ESTIMASI C-MIKROBA
3.1.1 Metode Fumigasi dan Ekstraksi (Vance et al., 1987)
ESTIMASI C-MIKROBA
Edi Sant osa & Sri Widat i
Biomassa mikroba didefinisikan sebagai bagian dari bahan organik tanah yang terdiri atas mahluk hidup berukuran ≤ 5 – 10 µm3 (Alef & Nannipieri, 1995). Pada umumnya biomassa mikroba dinyatakan dalam mg C kg-1 tanah atau µg C mg-1 tanah, terutama pada tanah yang mempunyai kadar C-organik 1 – 5%. Kadar C-mikroba tanah relatif kecil dibanding dengan C-tanah secara keseluruhan, tetapi mikroba tanah berperan penting dalam keberlangsungan siklus hara. Para peneliti berusaha untuk mengetahui biomassa mikroba sehubungan dengan peran pentingnya dalam menyimpan nutrisi dan energi (Parkinson & Paul, 1982), salah satu pembentuk struktur dan stabilitas tanah, penanda ekologis, dan tempat berkumpulnya (pool) hara sebagai cadangan nutrisi (Alef & Nannipieri, 1995).
Pendugaan biomassa mikroba biasanya menggunakan perlakuan biomassa sebagai komponen tunggal, walaupun diketahui bahwa terdapat keragaman populasi berbagai jenis mikroba dengan berbagai perbedaan karakter biokimia tanah. Beberapa metode telah digunakan untuk mengestimasi biomassa mikroba tanah. Untuk menghindari kesalahan perlu ditetapkan bahwa pendugaan biomassa tanah terdiri atas dua aspek (Alef & Nannipieri 1995), yaitu:
1. Kriteria indikator biomassa mikroba: indikator kuantitatif biomassa mikroba hanya diperuntukkan bagi sel-sel mikroba yang hidup dan secara cepat dapat terurai, terlepas ke dalam lingkungan tanah. Kadar senyawa yang terlepas ke lingkungan tanah bersifat konstan dan secara kuantitatif dapat diekstraksi dari tanah. Metode yang dapat dipercaya untuk estimasi indikator ini harus tersedia.
2. Tersedia cara-cara yang memungkinkan untuk mengkalibrasi metode yang digunakan dan perhitungan data ke dalam biomassa.
Aspek-aspek ini saling tergantung sebab teknik estimasi indikator biomassa tanah yang sangat sensitif dan handal akan tidak berguna jika terdapat kelemahan dan cacat bagi metode kalibrasi yang digunakan.
Dalam bab ini disajikan beberapa metode estimasi biomassa mikroba yang telah digunakan oleh para peneliti berdasarkan atas prinsip yang berbeda-beda.
Prinsip
Fumigasi dengan kloroform membunuh dan melarutkan sel mikroba dengan lepasnya sitoplasma ke dalam lingkungan tanah. Bahan-bahan sel dapat diekstraksi dari tanah. Alef & Nannipieri (1995) mengemukakan bahwa C-organik, total N dan NH4-N, ninhydrin-reaktif N, C-karbohidrat. C- fenol reaktif dapat diekstraksi dengan 0,5 M K2SO4.
Alat
- Inkubator
- Neraca analitik ketelitian 3 desimal - Desikator hampa udara (Gambar 1) - Pompa listrik
- Penggoyang (Shaker) - Alat pendingin
- Kertas saring Whatman No. 42 - Labu ukur 100 ml
- Dispenser 10 ml - Pipet ukuran 5 ml - Spektrofotometer
a
b
Gambar 1. Desikator (a) dengan pompa penghisap udara (b)
Bahan
- Kloroform (CHCl3) bebas alkohol - Kapur soda (p.a.)
- 0,5 M K2SO4
Larutkan 87,135 g K2SO4 dengan akuades sampai volume 100 ml
- Asam sulfat pekat - Kalium dikromat 1N
Larutkan 98,1 g K2Cr2O7 dengan 600 ml akuades dalam gelas piala, tambah 100 ml asam sulfat pekat, panaskan hingga larut sempurna, dinginkan, dan tambah akuades sampai volume menjadi 1.000 ml.
- Larutan standar 5.000 ppm C
Larutkan 12,51 g glukosa (p.a.) di dalam labu ukur 1.000 ml dengan akuades sampai volume 1.000 ml
Prosedur
- Bagi contoh tanah yang masih lembap (50 g berat kering), menjadi 2 (tiap contoh 25 g berat kering).
- Masukkan contoh tanah yang tidak difumigasi (sebagai kontrol) ke dalam botol ukuran 250 ml dan segera ekstraksi dengan 100 ml 0.5 M K2SO4 dengan rasio pengekstrak: berat kering tanah = 4 : 1 (v/w). - Goyang dengan penggoyang selama 30 menit pada 200 rpm dan saring
dengan kertas saring Whatman No. 42.
- Masukkan contoh tanah yang akan difumigasi ke dalam botol ukuran 50 ml.
- Letakkan botol ukuran 50 ml yang berisi contoh tanah basah bersama beker gelas yang berisi 25 ml kloroform bebas alkohol dan botol kapur soda di dalam desikator yang dialasi kertas tisu basah.
- Keluarkan udara dari dalam desikator dengan pompa listrik sampai kloroform mendidih selama 2 menit.
- Inkubasi desikator di tempat gelap selama 24 jam pada suhu 25o C. - Setelah fumigasi, keluarkan kloroform dan pindahkan tanah ke dalam
botol ukuran 250 ml dan segera ekstraksi dengan 100 ml 0,5 M K2SO4 dengan rasio pengekstrak : berat kering tanah = 4 : 1 (v/w).
- Goyang dengan penggoyang selama 30 menit pada 200 rpm, saring dengan kertas saring Whatman No. 42.
- Tambahkan 10 ml K2Cr2O7 1 N pada filtrat hasil ekstraksi, kocok, dan tambah 10 ml asam sulfat pekat, kocok. Diamkan selama 30 menit. - Ukur absorbansi larutan tersebut dengan spektrofotometer pada
panjang gelombang 561 nm.
- Sebagai pembanding, buat larutan standar 0 dan 250 ppm C, dengan memipet 0 dan 5 ml larutan standar 5.000 ppm C ke dalam labu ukur 100 ml (Sulaeman et al., 2005).
Catatan: jika pembacaan contoh melebihi standar tertinggi, penetapan diulangi dengan menimbang contoh lebih sedikit, faktor dalam
perhitungan diubah sesuai berat contoh yang ditimbang. Semua filtrat jika tidak bisa langsung dikerjakan lebih lanjut disimpan pada suhu -5o C.
Perhitungan
Kadar C-organik (mg kg-1 tanah) = ppm kurva x ml ekstrak 1.000 ml−1 x 100 mg contoh−1 x fk
= ppm kurva x 0,25 x 100. 2500−1 x fk = ppm kurva x 0,1 x fk
Keterangan:
• pmm kurva = kadar contoh dari kurva hubungan antara kadar deret standar dengan pembacaannya setelah dikoreksi blanko
• fk = faktor koreksi kadar air tanah
Keterangan:
• S = nilai rata-rata kadar C-organik contoh (dengan kloroform) • C = nilai rata-rata kadar C-organik kontrol (tanpa kloroform) • 0,35 = faktor kEC (konversi aliran C ke C-mikroba)
Ulasan
Bobot contoh tanah yang dapat dipakai antara 200 mg – 200 g dengan kelembapan 30 %, pada tanah kering sebagian mikroba tanah tidak terpengaruh/mati oleh fumigasi kloroform. Aktivitas enzim maupun autolisis pada kelembapan < 30 % akan menurun. Kadar air tanah dapat berfluktuasi, biomassa C-mikroba tanah pada kadar air 40 – 50 % hampir sama dengan tanah jenuh air, tetapi jangan diinkubasi dalam suasana anaerob.
Penetapan biomassa juga dapat dilakukan pada tanah lumpur atau tanah sawah, tetapi pada tanah yang padat (dipadatkan) sehingga tidak dapat dipecah, pengukuran biomassa tidak dapat dilakukan dengan metode fumigasi dan ekstraksi.
Selama inkubasi dan fumigasi, kapur soda dapat mengikat CO2 sehingga membuat tingkat CO2 tetap rendah, hal ini dapat mempengaruhi hasil pengukuran C-organik. Hasil pengukuran C-organik juga dipengaruhi oleh waktu fumigasi dan suhu saat inkubasi. Waktu fumigasi yang lebih
S − C
C-biomassa (µg g-1 tanah) =
pendek dan suhu yang lebih rendah akan menghasilkan pengukuran C- organik yang lebih rendah.
Sel-sel akar muda tanaman juga dipengaruhi oleh fumigasi kloroform, sehingga bahan sel akar-muda juga akan terekstraksi oleh K2SO4. Oleh karena itu pada contoh tanah yang mengandung banyak akar muda, sebelum diekstraksi akar tersebut harus dibuang lebih dahulu.
Metode fumigasi dan ekstraksi dapat digunakan pada tanah yang baru saja diberi pembaik tanah zat organik seperti jerami atau glukosa. Pada tanah yang mempunyai kadar bahan organik > 20 % menggunakan rasio tanah : pengekstrak = 1 : 4 dan pada tanah (serasah) berkadar 94% rasio tersebut menjadi 1: 20.
3.1.2 Metode Fumigasi dan Ekstraksi setelah Pra-Ekstraksi