Edi Husen
Siderofor (siderophore) adalah senyawa pengompleks Fe3+ atau pengkhelat besi spesifik yang dihasilkan oleh beberapa jenis mikroba untuk menyembunyikan unsur besi di lingkungan rizosfir, sehingga tidak tersedia bagi perkembangan mikroba patogen. Kondisi ini umumnya terjadi pada tanah-tanah bereaksi netral sampai basis dimana kelarutan unsur Fe3+ rendah. Namun dalam beberapa kasus, pengkhelatan Fe3+ dari mineral Fe- P pada tanah-tanah masam pernah pula dilaporkan (Reid et al., 1985; Mullen, 1998). Kemampuan mikroba menghasilkan siderofor berimplikasi pada pengendalian mikroba patogen.
Beberapa jenis rizobakteri telah diidentifikasi mampu menghasilkan siderofor seperti Pseudomonas fluorescens B10 yang memproduksi yellow- green florescent siderophores atau pseudobactin yang kemudian terbukti dapat menghambat perkembangan fungi patogen Erwinia caratovora
penyebab busuk pada kentang (Subba-Rao, 1999). Beberapa laporan lain memaparkan kemampuan bakteri siderofor mengendalikan penyakit layu rebah yang disebabkan oleh cendawan Pythium ultimum dan busuk akar oleh cendawan Fusarium oxysporum (Kloepper, 1993). Hasil penelitian Bakker (2006) pada bakteri penghasil siderofor Pseudomonas putida
WCS358 juga membuktikan bahwa bakteri ini menginduksi kekebalan sistemik tanaman Arabidopsis thaliana karena mampu menekan penyakit yang menyerang daun walaupun bakteri ini terdapat pada zona perakaran.
Pengujian kemampuan bakteri menghasilkan siderofor dikembang- kan dari media miskin unsur Fe. Pencucian peralatan gelas dengan HCl untuk menghilangkan sisa-sisa Fe yang mungkin masih melekat pada gelas dan penggunaan air deionisasi atau akuades menjadi persyaratan penting dalam pengujian. Fuhrmann (1994) mengembangkan teknik microbial lawn
pada media agar King’s B yang defisien Fe untuk menguji reaksi antagonis bakteri penghasil siderofor potensial. Namun saat ini, media agar chrome azurol S (CAS) yang dikembangkan Schwyn & Neilands (1987) lebih populer dipakai karena kemudahan mendeteksi koloni bakteri penghasil siderofor yang berwarna kuning (oranye) yang sangat kontras dengan warna biru media kompleks CAS agar.
Dalam bab ini diuraikan metode pengujian bakteri penghasil siderofor menggunakan media agar kompleks Fe-CAS dari Schwyn & Neilands (1987) yang dimodifikasi oleh Alexander & Zuberer (1991).
2.8.1 Prinsip
Siderofor memiliki afinitas yang tinggi terhadap unsur Fe (Kf >1030). Bakteri penghasil siderofor mengikat unsur Fe di luar dinding sel dan selanjutnya Fe diangkut ke dalam membran sel melalui reseptor spesifik (Neiland, 1982). Media kompleks Fe-CAS menyediakan berbagai nutrisi bagi bakteri kecuali unsur Fe yang jumlahnya sangat terbatas dan terperangkap dalam media. Hanya bakteri penghasil siderofor yang mampu hidup dan berkembang biak pada media agar Fe-CAS karena siderofor dapat melepaskan dari media dan menyembunyikannya yang ditandai oleh koloni bakteri berwarna kuning (oranye) yang sangat kontras dengan warna biru media agar Fe-CAS agar.
2.8.2 Metode Pengujian
Bahan
- Suspensi sel bakteri (potential siderophore producing bacteria) yang akan diuji (dari tanah atau biakan murni)
- Cawan Petri - Labu Erlenmeyer - Beker gelas - Pipet mikro
Semua peralatan gelas direndam dan dicuci dengan larutan 3M HCl atau yang lebih pekat untuk menghilangkan sisa-sisa unsur Fe yang mungkin masih melekat pada peralatan gelas, kemudian dibilas dengan akuades.
Bahan kimia dan larutan (media)
- Media Fe Chrome Azurol S (CAS = C23H13Cl2O9SNa3) adalah campuran dari empat macam larutan (larutan I, II, III, dan IV) yang dibuat dan disterilisasi secara terpisah.
- Larutan I (larutan indikator Fe-CAS) Æ 100 ml
Campurkan 10 ml larutan 1 mM FeCl3.6H20 (dalam 10 mM HCl) dengan 50 ml larutan CAS (1,21 mg ml-1). Campuran ini menghasilkan warna ungu gelap. Sambil diaduk, secara perlahan campuran ini ditambahkan ke dalam 40 ml HDTMA
(hexadecy-ltrimetylammonium bromide) (1,82 mg ml-1).
Campuran ketiga larutan ini menghasilkan warna biru gelap. Autoklaf larutan selama 15 menit, kemudian dinginkan sampai
suhu 50oC.
Larutkan 30,24 g PIPES (peperazine-N,N'-bis[2-ethanesulfonic acid]) dengan 750 ml larutan garam yang mengandung 0,3 g KH2PO4, 0,5 g NaCl, dan 1 g NH4Cl. Atur pH 6,8 dengan KOH 50%, kemudian tambahkan 15 g agar. Cukupkan volume larutan sampai 800 ml dengan akuades.
Autoklaf larutan selama 15 menit, kemudian dinginkan sampai suhu 50oC.
- Larutan III (larutan glukosa dan unsur mikro) Æ 70 ml
Larutkan 2 g glukosa, 2 g manitol, dan unsur mikro (493 mg MgSO4.7H2O; 11 mg CaCl2; 1,17 mg MnSO4.H2O; 1,4 mg H3BO3; 0,04 mg CuSO4.5H2O; 1,2 mg ZnSO4.7H2O; dan 1 mg Na2MoO4.2H2O) dalam 70 ml akuades.
Autoklaf larutan selama 15 menit, kemudian dinginkan sampai suhu 50oC.
- Larutan IV (larutan asam cassamino 10%) Æ 30 ml
Larutkan 3 g asam cassamino dalam 30 ml akuades (10%, berat volume), kemudian disterilisasi dengan saringan mikro (0,2 mµ). Prosedur
7) Pembuatan media Fe-CAS agar
- Pada suhu larutan sekitar 50oC, tambahkan larutan III dan IV ke dalam Larutan II (larutan bufer + agar). Larutan I (larutan indikator) ditambahkan terakhir dengan mengaduk secara perlahan sampai keempat larutan tercampur rata (hindari terbentuknya gelembung). Campuran ini menghasilkan media kompleks Fe-CAS yang berwarna biru sampai biru kehijauan.
- Tuang larutan kompleks Fe-CAS ke dalam cawan Petri (masing- masing 20 ml), kemudian diamkan sampai agar membeku.
8) Inokulasi dan inkubasi
- Inokulasi Fe-CAS agar dengan suspensi sel bakteri dengan metode gores atau sebar. Untuk metode sebar, gunakan sebanyak 50 µL suspensi sel bakteri dari beberapa tingkat pengenceran. Selanjutnya inkubasi cawan Petri pada suhu kamar.
- Setelah masa inkubasi (24 jam atau lebih), bakteri penghasil siderofor yang tumbuh ditandai oleh koloni berwarna kuning (oranye) yang kontras dengan warna biru media Fe-CAS agar seperti tampak pada Gambar 1.
Gambar 1. Koloni bakteri yang berwarna kuning (oranye) mengindikasikan kemampuan bakteri mensekresikan siderofor untuk melepaskan dan mengikat Fe dari kompleks Fe-CAS agar (Husen, 2002)
2.8.3 Ulasan
Beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam analisis adalah: (i) semua reagen atau bahan kimia yang digunakan untuk membuat larutan indikator (larutan I) harus dibuat baru (fresh) untuk tiap batch agar dan (ii) penggunaan air akuabides (2 kali distilasi) untuk penyiapan media sering digunakan untuk menjamin keberhasilan analisis.
Media agar Fe-CAS dapat digunakan untuk keperluan isolasi bakteri siderofor dari sampel tanah, rizosfir, maupun dari akar tanaman.
Alexander, D.B. & D.A. Zuberer, 1991. Use of chrome azurol S reagents to evaluate siderophore production by rhizosphere bacteria. Biol. Fertil. Soils 2: 39-45.
Bakker, P.A.H.M., I. van der Sluis, B. Verhagen, M. de Jong, & L.C. van Loon. 2006. Determination of Pseudomonas putida WCS358 that are involved in induced sistemic resistance in Arabidopsis thaliana. Auburn University Web Site, Available: http://www.ag.auburn.edu/ argentina/pdfmanuscripts/ kloepper.pdf. [Accessed 30 June 2006]. Fuhrmann, J.J. 1994. Isolation of Microorganisms Producing Antibiotics. p.
379-405. In R.W. Weaver, S. Angle, P. Bottomley, D. Bezdicek, S. Smith, A. Tabatabai, and A. Wollum (Eds.) Methods of Soil Analysis (Microbiological and Biochemical Properties). SSSA. Wisconsin, USA.
Husen, E. 2002. Growth Enhancement of Hot Pepper (Capsicum annuum
L.) by Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR). Master Thesis (Soil Science). University of The Philippines at Los Banos. Philippines.
Kloepper, J.W. 1993. Plant growth promoting rhizobacteria as biological control agents. p. 255-274. In F.B. Meeting, Jr. (Ed.) Soil Microbial Ecology, Applications in Agricultural and Environmental Management. Marcel Dekker, Inc. New York.
Mullen, M.D. 1998. Transformation of other elements. p 369-386. In D.M. Silvia, J.J. Fuhrmann, P.G. Hartel, D.A Zuberer (Eds.) Principles and Application of Soil Microbiology. Prentice Hall. New Jersey.
Neilands, J.B. 1982. Microbial envelope proteins related to iron. Annu Rev. Microbiol 36: 285-309
Reid, R. K., C.P.P. Reid, & P.J. Szaniszlo. 1985. Effect of synthetic and microbially produced chelates on the diffusion of iron and phosphorus to a simulated root in soil. Biol. Fertil. Soils 1:45-52.
Schwyn, B & J.B. Neilands. 1987. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Anal. Biochem 160: 47- 56
Subba-Rao, N.S. 1999. Soil Microbiology (4th Edition of Soil Microorganisms and Plant Growth). Science Publishers, Inc. USA.
2.9