terbatas, yang pada akhirnya membatasi reduksi TTC (TPF terakumulasi dalam sel dan dapat menyebabkan sel meledak).
Oksigen ikut campur dalam reduksi TTC sehingga determinasi aktivitas dehidrogenase dengan TTC sebagai aseptor elektron memiliki reprodusibilitas yang rendah.
- Karena hanya reduksi biotik INT yang terukur maka kemungkinan reduksi INT secara kimia (non-mikrobial) oleh kation seperti Fe2+, konsentrasi garam dan kekuatan ion yang tinggi harus dikoreksi dengan kontrol yaitu tanah yang diautoklaf. Sebagai alternatif koreksi, inkubasi tanah lembap dengan bufer, tambahkan substrat segera setelah inkubasi dan sebelum filtrasi. Aktivitas dehidrogenase yang ditentukan dengan cara ini termasuk reduksi INT secara biotik dan abiotik.
- Metode INT yang digambarkan di sini distandarisasi untuk tanah-tanah pertanian. Untuk menganalisis contoh tanah hutan dan padang rumput, direkomendasikan untuk melakukan uji pendahuluan untuk menentukan berat tanah yang cocok dan konsentrasi substrat yang optimum.
- Jika nilai absorbansi terlalu tinggi, larutan berwarna dapat diencerkan dengan larutan ekstraksi. Jika diperlukan, waktu inkubasi dapat dikurangi dari 2 jam menjadi 1 jam.
- Secara teknis kelemahan penggunaan larutan ekstraksi aseton adalah tidak dapat menggunakan kuvet sekali pakai (disposable) untuk pengukuran absorbansi karena bahan kuvet dapat larut dengan aseton.
Daftar Pustaka
Alef, K. 1995. Dehydrogenase activity. p 228-231. In K. Alef & P. Nannipieri (Eds.) Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry. Academic Press. London.
Camiña, F., C. Trasar-Cepeda, F. Gil-Sotres, & C. Leirós. 1998. Measurement of dehydrogenase activity in acid soils rich inorganic matter. Soil Biol Biochem 30:1005–1011.
Casida, L.E. Jr., D.A. Klein, & T. Santoro.1964. Soil dehydrogenase activity. Soil Science 98:371-376.
Friedel, J.K., K. Molter, & W.R. Fischer. 1994. Comparison and improvement of methods for determining soil dehydrogenase activity by using triphenyl tetrazolium chloride and iodonitrotetrazoilium chloride. Biol. Fertil. Soils 18:291-296.
Ghaly, A.E., R. Kok, & J.M. Ingrahm. 1989. Growth rate determination of heterogeneous microbial population in swinemanure. Appl. Biochem. Biotechnol. 22: 59-78.
Gottschalk, G. 1979. Bacterial Metabolism. Springer-Verlag. New York Heidelberg Berlin.
Ohlinger, R. 1995. Enzymes involved in intracellular metabolism. p. 235- 245. In Schinner F., R. Ohlinger, E. Kandeller, & R. Margesin (Eds.) Methods Soil Biology. Springer-Verlag Berlin Heidelberg.
Tabatabai, 1994. Soil enzymes. p 820-823. In R.W. Weaver, S. Angle, P. Bottomley, D. Bezdicek, S. Smith, A. Tabatabai, & A. Wollum (Eds.) Methods of Soil Analysis (Microbiological and Biochemical Properties). SSSA. Wisconsin, USA.
Von Mersi, W & F. Schinner. 1991. An improved and accurate method for determining the dehydrogenase activity of soils with iodonitro- tetrazolium chloride. Biol. Fertil. 11(3): 216-220.
3.4
NITRIFIKASI
Edi Husen
Nitrifikasi merupakan salah satu aktivitas biologi tanah yang penting dalam siklus nitrogen dan dikenal sebagai tahap kedua yang sangat menentukan dalam proses mineralisasi nitrogen dari bahan organik. Secara definisi nitrifikasi adalah peristiwa oksidasi amonia menjadi nitrit dan nitrat atau disebut juga produksi nitrat oleh mikroba melalui oksidasi senyawa nitrogen tereduksi. Keberadaan populasi bakteri nitrifikasi di dalam tanah sering dipakai sebagai indikator penting dalam menilai kualitas atau kesehatan tanah karena jumlah jenisnya yang terbatas (Roper & Ophel- Keller, 1997).
Proses oksidasi amonium menjadi nitrat berlangsung dalam dua tahap dimana nitrogen (pada amonium) berperan sebagai sumber energi bagi bakteri nitrifikasi. Tahap pertama adalah oksidasi amonia oleh bakteri autotrofik. Pada tahap ini terjadi konversi amonium (amonia pada tingkat enzim) menjadi nitrit oleh bakteri pengoksidasi amonia dari genus “Nitroso” (contoh: Nitrosococcus). Pada tahap kedua, nitrit dioksidasi menjadi nitrat oleh bakteri pengoksidasi nitrit dari genus “Nitro” (contoh: Nitrococcus). Bakteri pengoksidasi amonia yang paling sering dipelajari karena terkait dengan aktivitas enzim dan biokimia oksidasi amonia adalah Nitrosomonas. Namun secara umum bakteri pengoksidasi amonia yang paling banyak dijumpai di dalam tanah adalah Nitrosolobus dan pada tanah-tanah masam adalah Nitrosospira (Myrold, 1997).
Reaksi keseluruhan konversi amonia menjadi nitrit adalah: NH3 + 1 1 /2O2Æ NO2 - + H+ + H2O -271 kJ (65 kcal) mol -1 NH3 Reaksi keseluruhan nitrit menjadi nitrat adalah:
NO2 -
+ 1/2O2Æ NO3 -
-77 kJ (18 kcal) mol-1 Nitrit Konversi amonia menjadi nitrit merupakan tahap penentu dalam keseluruhan proses nitrifikasi, sehingga pengukuran laju nitrifikasi suatu tanah diestimasi dari nitrit yang dihasilkan. Ada dua metode pengukuran nitrifikasi berdasarkan lamanya masa inkubasi, yaitu: (i) masa inkubasi singkat (short-term incubation) yakni dalam hitungan jam atau hari, dan (ii) masa inkubasi panjang (long-term incubation). Pengukuran nitrifikasi dengan masa inkubasi panjang memiliki kelemahan karena terjadi perubahan komposisi mikroflora selama masa inkubasi sehingga metode ini tidak disarankan (Alef, 1995).
Pengukuran nitrifikasi dengan masa inkubasi singkat menyediakan dua sisi informasi tentang aktivitas dan populasi bakteri nitrifikasi. Pada satu sisi, laju oksidasi amonia mencerminkan potensi secara keseluruhan laju nitrifikasi tanah dengan tingkat pengelolaan tertentu dimana ketersediaan NH4+ menjadi faktor pembatas laju keseluruhan proses nitrifikasi. Pada sisi lain, aktivitas nitrifikasi merupakan suatu fungsi dari ukuran populasi bakteri nitrifikasi yang dapat menjadi cerminan tentang seberapa besar aktivitas nitrifikasi terkait dengan satu sel bakteri (Schmidt & Belser, 1994).
Dalam tulisan ini diuraikan metode pengukuran nitrifikasi masa inkubasi singkat. Metode dan prosedur analisis yang diuraikan dipilih dan diekstrak dari metode yang dikembangkan oleh Berg & Rosswall (1985) dan Schmidt & Belser (1994).
3.4.1 Pengukuran Nitrifikasi Masa Inkubasi Singkat