AKTIVITAS DEHIDROGENASE
3.5.2 Penetapan in situ Denitrifikasi Total dengan Teknik Penghambatan Asetilen (berdasarkan Ottow et al., 1995)
Prinsip
Kehilangan melalui denitrifikasi total (N2 + N2O-N ) dapat dihitung di lapang yang tidak terganggu (undisturbed) dengan memakai teknik penghambatan asetilen (TPA). TPA didasarkan pada penghambatan total aktifitas reduktase N2O dari bakteri denitrifikasi oleh asetilen (HC ≡ CH ). Reduktase N2O memiliki afinitas yang tinggi terhadap C2 H2 , karena C2 H2 memiliki struktur yang sama dengan N2O (N ≡ N –O). Prasyarat TPA adalah adanya konsentrasi asetilen sekurang-kurangnya 0,2 - 1% (v/v) dalam atmosfer tanah. Pada taraf ini pelepasan N2O yang ditampung pada permukaan tanah dengan rongga terbuka dapat dipakai sebagai ukuran denitrifikasi total per satuan luas tanah. Eksperimen laboratorium dasar telah menunjukkan bahwa jumlah N2O-N yang dihasilkan dengan adanya C2 H2 , sama dengan jumlah N2O-N + N2 yang dilepaskan tanpa adanya asetilen.
Bahan dan alat (selain peralatan dasar laboratorium)
- Kotak terbuat dari PVC (50x10x15 cm atau sesuai dengan yang diinginkan) dilengkapi dengan rangka baja dan penutup terbuat dari plexiglas yang dapat dipindah, demikian juga lubang masuk dan keluar udara yang terbuat dari PVC dengan garis tengah 10 mm (Gambar 1). - Kolom gelas (atau polietilen) untuk menangkap CO2 dan H2O (berisi
granul CaCl2 NaOH)
- Tabung gelas (lurus, panjang 20 cm, garis tengah 2 cm; atau berbentuk U, panjang 50 cm, garis tengah 2 mm) untuk menangkap N2O pada pelet saringan molekul (0,5 nm).
- Sumbat karet
- Pipa gelas (garis tengah 0,5 mm) - Pipa karet (garis tengah 0,5 mm)
- Pengukur aliran (0–70 l.min-1) dengan katup jarum - Pompa vakum
- Pipa PVC ( panjang 1 m, garis tengah 6 mm untuk memasukkan C2H2 ke dalam tanah
- Pipa polietilen (garis tengah 6 dan 10 mm) - Bor tanah listrik (10 mm x 60 cm)
- Labu Erlenmeyer (1.000 ml) dengan percabangan samping dan sumbat karet
- Kelem tabung, kran bercabang dua, septum karet yang cocok ke dalam selang labu Erlenmeyer (Gambar 2)
- Botol gelas dengan saluran keluar dan sumbat yang pas - Suntikan (1 dan 10 ml) yang dilengkapi pengunci
- Selang PVC atau baja (panjang 1 m, garis tengah 6-10 mm dengan lubang masuk pengambilan sampel udara
- Selang mikro PVC (garis tengah 0,5 mm) - Katup septum (garis tengah 8-12 mm) - Jarum bersisi ganda
- Tabung vakum (5 ml)
- Sumber listrik di tempat eksperimen (stop kontak atau generator lapang)
- Gaskromatograf (GC)
Tergantung pada konsentrasi N2O, gunakan GC yang dilengkapi dengan ECD dan/atau TCD. Untuk ECD, kisaran deteksi adalah 0,1 – 400 ng N2O-N, sedang untuk TCD kira-kira 0,1 – 50 µg N2O-N.
Kolom metal : panjang 2 m
Filling : Porapak Q, 60 – 80 mesh
Gas pembawa untuk ECD : N2 (ECD bermutu) atau campuran Ar/CH4 = 95/5, laju alir: 30 ml.menit-1
Gas susulan (make up) untuk ECD: N2 atau Ar/CH4 = 95/5, laju alir: 40 ml.menit-1
Gas pembawa untuk TCD : He, laju alir: 30 ml menit-1 Suhu oven : 400C
Suhu injektor : 600C
Suhu ECD : 3000C
Gambar 1. Alat untuk penetapan jumlah total kehilangan karena denitrifikasi dengan TPA (Ottow et al., 1995)
Bahan kimia dan reagen - Asetilen (mutu: teknis) - N2 (mutu ECD)
- He (kemurnian 99,996% v/v) - Gas kalibrasi
N2O dilarutkan dalam N2 (100 ppmv, 99,995 v/v) CO2 , O2 dan N2O (99,995 v/v)
- Saringan molekuler (0,5 nm, pellet 2mm) - CaCl2 granul
- NaOH dan CaCl2 (dalam bentuk granul yang tersedia secara komersial)
Gambar 2. Alat untuk melepaskan N2O yang diadsorbsi dengan saringan molekul (pellet 0,5- nm) yang telah dikumpulkan di lapang (Ottow et al., 1995)
Prosedur
- Untuk memperoleh pengukuran yang andal, pilihlah tempat percobaan secara hati-hati dan ambillah contoh tanah sehomogen mungkin. Dengan hati-hati, tekan kotak Plexiglas (untuk menghindari panas yang berlebihan) sehingga fotosintetis dan respirasi tanah dapat berlangsung normal sampai kedalaman tanah 5 cm (sekurang-kurangnya 4 ulangan). Pada lahan pertanian antara baris dipakai kotak yang kecil tapi panjang, sedangkan pada padang rumput dianjurkan pakai kotak empat persegi panjang.
- Buat 6 lubang (dalam 60 cm, garis tengah 10 mm) di sekitar kotak dengan bor
- Sehari sebelum menetapkan jumlah N2O yang keluar dari permukaan tanah, isi setiap kotak dengan 40 L asetilen melalui keenam lubang sampai tidak bertekanan (4 jam)
- Tiga jam sebelum pengumpulan N2O, tambahkan 10 L asetilen (2 jam) melalui selang PVC ke dalam tanah. Periksa distribusi dan konsentrasi asetilen dalam udara tanah melalui selang pengambilan gas yang dimasukkan dengan hati-hati dalam lubang yang sudah dibor sebelumnya. Konsentrasi asetilen 0,2-1% (v/v) harus ada dalam udara
tanah. Konsentrasi ini diperoleh dengan mudah bahkan pada tegangan air yang relatif tinggi sampai kira-kira kapasitas lapang (6 kPa).
- Lewatkan asetilen melalui tabung yang berisi asam sulfat pekat (untuk menghilangkan kontaminasi aseton) sebelum dimasukkan ke dalam tanah. Selama periode ekuilibrasi (2 jam), pindahkan penutup kotak untuk menghindari akumulasi gas asetilen dan peningkatan suhu dalam kotak
- Selama periode pengambilan sampel N2O aktual, tutup penutup gelas, masukkan aliran udara 20 l.menit-1 secara terus menerus ke dalam kotak dengan menggunakan pompa vakum, katup jarum dan alat pengukur aliran (Gambar 1). Sedot N2O yang keluar dari tanah melalui filter CO2 dan H2O (yang berisi CaCl2 dan NaOH), dan kumpulkan dalam tiga penampung (panjang 19 cm, garis tengah 2,5 cm) yang berisi pelet saringan molekul ukuran 0,5 nm.
- Bawa N2O yang diabsorbsi pada saringan 0,5 nm setelah 4-8 jam ke laboratorium. Secara serempak, ambil sampel N2O dari udara sekitar saringan molekul yang lain.
- Untuk mencegah mikroorganisme beradaptasi terhadap substrat asetilen, ganti tempat pengambilan setiap 4 hari.
- Lepaskan oksida nitrogen yang diabsorbsi pada saringan molekul 0,5 nm dari pelet ke dalam labu Erlenmeyer (kira-kira 1.000 ml) yang berisi 150 ml akuades (Gambar 2). Setelah 2 jam, gantikan vakum dengan udara, dan tentukan konsentrasi N2O pada setiap labu dengan kromatografi gas.
Penghitungan hasil
- Sesudah konsentrasi N2O di udara sekitar dikurangi, hitung fluks N2O permukaan dalam g N2O-N.ha
-1
hari-1 (lihat 3.5.1). Laju denitrifikasi aktual dan potensial dengan TPA,
- Sebelum memulai pengukuran dengan TPA, tentukan dulu konsentrasi nitrat aktual dalam tanah, karena tanah dapat menjadi sink bukan
source N2O bila konsentrasi nitrat rendah berdasarkan jumlah bahan organik yang mudah dirombak.
Catatan
31) Manfaat utama TPA adalah:
- dapat digunakan pada ekosistem alami dan juga ekosistem yang sudah terganggu (misalnya sudah pernah dipupuk)
- relatif sederhana, peralatan tidak mahal
- pengukuran N2O sensitif dengan kromatografi gas (ECD)
- pemakaian ruang yang sama untuk menetapkan jumlah pelepasan N2O-N alami pada tempat yang sama tanpa mendirus asetilen 32) Keterbatasan TPA
- heterogenitas tanah (terutama pada sebaran bahan organiknya) dan juga variabilitas temporal dan spasial proses denitrifikasi pada keadaan lapangan.
- variabilitas hasil tinggi pada tanah (liat) dengan pergerakan (tortuoisy) yang tinggi dan/atau kandungan air yang tinggi yang mungkin membatasi difusi pelepasan C2H2 dan N2O yang rata. - penghambatan total nitrifikasi terjadi walaupun konsentrasi C2H2
rendah.
- penggunaan asetilen sebagai sumber karbon untuk denitrifikasi dapat terjadi bila jumlah karbon tanah (Ct) lebih rendah dari 1%. - hasil kurang baik pada tanah-tanah yang konsentrasi nitrat awalnya
rendah, tetapi kandungan bahan organiknya yang mudah dirombak relatif tinggi. Pada kondisi seperti itu, N2O yang dihasilkan direduksi lagi menjadi N2 walaupun pada konsentrasi C2 H2 yang tinggi. Oleh karena itu, pengamatan nitrat selama pengukuran lapangan perlu.
Daftar Pustaka
Bauernfeind, G. 1995. Actual and potential denitrification rates by acetylene- inhibition technique. p. 151-155. In F. Schinner, R. Öhlinger, E. Kandeler, & R. Margesin (Eds.) Methods in Soil Biology. Springer- Verlag Berlin Heidelberg.
Chichester, F.W. & S.J. Smith. 1978. Disposition of 15N labeled fertilizer nitrate applied during corn culture in field lysimeters. J. Environ, Qual. 7: 227 – 232.
Nieder, R., G. Scholl Mayer, & J. Richter. 1989. Denitrification in the rooting zone of cropped soils with regard to methodology and climate: a review. Biol. Fertil. Soils : 8: 219 – 226.
Ottow, J.C.G., G. Benckiser, & H.J. Lorch. 1995. In situ quantification of total denitrifikation losses by acetylene-inhibition technique. p. 155- 161. In F. Schinner, R. Öhlinger, E. Kandeler, & R. Margesin (Eds.) Methods in Soil Biology. Springer-Verlag Berlin Heidelberg.
Rolston, D.E., D.L. Hoffman, & D.W. Toy. 1979. Field measurement of denitrification: I. Flux of N2 and N2O. Soil Sci. Soc. Am. J. 42:863- 869.
Ryden, J.C., L.J. Lund, and D.D. Focht. 1979a. Direct measurement of denitrification loss from soils.I. Laboratory evaluation of acetylene inhibition of nitrous oxide reduction. Soil Sci. Soc. Am. J. 43: 104-110. Ryden, J.C., L.J. Lund, and D.D. Focht. 1979b. Direct measurement of
denitrification loss from soils. II. Development and application of field methods. Soil Sci. Soc. Am. J. 43: 110 – 118.
Tiedje, J.M. 1982. Denitrification. p. 1011-1026. In A.L. Page, R.H. Miller, & D.R. Keeney. (Eds.) Methods of Soil Analysis. Part 2. Am. Soc. Agron, Soil Sci. Soc. Am. Madison, Wisconsin.
Wilhelm, E., R. Battino, & R.J. Wilcock. 1977. Low pressure solubility of gases in liquid water. Chem. Rev. 77: 219 –262.