CENDAWAN MIKORIZA ARBUSKULER R D M Simanungkal it
2.7.3 Kuantifikasi Kolonisasi Cendawan Mikoriza Arbuskuler (MA) dalam Akar Tanaman (% Kolonisasi Mikoriza)
Prinsip
Simbiosis antara cendawan MA dan tanaman inang ditandai dengan terjadinya kolonisasi cendawan itu dalam akar tanaman inang. Kolonisasi ini baru terlihat dengan jelas kalau contoh akar itu dijernihkan dan diwarnai dengan zat warna tertentu dan dilihat di bawah mikroskop cahaya. Penjernihan dilakukan untuk melarutkan bagian-bagian sel sehingga yang terlihat hanya struktur-struktur cendawan MA (vesikel, hifa dan arbuskel) dalam akar. Struktur-struktur ini
menyerap zat warna yang dipakai. Akar yang dikolonisasi cendawan MA terutama adalah bagian kortek akar rambut muda yang merupakan bagian yang paling aktif untuk penyerapan hara. Mikoriza jarang ditemukan pada akar tua yang tidak sukulen. Karena itu perlu pemilihan akar yang tepat untuk mengkuantifikasi kolonisasi ini.
Alat
- Alat-alat gelas yang diperlukan untuk pembuatan larutan - Cawan Petri yang berkotak-kotak (gridline)
- Penangas air
- Mikroskop stereo dan mikroskop binokuler Bahan/larutan
- Larutan 10% KOH (untuk penjernihan akar)
Larutkan 10 g KOH dalam 90 ml air (sesuaikan dengan kebutuhan)
- Larutan HCl (memasamkan akar agar memudahkan penyerapan zat warna)
Campur 1 ml HCl pekat dengan 99 ml air (HCl 1%) atau campur HCl teknis dengan air dengan perbandingan 1:4
- Asam laktat
- Larutan pewarna (gunakan salah satu):
Larutan pewarna acid fuchsin (Kormanik & McGraw, 1982)
Campur 875 ml asam laktat (grade laboratorium) dengan 63 ml gliserin dan 63 ml air kran untuk membuat larutan asam laktat. Kemudian larutkan 0,1 g acid fuchsin dalam lautan asam laktat tersebut.
Larutan pewarna tryphan blue (cotton blue) (Koch & Moawad, 1975) Buat larutan laktofenol dengan mencampur 40 ml air, 65 ml
gliserin, 33 ml asam laktat dan 80 g fenol (hati-hati menggunakan fenol karena beracun). Larutkan tryphan blue di dalam laktofenol untuk membuat larutan trypan blue 0,2% Larutan pewarna aniline blue (Koske & Gemma, 1989)
Larutkan 0,25 g aniline blue dalam campuran 25 ml air dan 475 ml asam laktat
- Larutan pencuci warna (disesuaikan dengan larutan pewarna yang digunakan):
Larutan pencuci warna (destaining solution) acid fuchsin
Campur 875 ml asam laktat (grade laboratorium) dengan 63 ml gliserin dan 63 ml air kran.
Larutan pencuci trypan blue.
Larutkan 80 g fenol dalam campuran 40 ml air, 65 ml gliserin, 33 ml asam laktat.
Campur 25 ml air dan 475 asam laktat.
- Larutan FAA (formalin-aseto-alkohol bila contoh akar perlu diawetkan karena baru diproses untuk waktu yang lama)
Campur formalin, asam asetat, dan alkohol 50% dengan perbandingan 90:5:5.
- Larutan H2O2 basa (bila diperlukan untuk akar yang mengandung pigmen, seperti akar ubi kayu misalnya).
Tambahkan 3 ml NH4OH (amonia rumah tangga dapat dipakai) kepada 30 ml H2O2 10% dan 567 ml air keran
Catatan: Hati-hati membuat dan menggunakan zat warna trypan blue, acid fuchsin, dan aniline blue, karena ketiganya berbahaya bagi kesehatan. Gunakan masker ketika bekerja dengan ketiga zat warna tersebut.
Pemrosesan akar
- Ambil contoh akar yang masih muda dari lima titik pada sistem akar. Cuci bersih, lalu potong-potong menjadi segmen-segmen sepanjang 1 cm.
- Timbang seberat 2 g dari tiap ulangan dan tempatkan dalam tabung reaksi
Penjernihan dan pewarnaan dengan pemanasan
- Tambahkan larutan KOH 10% ke dalam tiap tabung reaksi sebanyak tigaperempat tinggi tabung reaksi, sehingga larutan dan segmen akar tidak sampai melimpah keluar waktu dipanaskan. Tempatkan tabung- tabung itu dalam rak besi
- Tempatkan rak itu dalam penangas air. Panaskan selama 30-60 menit pada suhu 700C, tergantung pada kondisi materi akar yang dipanaskan (Suhu dapat ditinggikan/direndahkan, demikian pula waktunya dapat lebih pendek atau lebih lama. Contoh akar tanaman padi misalnya sangat lunak dan dapat hancur bila dipanaskan lebih lama dari 30 menit pada suhu 700C). Larutan KOH berfungsi untuk melarutkan sitoplasma dan inti sel tanaman, sehingga zat warna dapat menembus dengan mudah. - Tuangkan larutan KOH dari tiap tabung reaksi dan bilas dengan air kran
3-5 kali sampai warna air pencucian tidak berwarna coklat lagi.
- Tuangkan larutan H2O2 basa ke tiap tabung reaksi bila contoh akar mengandung pigmen tertentu, dan biarkan selama 10-20 menit sehingga pemutihan akar berlangsung dengan baik.
- Tuangkan larutan H2O2 dan bilas dengan air keran 3-4 kali untuk menghilangkan larutan H2O2.
- Tambahkan larutan HCl 1% ke tiap tabung reaksi dan biarkan selama 3- 4 menit.Kemudian tuangkan larutan HCl itu. Jangan dibilas, karena
pengasaman itu bertujuan untuk memperoleh pewarnaan yang baik nantinya.
- Berikan larutan salah satu zat warna yang tersebut di atas ke tiap tabung reaksi secukupnya sehingga semua segmen akar terendam dalam larutan.
- Tempatkan kembali rak besi itu dalam penangas air pada suhu 700C selama 10-60 menit sampai diperoleh pewarnaan yang baik (tergantung jenis tanaman dan ukuran akar).
- Tuangkan sisa larutan pewarna ke dalam wadah gelas tertentu untuk dikumpulkan.
- Sesuai dengan pewarnaan yang dipakai, berikan larutan pencuci warna yang sesuai ke tiap tabung reaksi, lalu kocok sehingga zat warna yang terserap akar terlarut ke dalam larutan pencuci warna, kecuali yang ada pada struktur-struktur mikoriza.
Catatan: Asam laktat dari larutan hasil pencucian ini dapat didaur ulang dengan menghilangkan zat warna yang tercampur di dalamnya. Caranya 10 g karbon aktif diberikan ke dalam 1 L bekas larutan pencuci warna tadi dan dibiarkan semalam. Kemudian disaring dengan kertas filter Whatman No. 1 atau 2 untuk menghilangkan materi yang kasar dan partikel carbón yang besar, sesudah itu disaring lagi dengan kertas saring Whatman No. 42 untuk menghilangkan partikel karbon yang halus. Selanjutnya larutan pencuci warna ini dapat dipakai kembali).
Penjernihan dan pewarnaan tanpa pemanasan
Metode ini makan waktu lebih lama daripada pewarnaan dengan pemanasan. Anilin biru disarankan untuk dipakai karena sampai sekarang zat warna ini terbukti tidak berbahaya dibandingkan dengan acid fuchsin, tryphan blue, atau chloral black E.
Proses pewarnaannya adalah sebagai berikut:
- Jernihkan contoh akar dalam larutan 20% KOH selama 1-3 hari.
- (Perlu dilakukan uji coba untuk mendapatkan waktu penjernihan yang optimal).
- Tuangkan larutan KOH, dan bilas akar dengan air keran sehingga bersih. Kemudian asamkan akar dengan memberi larutan HCl 0,1 M. - Tuangkan larutan HCl, lalu berikan larutan pewarna aniline blue (cara
pembuatannya lihat pada bahan/larutan di atas) dan biarkan selama 1-3 hari.
- Tuangkan sisa larutan pewarna ke dalam wadah gelas tertentu untuk dikumpulkan.
- Berikan larutan pencuci warna ke tiap tabung reaksi, lalu biarkan bermalam untuk memberi kesempatan zat warna yang terserap akar terlarut ke dalam larutan pencuci warna, kecuali yang ada pada struktur-struktur mikoriza.
- Tuangkan larutan pewarna yang tercuci dari contoh akar ke dalam suatu wadah tertentu (asam laktat dari larutan pewarna ini dapat juga didaurulang dengan cara yang tersebut pada pewarnaan dengan pemanasan di atas)
Mikroskopi dan penetapan % kolonisasi
- Tebarkan segmen-segmen akar dari tiap tabung reaksi secara acak pada cawan Petri berkotak-kotak (gridline).
- Amati di bawah mikroskop stereo segmen-segmen akar bermikoriza yang berpotongan dengan garis vertikal dan horizontal (gridline) pada cawan Petri (lihat Gambar 1)
- Nyatakan % kolonisasi akar dengan MGV + MGH
X 100%
Jumlah akar yang diamati
MGV = Mikoriza yang memotong garis vertikal MGH = Mikoriza yang memotong garis horizontal
Gambar 1. Segmen-segmen akar yang akan diamati dalam cawan Petri bergaris vertikal dan horizontal (Brundrett et al., 1996)