Rast i Saraswat i & Erny Yuniart i
Penggunaan pestisida, pupuk fosfat dalam kegiatan pertanian serta pembuangan limbah industri, emisi asap kendaraan bermotor dan bahan bakar minyak bumi menyebabkan kontaminasi logam berat pada tanah dan perairan. Beberapa logam berat esensial sebagai unsur mikro, namun pada konsentrasi tinggi toksik bagi organisme dengan membentuk senyawa kompleks dalam sel.
Mikroba pada habitat situs terkontaminasi logam berat mengembang- kan beberapa mekanisme toleransi terhadap logam berat, yaitu dengan cara efflux, kompleksasi atau reduksi logam berat atau menggunakan logam berat sebagai penerima terakhir elekron pada respirasi anaerob. Mekanisme toleransi terhadap logam seperti tembaga, seng, arsenik, kromium, kadmium, and nikel telah diidentifikasi dan digambarkan dengan detail. Sebagian besar mekanisme toleransi mikroba terhadap logam adalah dengan cara efflux metal ke luar sel (Spain, 2003).
Mekanisme toleransi mikroba terhadap logam berat dengan cara kompleksasi meliputi produksi polisakarida ekstraselular yang memiliki sifat- sifat anion yang berfungsi sebagai bioakumulator yang efisien, produksi metabolit organik yang memiliki sifat pengkelat dan membentuk kompleks dengan logam (Aspergillus niger, Penicilium spinulosum dan Verticillium psalliotae), presipitasi, serta kristalisasi ekstraselular oleh bakteri pereduksi sulfat sehingga membentuk deposit sulfida yang kaya akan logam, dan pembentukan metalotheonin (protein kaya sistein dalam sel dapat mengikat logam) yang berfungsi untuk detoksifikasi, penyimpanan, dan regulasi ion logam dalam sel (Gadd, 1990).
Mikroba yang toleran logam berat dengan mekanisme selain efflux
disebut sebagai mikroba pengakumulasi logam berat. Bakteri ini dapat dimanfaatkan untuk mengatasi pencemaran lingkungan yang disebabkan oleh logam berat. Bakteri, kapang, ganggang, dan ragi mampu mengakumulasi logam berat Ag, Au, Cd, Co, Cu, Fe, Ni, U, Zn (Gadd & White, 1993; Dave, 1994). Pseudomonas, Thiobacillus,Bacillus, dan bakteri penambat N2 dilaporkan mampu mengakumulasi logam berat (Mullen, 1989). Di dalam tanah, sel-sel mikroba baik mati maupun hidup dan produknya dapat merupakan bioakumulator logam berat yang sangat efisien.
Dalam subbab ini diuraikan teknik isolasi dan uji kemampuan mikroba pengakumulasi logam berat.
2.11.1 Prinsip
Isolat-isolat bakteri mikroba pengakumulasi logam berat (MPLB) diisolasi dari situs-situs terkontaminasi logam berat dengan metode Pumple
et al. (1995). Suspensi contoh diinokulasikan pada media PEG (pepton
glukosa – ekstrak ragi) dan setelah waktu inkubasi tertentu pada suhu ruang dilapisi dengan medium nutrient agar (NA) yang mengandung logam tertentu dengan berbagai konsentrasi. Koloni yang tumbuh diberi gas H2S dalam desikator. Koloni mikroba pengakumulasi logam berat adalah koloni yang berwarna hitam. Warna hitam disebabkan terbentuknya senyawa logam sulfur yang berwarna hitam. Kemampuan MPLB mengakumulasi logam diujikan kembali pada media cair PEG yang mengandung logam tertentu dengan konsentrasi terukur. Pengurangan logam dalam supernatan dianalisis dengan AAS (atomic absorption spectrophotometer) pada panjang gelombang 248,5 nm.
2.11.2 Isolasi dan Seleksi Mikroba Pengakumulasi Logam Berat (Pumpel et al., 1995)
Alat
- Botol gelap bertutup
- Wadah larutan stok logam berat - Cawan Petri - Neraca analitik - Autoklaf - Microwave - Labu Erlenmeyer 250 ml - Pipet mikro - Tips - Eppendorf - AAS - Desikator Bahan - Filter mikro 0,22 µm - H2S
Larutkan 4 g pepton, 2 g glukosa, 1 g ekstrak ragi, dan 15 g bakto agar dalam 1.000 ml akuades. Sterilisasi media dengan autoklaf pada suhu 121°C, 0,1 MPa, selama 15 menit.
- Media nutrient agar (NA) - Larutan stok AgNO3 1.000 ppm - Larutan stok Pb(NO3)2 1.000 ppm - Larutan stok Cd(NO3) 1.000 ppm - Larutan stok Cu(NO3) 1.000 ppm - Larutan stok MnSO4.7H2O 1.000 ppm - Larutan stok FeSO4.7H2O 1.000 ppm - Larutan stok ZnSO4.7H2O 1.000 ppm - Larutan stok Co(NO3) 1.000 ppm
Sterilisasi larutan logam dengan cara filtrasi menggunakan filter mikro 0,22 µm.
Prosedur 11) Isolasi
- Encerkan 10 g contoh tanah dengan larutan glukosa 0,1% lalu inkubasi pada inkubator goyang selama ± 2 jam, kemudian lakukan seri pengenceran hingga 1.000 kali.
- Inokulasi masing-masing hasil pengenceran sebanyak 100 µl ke dalam medium agar cawan pepton glukosa – ekstrak ragi (PGE) dengan metode cawan sebar lalu inkubasi pada pada suhu 300C, RH 60 % diruang gelap selama 2-3 hari.
- Remajakan koloni yang tumbuh pada media agar PGE sebanyak dua ulangan lalu inkubasi lagi seperti kondisi semula.
- Setelah koloni tumbuh dan berdiameter 2-4 mm, lalu tuangkan medium NA yang mengandung Pb dan Cd (Pb(NO3)2 dan Cd(NO3)2 pada permukaan medium PGE yang telah ditumbuhi MPLB.
- Kemudian inkubasi biakan agar cawan yang telah dilapisis media NA yang mengandung logam Pb atau Cd selama 2-3 hari.
- Beri koloni mikroba (bakteri, Khamir) yang tumbuh dengan gas H2S dalam desikator selama 10 menit. Bakteri yang mampu mengakumulasi logam berat ditunjukkan dengan ciri-ciri koloni bewarna gelap. Untuk logam lain dilakukan dengan prosedur yang sama.
- Isolasi koloni yang mampu mengakumulasi logam berat dari medium agar ke PGE yang baru. Selanjutnya karakterisasi MPLB terhadap karakter fisiologi, biokimia, dan DNA. Selanjutnya, mikroba unggul dalam mengakumulasi logam berat akan diidentifikasi jenisnya.
- Inokulasi mikroba (109 sel ml-1) pengakumulasi logam berat pada media cair PGE dengan berbagai pH yang mengandung logam yang terukur.
- Kocok biakan pada inkubator penggoyang selama 5 (lima) hari. Panen biakan yang telah tumbuh dengan cara sentrifusasi pada kecepatan 5.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4°C.
- Ukur kandungan logam supernatan menggunakan AAS pada panjang gelombang 248,5 nm. Pengurangan konsentrasi logam merupakan kemampuan reduksi logam berat oleh mikroba. Sebagai kontrol digunakan supernatan dari media logam tanpa mikroba.
DAFTAR PUSTAKA
Dave, S.R. 1994. Biosorption of heavy metal. Proch.Acad. Environ. Biol. 3(1): 21-24.
Gadd, G.M. 1990. Metal tolerance. p 178-210. In C. Edward (Ed.). Microbiology of extreme environments. Mcgraw-Hill. New York. Gadd, G.M. & C. White. 1993. Microbial treatament of metal pollution-
working biotechnology. Trends in Biotechnology 3 (2): 353-359. Mullen, M.D., D.C. Wolf, F.G. Ferris, T.J. Beveridge, C.A. Fleming, & G.W.
Bailey. 1989. Bacterial sorption of heavy metal. Apll. Environ. Microbial. 55: 3143-3149.
Pumpel, T., Pernfu, B. Pigher, L. Diels, & F. Schiner. 1995. A rapid screening method for the isolation of metal-accumulating microorganisms. Ind. Microbiol J. 14: 213-217.
Spain, A. 2003. Implications of microbial heavy metal tolerance in the environment. Reviews in Undergraduate Research 2: 1-6.
2.12