PEMBUATAN HEWAN MODEL TIKUS PUTIH (RATTUS NOVERGICUS) UNTUK EPILEPSI
TRANPLANTASI BONE MARROW MESENCHYMAL STEM CELL UNTUK MODEL EPILEPSI
ABSTRAK
Penggunaan stem cell untuk mengatasi penyakit degeneratif saat ini masih dalam penelitian. Penelitian stem cell banyak dilakukan diberbagai negara untuk menemukan alternatif pengobatan epilepsi yang resisten dengan pengobatan yang ada saat sekarang. Penelitian ini bertujuan untuk melihat pengaruh pemberian bone marrow mesenchymal stem cell (bMSCs) pada hewan model yang telah diinduksi kejang dengan bicuculine 8mg/kgbb intraperitoneal. bMSCs diberikan pada 4 kelompok tikus: (1) 3 kali injeksi intravena 1x2x105 setiap 2 minggu, (2) 1 kali injeksi dosis tinggi (1x5x106) intravena, (3) 1 kali injeksi progenitor neuron like- cell
(PNCs) dosis 1x2x106 intravena, (4) 1 kali injeksi PNCs dosis 1x2x105 intraserebral. Pada minggu ketiga dan keenam setelah injeksi bMSCs dari masing-masing kelompok perlakuan dikorbankan tiga ekor. Otak, organ jantung, paru-paru, hati, ginjal, dan limpa dikoleksi untuk melihat perubahan patologis setelah pemberian stem cell. Hasil penelitian menunjukan bMSCs mempunyai kemampuan meregenerasi neuron di hipokampus dengan pemberian bMSCs 3x2x105 intravena didapatkan jumlah neuron hidup paling tinggi dibandingkan pemberian bMSCs intravena dosis tinggi dan PNCs satu kali pemberian baik intravena maupun intraserebral. Pengaruh bMSCs sistemik terhadap organ lain tidak memperlihatkan perubahan secara makroskopis dan mikroskopis.
Kata kunci: transplantasi, mesenchymal stem cell, progenitor neural sel
ABSTRACT
The use of stem cell to promote tissue repair in degenerative disease is an exciting of research . Stem cell is one of alternative treatment for intractable epilepsy. The objectives of this research are to observe the ability of stem cell after transplanted intra venous compared intra cerebral with different dose to regenerated in
50
hipocampus. The stem cell were transplanted to the epilepsy model rats after injected with bicuculine 8mg/kg intraperitoneally, and 3 rats were sacrificed each at week-3 and week-6. Group 4-6 after induced epilepsy received bMSCs injection, each using 3x2x105 Intra venous, 1x5x106 Intra venous, neuron progenitor at 1x2x106 Intra venous and neuron progenitor at 1x2x105 intracerebral. Histopathology preparations were made using samples from the brain, heart, lungs, liver, kidney and the spleen, and the pathological changes were observed. The activity of bMSCs to regenerate neurons can be seen that the injection of bMSCs 3x2x105 results the highest number of survived neurons compared bMSCs single high dose and PNSC. There is no systemic effect of bMSCs either macroscopic or microscopic.
Keywords: bone marrow mesenchymal stem cell, progenitor neuron, transplantation.
PENDAHULUAN
Makhluk hidup di dalam tubuhnya memiliki banyak lokasi yang mengandung
stem cell dewasa endogen seperti ditemukan pada bone marrow, otot, otak, hati, pulpa, jaringan adiposa, kulit. Pada waktu timbulnya penyakit, stem cell endogen tidak cukup memadai jumlahnya untuk memperbaiki injuri yang ada. Untuk mengatasi kondisi ini diperlukan tambahan stem cell eksogen untuk memperbaiki kerusakan yang timbul.
Berdasarkan tingkat maturasinya sumber stem cell yang dapat diambil dari tubuh ada 2 macam bentuk yaitu stem cell embrionik dan stem cell dewasa. Keuntungan penggunaan stem cell dewasa karena sel ini mempunyai kemampuan untuk digunakan sebagai terapi autologus, sementara stem cell embrionik beresiko terjadinya pembentukan teratoma dan masih dibatasi etik dalam penggunaan sumber sel dari embrio. Sementara kerugian penggunaan stem cell dewasa adalah terbatas kemampuan berdiferensiasi dan tidak bisa dipakai universal dalam tubuh ( Filip et al.
2003, Dantuma 2010).
Sel mesenchymal yang terdapat di bone marrow jumlahnya akan berkurang dengan bertambah usia. Pada saat neonatus ditemukan sel mesenchym 1/10.000 sel,
51
pada usia 30 tahun 1/250.000 dan saat usia 60 tahun hanya ditemukan 1/2.000.000 sel (Caplan 2007). Pemberian stem cell dari donor lain (allogenik) bisa mengatasi kendala untuk mendapatkan stem cell dalam jumlah banyak. Pemberian allogenik terbukti aman dan efektif karena dari penelitian yang dilakukan pada manusia, dan hewan menunjukan bahwa MSCs tidak mengekspresikan MHC kelas II sehingga tidak dapat dipresentasikan pada antigen presenting cell (APC). Pemberian allogenik tranplantasi mengekspresikan MHC kelas I intermidiate namun costimulator tetap tidak aktif sehingga MSC tetap anegi (Rastegar et al. 2010, Buja dan Vela 2010). MSCs dapat menekan aktivasi dan proliferasi limfosit T dan menggangu produksi cytokin dengan menurunkan produksi cytokin proinflamasi tumour necrosis factor
(TNF)-α, interferon (IFN)- . interleukin (IL)-12 dan meningkatkan cytokin anti inflamasi IL 10 . MSCs juga digunakan untuk pengobatan penyakit autoimun seperti rematoid artritis, dermatitis atopik, Multiple Sclerosis, polymiositis dan Graft Versus Host Disease (Ra et al. 2011).
. Pemberian stem cell dalam aplikasi klinis telah dilakukan dengan berbagai pendekatan. Transplantasi dapat diberikan lokal maupun sistemik. Penelitian Jackson et al. 2010 membuktikan penyuntikan dengan alat stereotatik neural stem cell dari folikel rambut dan dari bMSCs (50.000 sel dalam 5 μl) dilanjutkan dengan pemeriksaan MRI memperlihatkan bahwa stem cell bermigrasi sepanjang substansia alba, corpus calosum menuju otak kontra lateral. Stem cell masih bisa terdeteksi selama 28 hari sedangkan bMSCs masih terdeteksi sampai 94 hari. Pada pemberian melalui vena ekor memperlihatkan dalam 24 jam setelah disuntik dari kedua jenis
stem cell 8% sudah bermigrasi melalui pembuluh darah perifer ke daerah lesi di otak sementara pada pemberian lokal jumlah stem cell yang mencapai tempat lesi 10 kali lebih banyak. Pemberian MSC allogenik maupun autologus melalui injeksi sistemik bisa terdeteksi juga ada dijaringan non hematopoitik termasuk gastro intestinal, ginjal, kulit, paru-paru, timus dan hati. Sel ini masih bisa di deteksi dalam waktu 9 sampai 21 bulan setelah injeksi. Respon signal ini membuktikan bahwa secara fisiologis secara bermakna stem cell dapat bermigrasi di dalam tubuh saat diberikan sistemik (Kan et al. 2005).
52
Penelitian ini bertujuan untuk melihat pengaruh pemberian bMSCs dengan konsentrasi berbeda melalui injeksi sistemik intravena dibandingkan dengan pemberian langsung intraserebral dalam meregenerasi hipokampus.
BAHAN DAN METODE
Penelitian dilakukan di kandang hewan coba dan laboratorium Tropical Disease Center Universitas Air Langga Surabaya (Unair) dan laboratorium Patologi FKH IPB. Penelitian dilaksanakan dari bulan Mei sampai Oktober 2011. Tikus dipelihara dan diperlakukan sesuai dengan prosedur standar komisi etik penelitian FKH Unair.
Bahan Penelitian
Hewan coba yang digunakan adalah tikus jantan galur SpragueDawley umur 2 sampai 4 bulan dengan bobot badan berkisar antara 200-300 g sebanyak 36 ekor, yang berasal dari Laboratorium Tropical Disease Center Unair. Sebelum percobaan dilakukan, hewan diaklimatisasi tujuh hari untuk beradaptasi dengan lingkungan yang baru dan diberi makan dengan pakan standar dan minum ad libitum. Hewan model epilepsi diinjeksi bicuculine dosis 8 mg/kgbb intraperitoneal dan setelah 7 hari induksi dilakukan transplatansi stem cell.
Transplantasi bMSCs dan neuron progenitor (NPC).
Stem cell yang sudah terlabel dengan pewarna fluorescent PKH2 diberikan lewat injeksi di vena ekor tikus dan intraserebral setelah diukur jaraknya dengan alat stereotaktik daerah hipokampus anterior (AP) 5,5 mm caudal dari bregma, 5,5 mm sebelah kanan garis tengah dan 7,5 mm dari permukaan otak dibawah dura (Li et al. 2007).
53
Gambar 15 Transplantasi bMSCs dan progenitor neuron sel setelah di kultur melalui vena Ekor (A) dan intraserebral (B).
Tikus kemudian dipelihara dan diamati perubahan klinis. Pada pemberian intraserebral tikus diberikan antibiotik amoksilin sirup dosis 50 mg/kgbb dan parasetamol sirup sebagai anti nyeri 10 mg/kgbb. Sesudah minggu ketiga dan keenam perlakuan, tikus dikorbankan untuk pemeriksaan histopatologi.
Pembuatan preparat histologi
Setelah tikus dikorbankan otak, organ jantung, paru-paru, hati, limpa, ginjal dikoleksi dan difiksasi dalam larutan buffered Neutral Formalin (BNF) 10% selama 24 jam. Kemudian sampel diproses untuk pemeriksaan histologi dengan proses dehidrasi dengan direndam alkohol bertingkat dan penjernihan dengan xylol dan diinfiltrasi di larutan parafin cair, embedding, blocking dan dipotong dengan ketebalan 5µm. Dilekatkan diobjek glas dan diinkubasi dalam inkubator dengan suhu 37ºC selama 24 jam lalu diwarnai dengan Hematosilin-Eosin (HE) dan pewarnaan imunohistokima. Pemeriksaan identifikasi sel neuron atau sel glia menggunakan prosedur standar imunohistokimia, dengan menggunakan anti bodi mouse anti NeuN (chemicon international) 1:1000 dalam blocking solution. Setelah proses deparafinisasi dilanjutkan dengan proses antigen retrieval methode dengan merendam slide ke dalam buffer sitrat suhu 90-95ºC selama 30 menit. Dilanjutkan dengan
blocking endogenous activity. Setelah itu dilakukan inkubasi antibodi primer 24 jam dan keesokan harinya dengan antibodi sekunder, dilanjutkan pewarnaan DAB, chromogen dan counter stain dengan haematosilin. Dilanjutkan dengan dehidrasi dan penjernihan dan ditutup dengan cover glass dengan bahan perekat etelan. Pengamatan
54
histologi dan imunohistokimia parameter yang diamati meliputi bentuk, ukuran dan perubahan parenkim otak akibat induksi bicuculine apakah terjadi proses inflamasi, apoptosis, nekrosis, sklerosis dan pengaruhnya setelah pemberian stem cell apakah timbul regenerasi neuron,
Analisis Data
Data yang diperoleh dianalisis menggunakan ANOVA (analysis of variance)
pada taraf 5% dan dilanjutkan dengan uji LSD (least significant difference) untuk menentukan beda nyata antar perlakuan, Analisa menggunakan software The SAS System versi 9. Data yang bersifat kualitatif dijelaskan secara diskriptif.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil pemeriksaan histopatologi dan imunohistokimia.
Hasil pewarnaan HE terlihat pada Gambar 16 terlihat bahwa terjadi perbaikan regenerasi neuron di hipokampus dengan pemberian bMSC dan neuron progenitor. Pada pengamatan 3 minggu pertama terlihat dengan pemberian intravena 3 kali dosis kecil (M1) di daerah girus dentatus, neuron yang hidup hasilnya sama dengan pemberian neural progenitor intraserebral (M4).
Gambar 16 Rerata jumlah neuron normal pengamatan 3 minggu di hipokampus
K1= Kontrol negatif, K2= kontrol positif,
M1= bMSCs 3x2x105 intravena, M2= bMSCs 1x5x106 intravena, M3= PNCs 1x2x105 intravena, M4= PNCs1x2x105 intraserebral. 0 20 40 60 80 100 K1 K2 M1 M2 M3 M4 Jum lah neur on Perlakuan
Neuron normal 3 minggu
Ca 1 GD Ca3
55
Hasil pengamatan setelah 6 minggu di lokasi Ca1 dan Ca3 yang berpengaruh secara bermakna adalah pemberian bMSCs dengan dosis berulang 3 kali intravena (M1) sedangkan daerah girus dentatus tidak terlihat pengaruh pemberian stem cell
dari jumlah neuron yang hidup seperti yang tercantum pada Gambar 17.
Gambar 17 Rerata jumlah neuron normal pengamatan 6 minggu di hipokampus K1= Kontrol negatif, K2= kontrol positif,
M1= bMSCs 3x2x105 intravena, M2= bMSCs 1x5x106 intravena, M3= PNCs 1x2x105 intravena, M4= PNCs1x2x105 intraserebral.
Tabel 6 Rerata jumlah neuron normal di hipokampus tikus
Lokasi Waktu Perlakuan
minggu K1 K2 M1 M2 M3 M4 Ca l 3 1.06±0a 1.05± 0.02c 1.06±0.01ab 1.04±0.03d 1.05±0.02c 1.05±0.02bc 6 1.67±0.16a 1.51±0.17bc 1.55±0.22ab 1.35±0.22d 1.40±0.37cd 1.43±0.20bcd GD 3 1.960.07a 1.650.39b 1.930.12 a 1.620.43b 1.600.19b 1.920.13a 6 1.760.13a 1.630.12b 1.650.18b 1.530.0.14c 1.580.25bc 1.580.13bc Ca 3 3 1.530.10a 1.290.20bc 1.310.22bc 1.370.20b 1.240.15c 1.290.15bc 6 1.560.10a 1.350.17c 1.450.21b 1.280.18cd 1.240.27d 1.360.07c
Keterangan: Huruf yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan berbeda nyata p<0.05. K1= Kontrol negatif, K2= kontrol positif,
M1= bMSCs 3x2x105 intravena, M2= bMSCs 1x5x106 intravena, M3= PNCs 1x2x105 intravena, M4= PNCs1x2x105 intraserebral.
Dari penelitian ini pada Tabel 6 kemungkinan tidak terlihat respon perbaikan dengan pemberian bMSCs sistemik dosis tunggal dan sel neuron progenitor untuk
0 20 40 60 80 100 K1 K2 M1 M2 M3 M4 N eur on nor m al Perlakuan Neuron normal 6 minggu
Ca1 GD Ca3
56
memperbaiki kerusakan jaringan karena stem cell eksogen hanya sedikit jumlahnya yang bertahan hidup, ditambah dengan kondisi microenvironmental yang tidak mendukung terjadinya neurogenesis seperti kurangnya faktor pertumbuhan yang ada, dan adanya faktor toksik dikeluarkan dari jaringan yang rusak sehingga diperlukan pemberian berulang dari stem cell eksogen untuk memobilisasi dari stem cell
endogen. Pada kondisi patologis stem cell endogen tidak cukup memadai dalam mengatasi kerusakan yang timbul.
Hasil pemeriksaan imunohistokimia dengan marker Neu N pada daerah Ca1,Ca3 dan GD pemberian dosis berulang M1(3x2x105 intravena) lebih tinggi 0,42% dibandingkan pemberian dosis tinggi sekaligus (M2= 0,08%) dan pemberian PNCs (M3=0,17%) dan (M4=0,33%).Hasil penelitian ini lebih rendah dari yang ditemukan Chu et al. 2004 menemukan NeuN 1,5-2,5% sel. Keadaan ini menunjukan
microenvironment dan interaksi dari stem cell yang bisa bertahan hidup lama di jaringan yang rusak berperan terhadap keberhasilan pengobatan.
Gambar 18 Positif Neu N (marker neuron matur) di daerah Ca1(Gambar A), Ca3(GambarB) dan daerah girus dentatus/GD (Gambar C) ditunjukan tanda panah ( ). Neuron matur lebih banyak ditemukan positif pada pemberian MSCs sistemik berulang dosis 3x2x105 dibandingkan pemberian dosis 1x5x106 dan pemberian PNCs.
Mekanisme perbaikan kerusakan jaringan otak dengan pemberian stem cell
sistemik bermigrasi ke area yang rusak belum sepenuhnya dimengerti. Neuron stem cell dipermukaan selnya mengekspresi beberapa molekul sel seperti CD44 dan VLA-4 dan mempunyai kemampuan melekat di pembuluh darah terutama di daerah blood brain barier yang rusak. Zat kimiawi yang menginduksi kejang pada hewan model
50 μm
57
epilepsi akan meningkatkan kadar dari CD44 di girus dentatus (Borges et al. 2004). Keuntungan pemberian stem cell sistemik pada epilepsi diduga karena: (1) kejang pada status epilepsi akan menyebabkan kerusakan neuron yang luas, tidak tebatas hanya pada hipokampus, jadi transplantasi langsung ke parenkim otak tidak bisa langsung bermigrasi ke daerah yang jauh dari lesi. Pada pemberian stem cell sistemik
β gal+ cells juga ditemukan positif ada di hipokampus, amygdala, subiculum
terutama daerah kortek piriform (Chu et al. 2004) dan (2) transplantasi stem cell
intravena pemberiannya lebih alami tanpa menimbulkan kerusakan jaringan seperti pada pemberian lewat stereotaktik (Rothstein dan Snyder 2004, Chu et al. 2004).
Gambar 19 Pemberian stem cell sistemik positif Neu N pada glomerulus dan epitel
tubulus ginjal(A) dan pulpa putih limpa(B) seperti ditunjukan tanda panah ( ). Sel ini tidak menimbulkan trombosis, oklusi maupun infiltrasi lekosit dan kerusakan jaringan.
Pemberian stem cell secara sistemik pada penelitian ini ditemukan juga sel positif di glomerulus ginjal, insterstitial paru-paru, dan pulpa putih limpa tetapi tidak ditemukan kerusakan jaringan, infiltrasi leukosit dan pertumbuhan tumor. Penemuan ini sama dengan penelitian yang dilakukan oleh Chu et al. 2004 menemukan stem cell yang ditransplantasikan secara sistemuk juga ada di paru-paru (alveolus), ginjal (tubulus proksimal), limpa dan tidak menimbulkan sumbatan/ trombus pada pembuluh darah.
50μm B 50 μm
58
Gambar 20 Pemberian stem cell sistemik pada paru-paru (gambar A) positif ditemukan pada instertitial ditunjukan tanda panah ( ) dan negatif Neu N pada pemeriksaan imunohistokimia (gambar B).
Hasil penelitian ini dapat disimpulkan pemberian dosis kecil berulang setiap 2 minggu intravena jauh lebih baik dibandingkan pemberian sekaligus dengan dosis besar. Daerah hipokampus Ca1, Ca3 dan Girus Dentatus merupakan daerah yang rentan terhadap kerusakan otak. Pemberian bMSCs dapat memperbaiki degenerasi neuron. Pemberian intravena mesenchymal stem cell dapat memperbaiki kerusakan sel di hipokampus. Neurogenesis pada pemberian stem cell pada otak bisa melalui 3 proses (a) proliferasi (b) migrasi langsung ke area yang mengalami kerusakan (c) diferensiasi menjadi sel neuron. Mesenchymal stem cell bisa hidup di otak setelah ditransplatasi dan memperbaiki daerah injuri tergantung dari kondisi lingkungan,
nerve growth factor, kemampuan proliferasi, migrasi dan diferensiasi dari stem cell
(Yu et al. 2011). Mesenchymal stem cell juga mensekresi growth factor, cytokine, molekul adesi dan trophic factors. MSCs menginduksi perbaikan jaringan in vivo melalui kemampuannya berdifferensiasi atau mensekresi trophic factors (tanpa berdiferensiasi) dengan meningkatkan kemampuan lingkungan untuk meregenerasi jaringan atau sel yang rusak ( Chu et al. 2004)
50μm
50μm
59
KESIMPULAN
1. Mesenchymal stem cell dapat diberikan secara sistemik, intra lesi dan tidak menimbulkan reaksi penolakan baik secara klinis maupun pemeriksaan histopatologi.
2. Pemberian bMSCs intravena dosis rendah berulang lebih baik mengatasi degenerasi neuron di daerah Ca1, dan Ca3 dari pada pemberian dosis tinggi satu kali pemberian, pemberian sel neural progenitor intraserebral .
3. Pemberian stem cell secara sistemik tidak menimbulkan perubahan patologis pada organ jantung, paru-paru, hati, limpa dan ginjal sampai 6 minggu pengamatan.