PEMBUATAN HEWAN MODEL TIKUS PUTIH (RATTUS NOVERGICUS) UNTUK EPILEPSI
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BONE MARROW MESENCHYMAL STEM CELL UNTUK TERAPI MODEL EPILEPSI LOBUS TEMPORAL
ABSTRAK
Bone marrow dapat dikultur dan menghasilkan stem cell yang mempunyai kemampuan untuk membentuk sejumlah kecil jaringan mesodermal mesechymal. Tujuan penelitian in vitro ini adalah (1) untuk mengkaji kemampuan bone marrow
saat dikultur menjadi mesenchymal stem cell (MSCs) dan progenitor neural sel (PNCs (2) untuk mengkaji aplikasi bMSCs untuk terapi model epilepsi pada tikus.
Bone marrow diaspirasi dari tulang femur dan tibia setelah tikus dianestesi dengan injeksi intraperitoneal Ketamin 10 mg/kgbb dan Xylazin 2 mg/kgbb. Sel dikultur dalam larutan α Modified Eagle media (Gibco, USA), Penicillin 50 U/ml,
Streptomycin 50 mg/ml, fetal bovine serum (FBS) 10% dan diinkubasi pada 370C; 5% CO2. Sel di kultur sampai kepadatan 20.000.000 sel/ cm. Identifikasi dari
mesenchymal stem cell dilakukan pemeriksaan CD 44, CD 45, CD 105. Percobaan kedua dengan mengkultur MSCs ditambahkan 0,02 mM β-mercaptoethanol
(βME), 10 ng basic fibroblast growth factor (bFGF,) dan 10 ng epidermal growth factor ( EGF). Setelah 7 hari terlihat sel seperti neuron dan dilanjutkan pemeriksaan RT-PCR untuk identifikasi nestin dan β aktin. Penelitian ini menunjukan MSCs setelah 1 minggu sudah mencapai konfluensi 80% dan pada saat 4 minggu mencapai jumlah 20.000.000 sel/cm. Identifikasi marker MSCs CD45 (-), CD44(+) dan CD 105(+). Progenitor neural sel positif dengan marker
neuron nestin 327bp dan β aktin 500bp. Bone marrow dapat dikultur in vitro
menjadi MSCs dan PNSc
Kata kunci: bone marrow, mesenchymal stem cell, sel progenitor neural
ABSTRACT
Bone marrow can be cultured and can produce stem cells that are able to transform to mesenchymal mesoderm tissues. The objectives of this research are (1) to analyze the ability of cultured bone marrow cells to transform to mesenchymal cells, (2) mesenchymal become neural progenitor cells after being induced by β-mercaptoethanol and bFGF. The bone marrow was aspirated from rats femur and tibia, after anaesthetized using Ketamin 10mg/kg and Xylazin 2mg/kg. The aspirated bone marrow was centrifuged at 200G for 30 minutes at 25°C Ficoll Plaque. The cells were cultured in α Modified Eagle media (Gibco, USA), Pencillin 50U/ml, Streptomycin 50 mg/ml and fetal bovine serum (FBS) 10%, and incubated at 37°C and 5% CO2. CD 44, CD 45 and CD 105 were used to identify marker the mesenchymal stem cell. For further culture, to get the cell-like neurons, 0,02 mM β-mercaptoethanol (βME), 10ng basic fibroblast growth factor (bFGF) and 10ng epidermal growth factor (EGF) were added to the mesenchymal stem cell culture. After 7 days, cell-like neurons appeared and identify marker neuron cell nestin and β aktin.Cell cultured were confluenced
80% at 7th day of treatment dan after 4 weeks cell counted 20.000 cells/cm. MSCs positif CD 44, CD 105 and negatif CD45. PNCs was positf with nestin 327bp dan
β aktin 500bp. Bone marrow can be cultured in vitro to MSCs and PNCs. Keywords: bone marrow, mesenchymal stem cell, progenitor neural sel
42
PENDAHULUAN
Stem cell dapat dikultur dari banyak sumber seperti embrio (embryonic stem cell) atau dari stem cell dewasa yang berasal dari bone marrow, plasenta, umbilical, pulpa gigi, adipose, liver, kulit. Stem cell dari embrio mempunyai kemampuan pluripotent memiliki daya proliferasi yang tinggi, aktivitas enzim telomerase yang tinggi. Akibat daya proliferasi yang tinggi ini beresiko untuk terjadi pembentukan tumor (teratoma) dan karena terkait etis sumber untuk mendapatkannya alternatif sumber stem cell yang banyak dipakai untuk riset saat ini dengan memakai stem cell dewasa. Stem cell dewasa mempunyai potensi multipoten dan unipoten. Keterbatasan proliferasi dari sel ini hanya bisa membentuk sejumlah kecil sel atau jaringan terbatas pada lapisan benih tertentu (Paulsom et al. 2002, Baksh et al. 2004 dan Kolf et al. 2007).
Bone marrow salah satu dari sumber stem cell dewasa mengandung 2 tipe
stem cell yaitu stem cell hematopoitik dan mesenchymall. Mesenchymal stem cell
sesuai dengan kriteria International Society for Cellular Therapy merupakan sel yang melekat di dasar cawan kultur, dan permukaan antigennya mengekspresi CD 105, CD 90, CD 73 dan kurang mengekspresi CD 34, CD 45, CD 11b, CD 14, CD 19 atau CD 79a dan human leukocyte antigen-DR ( HLA-DR) (Dominici et al.
2004).
Mesenchymal stem cell mempunyai kemampuan berdiferensiasi menjadi lapisan mesenchym seperti osteoblast, adiposa dan krondrosit atau bertransdiferensiasi menjadi neuron, sel epitel, sel hati, sel pankreas tergantung dari kondisi lingkungan sel ini tumbuh (Wright et al. 2011).
Mesenchymal stem cell tidak seperti hematopoitik stem cell pada saat dikultur dapat berkembang dalam jumlah banyak. Penelitian ini bertujuan (1) membuat stem cell dari kultur bone marrow (bMSCs) dan (2) induksi
mesenchymal stem cell menjadi neural progenitor cell sebelum ditransplantasikan kepada hewan model epilepsi.
43
BAHAN DAN METODE
Penelitian dilakukan di laboratorium Institut Tropical Disease Universitas Air Langga Surabaya (Unair). Penelitian dilaksanakan dari bulan Maret sampai Mei 2011.
Kultur bone marrow stem cell (bMSCs)
Bone marrow diambil dari tikus setelah dianestesi dengan Ketamin 10 mg/kg bb dan Xylazin 2 mg/kgBB. Bone marrow dari tulang femur dan tibia tikus diaspirasi ± 1 ml dengan jarum 18G ditambah heparin 0,01 ml. Setelah itu tikus dipelihara untuk perlakuan hewan model epilepsi dan diberi terapi stem cell.
Bone marrow dicampur dengan PBS dan Ficoll-Hypaque setelah itu di sentrifus 200 G 30 menit suhu 25ºC untuk memisahkan sel darah merah. Lapisan
buffy coat diambil dicampur dengan PBS untuk disentrifus kembali dengan kecepatan 1600 rpm selama 10 menit. Hasil dari sentrifus supernatan dibuang, pelet diambil ditambahkan medium penumbuh larutan α Modified Eagle media
(Gibco, USA) yang disuplementasi dengan Penicillin 50 U/ml, Streptomycin 50 mg/ml (Sigma, USA), dan fetal bovine serum (FBS) (Gibco, USA) 10%, diinkubasi pada 37ºC, 5% CO2. Sel dikultur di cawan kultur plastik (5cm) dan diamati pertumbuhan setiap hari. Setelah 3 hari medium diganti. Pada saat kultur bMSCs telah memenuhi 80% cawan kultur dilakukan pemisahan sel dengan tripsinisasi (0,05% trypsin/EDTA solution (Gibco) untuk dilakukan pasase (Gregory dan Prookop 2007). Kultur dilakukan sampai didapat jumlah MSC yang mencukupi untuk ditransplantasikan kepada tikus yang telah diindukasi kejang dengan bicuculine. Pada penelitian ini kultur dilakukan sampai pasase keempat dan lima.
Identifikasi dari mesenchymal stem cell
Mesenchymal stem cell sebelum ditranplantasikan dilakukan pemeriksaan CD 45, CD 44 dan CD 105. MSCs dari kultur dilakukan pemisahan sel dengan tripsinisasi (0,05% trypsin/EDTA solution (Gibco) menjadi sel monolayer. Dilakukan sentrifus kecepatan 9100 rpm selama 5 menit, lapisan supernatan dibuang, pelet yang tertinggal di dasar tabung ditambahkan PBS dilanjutkan
44
dengan resuspensi. MSCs di sentrifus kembali dengan kecepatan 300 rpm selama 5 menit pada suhu 25ºC. Pelet diambil ditambah medium α MEM dan dipindahkan
ke dalam sumur tempat kultur monolayer. Setelah tumbuh menjadi sel monolayer dilakukan pemeriksaan imunohistokimia dengan antibodi monoklonal rat CD 105, CD 45 dan CD 44.
Induksi diferensiasi sel neuron.
Sel pada cawan kultur dengan jumlah 1000-2000 sel/cm dtambahkan 0,02
mM β-mercaptoethanol (βME) selama 6 jam kemudian ditambahkan 10 ng basic fibroblast growth factor (bFGF, Roche), 10 ng epidermal growth factor ( EGF, Roche). Medium diganti setiap hari ketiga. Pada hari ketujuh sudah terlihat adanya pertumbuhan neural progenitor cell like (NPC), diantara sel fibroblas. Sel mengalami konfluensi setelah 12 hari kultur. Disaat sel mencapai konfluensi 80% dilakukan splitting dengan tripsinisasi. Pasase dilakukan sampai jumlah sel mencukupi konsentrasi yang akan digunakan untuk penelitian selanjutnya (Mareschia et al. 2006, Gharibani et al. 2009).
Identifikasi dengan marker neural stem cell.
Untuk membuktikan sudah terjadi diferensiasi neuron dilakukan pemeriksaan marker neuron nestin dan β aktin. Pemeriksaan PCR dilakukan untuk melihat kemampuan ekspresi gen dari bMSCs yang telah berdiferensiasi dan dikonfirmasi dengan metode RT PCR. Ekspresi nestin dan β aktin diamati hari ketujuh dari tahapan diferensiasi. RNA total diekstrasi dengan Trizol ( Invitrogen USA) dengan menggunakan primer nestin : 5` CTCTGACCTG
TCAGAAGAAT-3` (sense), β-actin: AGAAGATCTGGCACCACACC (sense), . PCR dilakukan sebanyak 30 siklus dan dianalisa dengan gel agarose 2,55 yang mengandung 100 mg/ml Ethidium Bromide (Gharibani et al. 2009).
Analisis Data
Hasil penelitian dianalisis secara diskriptif dan ditampilkan dalam bentuk gambar
45