1)Fakultas Pertanian Universitas Andalas
2)Balai Pengkajian Teknologi Pertanian) Sumbar
ABSTRAK
Tanaman Lansek Manih (Lansium spp.) merupakan tanaman buah spesifik dan merupakan iconya Kabupaten Sinjunjung. Pemkab tidak ada usaha budidaya, hal ini ditandai dilapangan hanya dijumpai pohon yang sudah berumur lanjut serta disekitar batangnya dililit oleh benalu/parasite. Tujuan penelitian ini adalah mendapatkan informasi tentang keberadaan tanaman yang memiliki sifat unggul seperti rasa manis dan keragaman tanaman. Penelitian dilakukan di tiga kecamatan (Empat Nagari, Koto Tujuh dan Sijunjung) dan di laboratorium agronomi Jurusan BDP Fakutas Pertanian Unand selama 5 (lima) bulan dan penelitian análisis karakterisasi molekuler selama 3 (tiga) bulan di laboratorium Bioteknologi Fakultas pertanian Universitas Brawijaya Malang. Terdapat dua kelompok aksesi utama pada pesertanse kemiripan 26% - 64% (variasi sebesar 38%). Hubungan kekerabatan dekat pada kelompok dua: antara aksesi Sijunjung 6 dan Sijunjung 8 serta Empat Nagari 4 dan Empat Nagari 5 dengan kemiripan sebesar 64%. Berdasarkan penciri molekuler dengan analisis SSR; terdapat dua kelompok utama pada persentase kemiripan 41% - 88% (variasi sebesar 47%). Hubungan kekerabatan genotip yang paling dekat terjadi pada kelompok dua, yaitu antara aksesi Empat Nagari 1 dan Empat Nagari 3 dengan kemiripan sebesar 88%. Kadar gula buah Lansak Manih tertinggi dijumpai pada sampel Empat Nagari 4, yaitu : 19 %..Genotipe sampel 4 yang memiliki rasa sangat manis berasal dari Empat Nagari berpotensi untuk di jadikan pohon induk sebagai sumber bahan tanam untuk koservasi tanaman Lansek Manih.
Key Word : Lansek Manih, terancam punah, Identifikasi, karakterisasi, morfologi dan molekuler PENDAHULUAN
Tanaman lansek manih (Lansium spp.) merupakan tanaman tropis beriklim basah yang berasal dari Malaysia dan Indonesia (Kalimantan Timur). Dari negara asalnya tersebut kemudian menyebar ke Vietnam, Myanmar, dan India. Di dunia dikenal tiga macam spesies Lansium yang mirip satu sama lain, yakni duku, langsat, dan pisitan (getahnya paling banyak). Namun, yang terkenal adalah duku dan langsat, tanaman ini termasuk family Meliaceae Ordo Sapindales dan golongan tanaman langsat yang memiliki manfaat utama tanaman lansek manih sebagai makanan buah segar atau makanan olahan lainnya. sebagai obat anti diare ,obat menyembuhkan demam dan dapat pula digunakan untuk mengasapi rumah di malam hari sebagai repellent, biasanya dicampur daun lagundi atau tersendiri.
Tanaman Lansek Manih (Lansium spp.) merupakan tanaman buah spesifik dan merupakan iconya Kabupaten Sinjunjung, dan pada saat ini kondisi tanaman ini bila tidak dikembangkan kedepan akan punah. Tanaman ini terkenal dengan rasanya yang eksotik,yaitu manis menyatu dan sedikit rasam masam, tetapi sejak 5 tahun terakhir rasanya banyak yang sudah berubah menjadi asam akibat serangan hama dan penyakit dan perubahan iklim serta saat ini sedikit sekali populasi tanaman lansek manih mengingat selama ini baik masyarakat maupun Pemkab tidak ada usaha budidaya, hal ini ditandai dilapangan hanya dijumpai pohon lansek yang sudah berumur lanjut serta disekitar batangnya dililit oleh benalu/parasit (Dinas Pertanian dan Perkebunan Kabupaten Sijunjung, 2009).
Langkah awal yang perlu dilakukan adalah dengan melakukan eksplorasidan identifikasi sumber daya genetik tanaman lansek manih di Kabupaten Sijunjung Kegiatan eksplorasi merupakan
untuk mengamankan dari kepunahan.,untuk mengetahui dan mempelajari keragaman genetik tanaman dari hasil eksplorasi dapat dilakukan dengan penggunaan penanda (marka) tertentu dan analisis kimiawi jaringan tanaman. Penggunaan penanda genetik dapat dibedakan atas penanda morfologi, sitologi dan molekuler.Penanda morfologi merupakan salah satu sifat sekunder yang perlu diperhatikan dalam menetapkan karakteristik pertumbuhan tanaman. Pengamatan sifat sekunder dapat dilakukan terhadap sifat morfologis tanaman dan anatomi kulit. Ciri morfologi tanaman meliputi antara lain : tinggi pohon, bentuk kanopi, daun, bunga, biji dan buah termasuk rasa buah yang dilihat dari kandungan gula daging buah. Penggunaan penanda morfologi sering mengalami penyimpangan terhadap keragaman genotip yang terjadi, akibat perubahan kondisi lingkungan. Selain penanda morfologi, juga dapat dilakukan dengan penanda molekuler.
Azrai (2006) melaporkan teknologi marka molekuler pada tanaman jagung berkembang sejalan dengan makin banyaknya pilihan marka DNA, salah satunya dengan Simple Sequence Repeats (SSR).
Teknik molekuler seperti Simple Sequence Repeats (SSR) telah digunakan untuk karakterisasi plasma nutfah, seleksi dengan bantuan markah, pemetaan gen yang dapat dilanjutkan dengan isolasi dan kloning gen, serta diagnosis penyakit. Dengan markah molekuler telah dilakukan analisis hubungan kekerabatan varietas padi, analisis genetik penyakit blas dan hawar daun bakteri, serta seleksi tanaman padi tahan bakteri hawar daun,seleksi kopi Arabika yang tahan terhadap nematode. Dengan menggunakan teknik molekuler dapat dirakit gen untuk ketahanan terhadap hama dan penyakit tanaman. Informasi keragaman genetik dan hubungan kekerabatan antar tanaman lansek manih (Lansium spp.) sampai saat ini yang ada tingkat DNA sangat terbatas.
Tujuan dari kegiatan ini adalah untuk: 1). Mempelajari katarkter morfologi (Batang, daun, bunga, buah dan biji) ; 2). Mendapatkan pola pita DNA secara molekuler dan 3). Mendapatkan kadar gula buah lansek manih
Keluaran yang diharapkan dari penelitian ini adalah : 1). diperolehnya dendogram tanaman lansek manih melalui penampakan karakter morfologi dan 2). diperolehnya informasi kadar gula buah lansek manih.dan 3). diperolehnya pola pita DNA lansek manih melalui penciri molekuler.
METODOLOGI PENELITIAN
Eksplorasi tanaman yang dilakukan dalam penelitian ini dengan menggunakan metode survey, dan sampel yang diambil secara proposive sampling, dimana dilakukan pencarian dan penandaan terhadap pohon Lansek yang buahnya memiliki rasa manis diantara pohon Lansek yang ditemui melalui uji rasa. Sampel pohon tanaman diambil 10 % dari pohon yang dijumpai, dan jumlah petani responden yang digunakan dalam survey tanaman ini adalah 30 orang. selama tiga bulan di kabupaten Sijunjung. Pengamatan fenotipik dilaksanakan dalam dua bagian, yakni pengamatan morfologi pohon dan buah. Pengamatan morfologi pohon dilakukan lebih awal, sedangkan pengamatan morfologi buah dilakukan pada saat musim panen. Kriteria pengamatan: pohon yang telah pernah berbuah dan sampel diambil 10% dari populasi yang ada . pengamatan morfologi pohon meliputi antara lain: warna batang, panjang tangkai daun (cm), panjang daun(cm), lebar daun(cm), bentuk daun, warna bunga,. jumlah bunga per kelompok, jumlah bunga yang terbanyak dari satu kelompok atau tangkai , bentuk buah , warna buah, berat buah (g), diameter buah (cm), berat biji per buah (g). Rinciannya pengamatan morfologi dapat dilihat pada daftar deskripsi di Lampiran 10.Penelitian ini dilakukan selama 3 bulan dilapangan (Kabupaten Sijunjung) dan laboratorium Agronomi Fakultas Pertanian Univeristas Andalas. Untuk mengetahui luas atau sempitnya variabilitas karakter yang diamati a dilakukan analisis varians fenotipik dan standar deviasi. Nilai varians fenotipik dihitung sebagai berikut :
) 1 ( 2 ) ( 2
n Xrerata Xi f
(Steel dan Torrie, 1995)Keterangan:
2f = varians fenotip;X
i = nilai rata-rata genotip ke i; n = jumlah genotype yang diamatiSedangkan standar deviasi varians fenotip dihitung sebagai berikut : Sd √
2f (Anderson dan Brancoft, 1952 dalam Daradjat, 1987). Kriteria penelitian luas atau sempitnya variabilitas karakter yang diamati dihitung berdasarkan criteria Daradjat (1987) sebagai berikut :2 . 2 2 f Sd f
berarti variabilitas fenotip luas2 . 2 2 f Sd f
berarti variabilitas fenotip sempitUntuk menguji kadar gula buah Lansak dapat dilakukan dengan menggunakan aat refractometer. Refractometer adaah aat yang digunakan untuk mengukur kadar dan konsentrasi bahan terarut misalnya gula, garam, protein, dan sebagainya. Prinsip kerja dari refractometer sesuai dengan namanya adaah dengan memanfaatkan refraksi cahaya.
Identifikasi karakteristik molekuler dengan Simple Sequence Repeats (SSR). Percobaan ini bertujuan untuk melihat kekerabatan tanaman lansek manih (Lansium spp.) berdasarkan karakterisitik molekuler. Penelitian ini dilakukan selama 5 bulan di Laboratorium Bioteknologi Fakultas Pertanian.
Kegiatan karakterisasi dengan penanda molekuler (SSR) meliputi ekstraksi DNA dari jaringan daun tanaman Lansek Manih yang telah disimpan pada berbagai sistem penyimpanan (nitrogen cair, disimpan pada suhu kamar, dan disimpan pada freezer), Isolasi DNA, dan analisis kualitas DNA.
Protokol untuk sidik jari (fingerprinting) dengan marka SSR, meliputi ekstraksi DNA, amplifikasi, elektroforesis, dan visualisasi pola pita, mengikuti prosedur yang digunakan oleh (Taylor and Powell 1982) dengan sedikit modifikasi sesuai kondisi laboratorium. Dalam penelitian ini digunakan 30 marka SSR yang polimorfis.Sekuen dari 30 marka mikrosatelit yang digunakan dalam penelitian ini adalah lokus SSR dan no. bin sebagai berikut::1). phi109275 1.00; 2). phi011 1.09; 3) phi96100 2.00;
4). phi109642 2.00; 5). phi101049 2.09;6). phi374118 3.02; 7). phi102228 3.04; 8 ). phi053 3.05; 9). phi072 4.00 ;) 10. phi079 4.05; 11). phi109188 5.00; 12). umc1153 5.09; 13)phi0786.05;14).phi452693 6.06; 15).phi299852 6.08;16).phi057 7.01;17).phi0347.02: 18).phi328175 7.04; 19). phi420701 8.00; 20).phi2333768.03;21).umc1161 8.06;22).umc1279 9..00; 23).phi065 9.03; 24).phi448880 9.05; 25).phi059 10.02; 26).umc1196 10.07; 27).umc 1294 7.00; 28)zct 161; 29).nco 030 dan 30). phi 080
Proses amplifikasi menggunakan mesin PTC-100 Programmable Thermal Controller (MJ Research,Waltham, Mass). Praimer dibeli dari Research Genetics (Huntsville, Ala.). Fenotip SSR diskoring sebagai data biner, yaitu 1 jika ada pita dan 0 jika tidak ada pita, atau 9 (missing data) jika pita yang muncul meragukan. Data biner ini yang akan digunakan dalam analisis data molekuler.
Nilai PIC (Polymorphism Information Content) untuk SSR dihitung sesuai formula yang dikemukakan oleh Smith et al. (1997) dalam Satria, Gustian, Swasti dan Kasim, 2008) , Format data biner digunakan untuk membuat analisis klaster berdasarkan metode pautan rata-rata, yang dikenal sebagai UPGMA (Unweighted Pair Group Method using Arithmatic Average) dengan alat bantu NTSYS-pc versi 2.1 (Rohlf, 2000).
Dendrogram dikonstruksi untuk delapan kombinasi inbrida berdasarkan koefisien Jaccard. Nilai jarak genetik diperoleh dari hasil analisis kemiripan genetik dengan formula: S = 1 – GS ;dengan : S = jarak genetik dan GS = kemiripan genetik.
Analisis Boot-Strapping dilakukan untuk mengetahui tingkat konfidensi pengelompokan dengan menggunakan program WinBoot. Persentase tingkat heterosigositas untuk masing-masing inbrida yang dianalisis diperoleh dengan membagi jumlah alil heterosigot yang terdeteksi dengan total alil yang terdeteksi dikali 100%. Persentase tingkat kemurnian kultivar dihitung dengan menghitung jumlah pita yang sesuai dengan pola persilangan masing-masing hibrida, dibagi dengan total marka yang digunakan, dikali 100%.
Untuk karakterisasi mikrosatelit, hasil isolasi DNA genom dipotong dengan menggunakan beberapa enzim restriksi ujung tumpul, yaitu RsaI, HincII dan AluI. Reaksi pemotongan dilakukan sesuai dengan protokol, dengan sedikit modifikasi. Selanjutnya proses ligasi dilakukan berdasarkan protokol Edwards et al. (1996), dengan adaptor MluI 21-mer dan 25-mer (GibcoBRL) pada ujung 51
dengan membrane yang telah mengandung oligonukleotida bermotif mikrosatelit. Hibridisasi ini meliputi persiapan membran hibridisasi, proses hibridisasi dan pengayaan mikrosatelit melalui amplifikasi hasil elusi dengan PCR. Duapuluh satu oligonukleotida bermotif mikrosatelit yang digunakan diperoleh dari Operon Technologies, Inc dan Sigma-Genosys. Oligonukleotida tersebut dikelompokkan menjadi empat,berdasarkan titik leleh sebagai berikut: kelompok I (T25, AT15 , AAT10, AATT10, AAAT10, CAT10); kelompok II (AAC10, AAG10, CTA10, TAG10, CTC10, GACA10); kelompok III (AC15, AG15, GGT10, C20) dan kelompok IV (AGC10, GCT10, GTG10, GGA10, GCC10).
Primer hasil perancangan kemudian disintesis di PROLIGO(R) Singapura. Primer kemudian dipakai dalam reaksi PCR untuk amplifikasi DNA mikrosatelit motif (TC)n dari keempat galur bibit tersebut. Adapun protokol PCR touch down diatur sesuai kondisi berikut: predenaturasi 940C selama 3 menit, 2 siklus pertama terdiri dari denaturasi dengan suhu 940C selama 30 detik, dilanjutkan dengan
annealing pada suhu 63,50C selama 30 detik, elongasi pada suhu 720C selama 30 detik. Sub siklus kedua sebanyak 13 siklus terdiri dari denaturasi pada suhu 940C selama 15 detik, annealing pada suhu 63,50C selama 30 detik (diturunkan 0,50C setiap siklus), elongasi pada suhu 720C selama 15 detik. Subsiklus terakhir (sebanyak 27 siklus) terdiri dari denaturasi pada suhu 940C selama 15 detik, annealing pada suhu 57,50C selama 15 detik, elongasi pada suhu 720C selama 15 detik dan diakhiri dengan pasca-elongasi pada 720C selama 3 menit.
Untuk mengetahui kelompok tanaman berdasarkan pengamatan karakter fenotipik, data fenotipik dinalisis dengan menggunakan program NTSYSpc (Numerical Taxosonomi and Multivariate Analysis) versi 2.1 (Rohlf, 2000). NTSYSpc merupakan program yang digunakan untuk melihat struktur data multivariate, diantaranya digunakan pada data dari sample dua atau lebih populasi yang berbeda.
HASIL DAN PEMBAHASAN 1. Profil Sijunjung
Kabupaten Sijunjung berada pada ketinggian sekitar 100 meter sampai 1500 meter dari permukaan laut, terletak pada posisi geografis 00º 18’ 43” LS – 00º 41’ 46” LS & 100º 30’ 52” BT – 100º 37’ 40” BT. Suhu berkisar antara 21 – 33oC, dengan rata-rata curah hujan 13,6 mm/hari untuk tiap bulan. Kondisi topografi bervariasi berbukit, bergelombang dan dataran yang cukup bervariasi pada setiap wilayah. Luas kabupaten Sijunjung ± 3.130,40 Km2.Kabupaten ini mempunyai 8 kecamatan .
Survey lokasi terhadap tanaman Lansek Manih, telah dilakukan di 3 Kecamatan Kabupaten Sijunjung, yaitu kecamatan: Empat Nagari (EN) , Koto Tujuh(KT) dan Sijunjung (SJ). Hasil identifikasi morfologi tanaman Lansek Manih di tiga kecamatan: Empat Nagari ( 120 – 250 m dpl), Koto Tujuh (560 – 930 m dpl) dan Sijunjung ( 260 – 550 m dpl) telah dilakukan, dimana dari masing-masing kecamatan tersebut berdasarkan pohon telah berbuah ditetapkan 8 pohon untuk dijadikan sampel untuk diamati karakter morfologi. Hasil pengamatan terhadap morfologi batang Lansek Manih menunjukkan adanya variasi dari 8 sampel pohon ditiap-tiap kecamatan yang ditemukan.
2. Karakterisasi Morfologi Tanaman Lansek Manih (Lansium spp.)
Karakterisasi morfologi terhadap 24 sampel tanaman Lansek Manih dari 3 lokasi pengambilan sampel memberikan keragaman yang berbeda. Data pengamatan karakter morfologi pada setiap sampel setelah dilakukan skoring, dan setelah dianalisis NTSYS-pc menghasilkan dendogram yang disajikan pada Gambar 1.
kemiripan 0.27 0.28 0.30 0.31 0.32 0.34 0.35 0.36 0.37 0.39 0.40 0.41 0.42 0.44 0.45 0.46 0.48 0.49 0.50 0.51 0.53 0.54 0.55 0.56 0.58 0.59 0.60 0.62 0.63 0.64 0.65 0.67 EmpatNagari1 EmpatNagari2 EmpatNagari7 EmpatNagari3 KotoTujuh8 Sijunjung2 Sijunjung6 Sijunjung7 Sijunjung8 KotoTujuh7 KotoTujuh1 Sijunjung3 EmpatNagari4 EmpatNagari5 EmpatNagari6 Sijunjung1 Sijunjung4 Sijunjung5 EmpatNagari8 KotoTujuh4 KotoTujuh2 KotoTujuh3 KotoTujuh6 KotoTujuh5
Gambar 1. Dendoram dari 24 sampel (Aksesi) tanaman Lansek manih yang terdiri dari Empat Nagari: 1 s.d 8 ; Koto Tujuh : 1 s.d 8, dan Sijunjung: 1 s.d 8 berdasarkan karakter morfologi (Kualitatif dan Kuantitatif).
Berdasarkan dendogram pada Gambar 1 menunjukkan hubungan kekerabatan masing-masing aksesi. Pengelompokkan aksesi terbentuk pada tingkat kemiripan 27,0% - 67% ( variasi besar 40%). Pada kemiripan 27 % dikelompokkan menjadi 2 kelompok. Kelompok pertama terdiri dari 18 aksesi,yaitu: Empat Nagari 1 dan Empat Nagari 2, Empat Nagari 7; Empat Nagari 3, Koto tujuh dan Sijunjung 2; Sijunjung 6, Sijunjung 7 dan Sijunjung 8, Koto Tujuh 7; Koto tujuh 1 dan Sijunjung 3; Empat Nagari 4 dan Empat Nagari 5;Empat Nagari 6 dan Sijunjung 1, Sijunjung 4, Sijunjung 5 , sedangkan kelompok dua terdiri dari 6 aksesi, yaitu: Empat Nagari 8 dan Empat Nagari 4; Koto Tujuh 2 dan Koto Tujuh 3, Koto Tujuh 6, Koto Tujuh 5.
Hubungan kekerabatan yang paling dekat terjadi pada kelompok dua, yaitu antara aksesi Sijunjung 7 dan Sijunjung 8 dengan kemiripan sebesar 67%. Keragaman tanaman Lansek Manih berdasarkan karakterisasi morfologi dapat dipengaruhi oleh faktor genetik dan lingkungan.
3. Keragaman Fenotip Tanaman Lansek Manih
Hasil pengamatan terhadap keragaman fenotipe tanaman ansek Manih, menunjukkan adanya variasi dari 24 sampel yang diambil dari 8 genotip sampel perlokasi (Kecamatan: Empat Nagari, Koto Tujuh dan Sijunjung), sebagai mana yang tercantum pada Tabel 2. Adanya variasi terhadap karakter panjang dan lebar helaian daun,tetapi tidak terhadap panjang tangkai daun,panjang tangkai bunga, diameter tangkai bunga, panjang stylus dan ketebaandaging buah. Keragaman fenotipe terjadi pada karakter panjang helaian daun dengan niai variabitas yang luas, demikian pula dengan lebar helaian daun, tetapi dengan karakter lain memiiki nilai variabiitas yang sempit.
Tabel 2. Analisis keragaman fenotip terhadap 24 sampel tanaman Lansek Manih yang berasal dari tiga lokasi di Kabupaten Sijunjung
No. Pengamatan Ragam