AKTIVITAS DEHIDROGENASE
3.4.1 Pengukuran Nitrifikasi Masa Inkubasi Singkat (Berg & Rosswall, 1985)
Prinsip
Pengukuran laju nitrifikasi dengan metode ini didasarkan atas penetapan nitrit (NO2-) setelah contoh tanah diinkubasi dengan larutan natrium klorat (NaClO3), dengan atau tanpa ammonium sulfat, selama 5 atau 24 jam pada suhu 25oC. Penambahan klorat bertujuan untuk memblokir oksidasi lanjutan dari nitrit yang terbentuk. Dengan demikian, laju NO2- yang terbentuk setara dengan laju oksidasi NH4+, sehingga hanya kandungan NO2- saja yang perlu diukur.
Bahan dan Alat
- Tabung Erlenmeyer (ukuran 100 ml) - Kertas saring
- Inkubator dengan pengatur suhu 25oC - Spektrofotometer
Bahan kimia dan larutan
- Larutan natrium klorat I (1,5 M NaClO3)
Larutkan 15,97 g NaClO3 dalam 70 ml akuades, kemudian tambahkan akuades sampai volume mencapai 100 ml.
- Larutan natrium klorat II (75 mM NaClO3)
Encerkan 10 ml larutan natrium klorat I dengan akuades sampai volume larutan mencapai 200 ml
Larutkan 0,13214 g (NH4)2SO4 dalam 800 ml akuades, kemudian tambahkan akuades sampai volume mencapai 1.000 ml
- Larutan KCl
Larutkan 149,12 g KCl dalam 700 ml akuades, kemudian tambahkan akuades sampai volume mencapai 1.000 ml
- Bufer (0,19 M; pH 8,5)
Larutkan 10 g NH4Cl dalam akuades, atur pH sampai 8,5 dengan NH4OH, kemudian encerkan dengan menambahkan akuades sampai volume mencapai 1.000 ml
- Reagen untuk penetapan nitrit
Larutkan 2 g sulphanilamide dan 0,1 g naphthyl-diethylene- diammonium chloride dalam 150 ml akuades, lalu tambahkan 20 ml asam fosforik pekat. Setelah dingin, encerkan larutan dengan akuades sampai volume mencapai 200 ml.
- Larutan stok nitrit (1.000 µg N ml-1)
Larutkan 4,9257 g natrium nitrit dalam 700 ml akuades, kemudian tambahkan akuades sampai volume mencapai 1.000 ml. Simpan pada suhu 4oC.
- Larutan standar nitrit (10 µg N ml-1)
Encerkan 5 ml larutan stok nitrit dengan akuades sampai volume mencapai 500 ml.
Prosedur
29) Estimasi nitrifikasi tanpa penambahan amonium
- Masukkan 5 g tanah ke dalam masing-masing tabung Erlenmeyer (100 ml), kemudian tambahkan 2,5 ml larutan natrium klorat II. Tutup tabung dengan tutup karet berlubang (Cap-o-test) dan inkubasi 2 tabung selama 24 jam pada suhu 25oC. Tabung ketiga sebagai kontrol disimpan pada suhu -20oC.
- Setelah masa inkubasi, tambahkan 5 ml akuades, kemudian 10 ml larutan KCl. Setelah tercampur rata, segera saring untuk mendapatkan supernatan.
- Pipet 5 ml supernatan ke dalam tabung reaksi, kemudian tambahkan 3 ml bufer dan 2 ml reagen untuk penetapan nitrit. Goyang-goyang tabung agar tercampur rata, kemudian diamkan selama 15 menit pada suhu kamar.
- Ukur intensitas warna dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm (Intensitas warna sebaiknya diukur dalam kurun waktu 4 jam).
30) Estimasi nitrifikasi dengan penambahan amonium
- Masukkan 5 g tanah ke dalam masing-masing tabung Erlenmeyer, kemudian tambahkan 0,1 ml larutan natrium klorat I dan 20 ml larutan amonium sulfat, tutup tabung dengan tutup karet berlubang
(Cap-o-test) dan inkubasi 2 tabung selama 5 jam pada suhu 25oC. Tabung ketiga sebagai kontrol segera disimpan pada suhu -20oC. - Setelah masa inkubasi, tambahkan 5 ml larutan KCl, setelah itu
dicampur merata dan segera saring untuk mendapatkan supernatan.
- Pipet 5 ml supernatan ke dalam tabung reaksi, tambahkan 3 ml bufer, 2 ml reagen untuk penetapan nitrit, goyang-goyang tabung agar tercampur rata, kemudian diamkan selama 15 menit pada suhu kamar.
- Ukur intensitas warna pada 520 nm. Kalibrasi Plot
- Pipet masing-masing 0, 2, 4, 6, 8, dan 10 ml larutan standar nitrit ke dalam tabung Erlenmeyer (100 ml), kemudian tambahkan masing- masing 40 ml larutan KCl 2Μ untuk estimasi nitrifikasi tanpa penambahan amonium, atau 20 ml larutan KCl 2M untuk estimasi nitrifikasi dengan penambahan amonium. Selanjutnya encerkan larutan dengan akuades sampai mencapai volume 100 ml. Ukur intensitas warna seperti yang dijelaskan di atas.
Perhitungan
Hasil perhitungan tiap contoh dikoreksi dengan hasil pengukuran kontrol. Jumlah nitrit yang terbentuk dihitung sebagai berikut:
Keterangan:
bk = berat kering 1 g contoh tanah lembap (berat tanah kering ditetapkan berdasarkan berat kering oven 105oC selama 3 jam);
5 = berat contoh tanah yang digunakan; t = lama waktu inkubasi dalam (jam);
V = total volume larutan yang ditambahkan ke dalam contoh (12,5 ml untuk estimasi nitrifikasi tanpa penambahan amonium atau 25,1 ml untuk estimasi nitrifikasi dengan penambahan amonium).
3.4.2 Ulasan
Metode pengukuran nitrifikasi dengan masa inkubasi singkat dikembangkan untuk tanah-tanah dengan pH > 5 (misalnya tanah-tanah
NO2-N (µg g -1 bk) supernatan x V NO2-N (µg g -1 bk)/t = 5 x bk
dS/dt = [koSX/(Km + S)]
pertanian), sehingga metode ini tidak sesuai untuk tanah-tanah dengan pH < 5 dimana laju nitrifikasi sangat rendah.
Klorat (NaClO3) dapat diadsorbsi oleh koloid mineral (anorganik) dan organik, sehingga untuk tanah-tanah dengan kadar C organik > 3,5% jumlah klorat yang digunakan harus lebih tinggi. Selain itu, apabila kadar nitrit dalam contoh tanah melebihi kadar standar nitrit yang digunakan, contoh perlu diencerkan dengan akuades.
Hasil pengukuran nitrifikasi masa inkubasi singkat dapat digunakan untuk estimasi aktivitas potensial populasi bakteri nitrifikasi dalam tanah. Estimasi ini didasarkan atas perbandingan parameter kinetik dan biomassa pada contoh tanah yang diukur dan aktivitas bakteri yang ditetapkan pada kultur murni. Di dalam kultur murni, bakteri nitrifikasi mengoksidasi substrat berdasarkan kinetik Michaelis-Menten yang juga setara (diikuti) di dalam tanah dengan persamaan:
dimana dS dt-1 adalah laju oksidasi substrat, S adalah konsentrasi substrat, t adalah waktu, X adalah kepadatan sel bakteri nitrifikasi, Km adalah konstanta Michaelis-Menten, dan ko adalah aktivitas maksimum per sel (koX = Vmax, velositas maksimum ekspresi Michaelis-Menten standar). Dalam kondisi S>> Km, maka X dapat diestimasi dengan hanya mengetahui data ko dan dS dt
-1
dengan persamaan:
Laju oksidasi substrat dS dt-1 ditetapkan seperti metode yang telah diuraikan. Nilai ko dapat diperoleh dari kultur murni berbagai bakteri nitrifikasi (Belser & Schmidt, 1980) yang nilainya berkisar dari 0,001 sampai 0,023 piko mol per sel, antara lain untuk genus Nitrosomonas, Nitrosospira,
Nitrosolobus, dan Nitrobacter.
Daftar Pustaka
Alef, K. 1995. Nitrogen mineralization in soils. p 234-257. In K. Alef & P. Nannipieri (Eds.) Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry. Academic Press. London.
Belser, L.W. & E.L. Schmidt. 1980. Growth and oxidation of ammonia by three genera of ammonium oxidizers. FEMS Microbiol. Lett. 7:213- 216.
Berg, P. & T. Rosswall. 1985. Ammonium oxidizer numbers, potential and actual oxidation rates in two Swedish arable soils. Biol Fert Soils 1:131-140.
Myrold, D.D. 1997. Transformation of nitrogen, p 259-294. In D.M. Silvia, J.J. Fuhrmann, P.G. Hartel, & D.A Zuberer (Eds.) Principles and Applications of Soil Microbiology. Prentice Hall. New Jersey.
Roper, M.M & K.M. Ophel-Keller. 1997. Soil microflora as bioindicators of soil health. p 157-177. In C. Pankhurst & B.M. Doube (Eds.) Biological Indicators of Soil Health. CAB International. New York. Schmidt, E.L & L.W. Belser. 1994. Autothrophic nitrifying bacteria. p 159-
177. In R.W. Weaver, S. Angle, P. Bottomley, D. Bezdicek, S. Smith, A. Tabatabai, & A. Wollum (Eds.) Methods of Soil Analysis (Microbiological and Biochemical Properties). SSSA. Wisconsin, USA.
3.5
DENITRIFIKASI
R. D. M. Simanungkal it
Pada kondisi oksigen terbatas dalam tanah, berbagai bakteri aerobik menggunakan nitrat sebagai akseptor hidrogen alternatif. Nitrat bervalensi lima direduksi lewat nitrit bervalensi tiga menjadi oksigen nitrous bervalensi dua dan satu dan akhirnya menjadi molekul dinitrogen bervalensi nol, seperti digambarkan sebagai berikut.
2NO
3 -2NO
2 - -2[O]2NO
N O
2 -[O] -2[O] -[O]N
2ion nitrat ion nitrit oksida nitrit oksida nitrous nitrogen elemen
(+5) (+3) (+2) (+) (0)
Pada kondisi alami produk utama adalah molekul dinitrogen, sedangkan oksida nitrous hanya dilepaskan dalam jumlah kecil (Tiedje, 1982).
Kehilangan melalui denitrifikasi dapat ditetapkan melalui tiga metode. Metode pertama adalah metode neraca N15 dengan menaksir senyawa berlabel N15 yang tidak dapat diperoleh (non-recovery). Pada metode ini hanya evolusi gas yang berlabel N15, yang berasal dari pupuk yang ditetapkan (Chichester & Smith, 1978). Metode kedua untuk penetapan kehilangan N melalui denitrifikasi adalah berdasarkan pengukuran 15N2- in
situ dan produksi 15N2O (Rolston et al., 1978). Metode yang ketiga berdasarkan penghambatan reduksi N2O menjadi N2 oleh bakteri dengan memberikan asetilen (C2H2) dan menetapkan denitrifikasi semua N-nitrat tanpa memperhatikan asalnya. Teknik penghambatan asetilen dapat dipakai untuk penelitian laboratorium maupun untuk penelitian lapangan (Ryden et al., 1979a; Nieder et al., 1989). Dalam bab ini hanya metode ketiga yang dikemukakan.
3.5.1 Laju Denitrifikasi Aktual dan Potensial berdasarkan Teknik