Media Tanam Kultur Jaringan Tanaman Salah satu faktor penentu keberhasilan pelaksanaan kerja
3.2. Kebutuhan zat-zat organik
Zat-zat organik adalah persenyawaan yang mengandung karbon, ditambahkan pada medium kultur jaringan berupa gula, myo-inositol, vitamin, asam-asam amino dan zat pengatur tumbuh. Zat-zat organik tersebut biasanya tidak diberikan pada tanaman karena tanaman dapat mensintesis sendiri, tetapi pada kultur in
vitro, karena eksplan yang digunakan umumnya berukuran sangat
kecil dan tidak mampu mensintesis sendiri semua zat-zat organik tersebut, maka zat-zat organik harus ditambahkan pada medium.
Gula. Tumbuhan di alam bebas mencukupi kebutuhan gula
dengan mengasimilasi CO2 pada roses fotosintesa, dengan pertolongan klorofil dan sinar matahari, dijadikan glukosa, kemudian dijadikan pati, selulose dan persenyawaan-persenyawaan
Kultur Jaringan Tanaman 33 lain. Pada kultur in vitro, sel dan jaringan tumbuhan belum sempurna dalam melakukan asimilasi fotoautotrof, sehingga di perlukan gula sebagai sumber karbon dan energi. Selain sebagai sumber energi bagi sel dan jaringan, gula juga berfungsi sebagai penjaga keseimbangan tekanan osmotik potensial di dalam medium. Gula pada umumnya diberikan pada medium kultur berupa sukrosa atau komponen-komponennya seperti mono-sakarida glukosa atau fruktosa. Sukrosa pada medium kultur ditambahkan sebanyak 30 g.L-l. Glukosa atau D-glukosa biasanya ditambahkan dengan konsentrasi 20- 30 g.L-1, tergantung dari jenis
eksplan. Sukrosa ternyata lebih berpengaruh dalam perkembangan kalus, sedangkan pengaruhnya terhadap organogenesis belum dapat dipastikan (George dan Sherrington, 1984). Pada kultur mikrospora beberapa spesies tanaman digunakan maltosa. Maltosa dihidrolisis lebih lambat dibandingkan dengan sukrosa, ini memberi pengaruh yang lebih baik pada mikrospora yaitu dapat memacu embriogenesis (Indrianto et al., 1999).
Myo-Inositol. Myo-Inositol ditambahkan pada medium
untuk membantu diferensiasi dan pertumbuhan jaringan. Myo-Inositol ikut serta dalam beberapa reaksi metabolik penting yang berhubungan dengan. pembelahan sel. Myo-Inositol merupakan perantara pada perubahan glukosa menjadi asam galakturonat, juga sebagai prazat untuk pektin dan penyusun dinding sel.
Vitamin. Vitamin ditambahkan pada medium untuk
mempercepat pertumbuhan, diferensiasi kalus. Vitamin berfungsi sebagai kofaktor atau bagian dari molekul kofaktor dari reaksi-reaksi enzimatis penting, vitamin juga bertungsi protektif. Seperti halnya zat pengatur tumbuh, vitamin juga mempengaruhi (menstimulasi) inisiasi, pertumbuhan dan perkembang-an akar. George dan Sherrington (1984) memasukkan beberapa macam vitamin yang umum digunakan pada berbagai medium dasar, antara lain: Thiamin-HCl, Nicotinic acid, Pyridoxin-HCl,
Ca-D-Kultur Jaringan Tanaman 34
panthothenate, Folic acid, Choline chloride, dan Riboflavin, yang
sesemuanya merupakan anggota dari vitamin B kompleks.
Ascorbic acid dan adenin juga sering ditambahkan pada medium.
Vitamin labil terhadap pemanasan, dianjurkan untuk selalu menggunakan filter steril jika akan ditambahkan pada medium.
Thiamin merupakan vitamin yang esensial terdapat pada hampir
semua medium kultur jaringan tumbuhan yang cenderung mempercepat pembelahan sel pada meristem akar tetapi tidak berpengaruh terhadap pemanjangan sel. Thiamin merupakan bagian prostetik yang terdapat di dalam sel, berperan sebagai koenzim dalam reaksi yang menghasilkan enersi dari karbohidrat dan memindahkan enersi. Thiamin diberikan dalam jumlah yang bervariasi dari kira-kira 0,1 sampai 30 mg.L-1 (Doods dan Roberts, 1983). Nicotinic acid (niacin) penting dalam reaksi-reaksi enzimatis di samping peranannya sebagai prekursor dari beberapa alkaloid. Ascorbic acid sering ditambahkan pada medium, terutama untuk mencegah terjadinya pencoklatan (browning) pada permukaan irisan jaringan yang disebabkan karena terjadinya reaksi oksidasi senyawa polyphenol menjadi quinon yang berwarna coklat sehingga vitamin di sini berfungsi sebagai antioksidan.
Asam-asam amino. Asam amino merupakan sumber N
organik, penyusun protein dan asam nukleat, lebih cepat diserap oleh sel dan jaringan tanaman dari pada N anorganik di dalam medium kultur jaringan. Adapun asam amino yang umum ditambahkan pada medium adalah: Glutamine, Glycine, L-Cyteine, L-Arginine, L-Aspartic acid, dan L-Methionine.
Zat pengatur tumbuh. Selain nutrisi, zat pengatur tumbuh
sangat diperlukan sebagai komponen medium bagi pertumbuhan, perkembangan dan diferensiasi. Zat pengatur tumbuh aktif pada konsentrasi rendah dan diproduksi di dalam tubuh tanaman itu sendiri (endogen). Untuk keperluan kultur jaringan, telah dibuat zat pengatur tumbuh sintetik. Tanpa zat pengatur tumbuh,
Kultur Jaringan Tanaman 35 pertumbuhan eksplan akan terhambat bahkan mungkin tidak tumbuh sama sekali. Zat pengatur tumbuh dikelompokkan ke dalam beberapa grup: Auksin, Sitokinin, Gibberellin, Abscisic acid, dan Ethylene.
Auksin. Indole-3-acetic acid (IAA) merupakan auksin
alamiah yang terdapat pada sebagian besar tumbuhan. Disintesis dari tryptophane terutama di primordia daun, daun muda dan pada kecambah. IAA di transport dari sel ke sel dengan arah basipetal (dari pucuk ke akar). IAA berperan dalam mempengaruhi pemanjangan sel; pembelahan sel; diferensiasi jaringan vaskuler; inisiasi pembentukan akar; mempengaruhi dominasi apikal; zona absisi pada daun dan buah; pembungaan; pemasakan buah, dan lain-lain. IAA mudah larut dalam alkohol. Penggunaan IAA pada medium kultur kerap kali kurang menguntungkan karena mudah rusak oleh cahaya, oksidasi enzimatik dan pemanasan pada saat proses sterilisasi dengan autoclave. Penggunaan auksin sintetik lebih menguntungkan karena lebih stabil. Auksin sintetik yang umum digunakan pada medium adalah: 2,4-dichlorophenoxyacetic
acid (2,4-D); l-naphthaleneacetic acid (NAA) dan indole-3-butyric acid (IBA). Beberapa persenyawaan seperti dicamba (3,6-dichloro-O-anisic acid) dan picloram
(4-amino-3,5,6-trichloro-2-pyridinecarboxilic acid) pada konsentrasi tinggi merupakan
herbisida, digunakan sebagai auksin substitusi.
Kultur in vitro tumbuhan yang pada mulanya memerlukan auksin eksogen untuk pertumbuhannya, secara gradual atau bahkan secara tiba-tiba dapat hilang dan tidak memerlukan auksin lagi, hal yang demikian disebut sebagai habituasi terhadap auksin. Penggunaan auksin secara tunggal pada umumnya sudah cukup mampu untuk menginduksi pembentukan dan pertumbuhan kalus, tetapi untuk beberapa tanaman yang rekalsitran akan lebih membantu jika menggunakan lebih dari satu jenis auksin secara simultan.
Kultur Jaringan Tanaman 36 Pada kultur jaringan tanaman monokotil, terutama rumput-rumputan dan palma, juga pada kultur in vitro umbi akar wortel, memerlukan auksin sintetik seperti 2,4-D dengan dosis yang cukup tinggi. Penghilangan atau pengurangan kadar auksin pada sub kultur berikutnya dapat memacu produksi embrio somatik atau organ adventiv. Pertumbuhan kultur juga dapat dipacu dengan penambahan substansi yang dapat mengatur tingkatan IAA endogen misalnya, dopamine dapat menghambat aktifitas IAA oksidase sehingga tidak terjadi oksidasi terhadap IAA. Akibatnya, pertumbuhan jaringan dan organ pada kultur in vitro menjadi lebih baik. Penghambat sintesis auksin seperti 5-hydroxy-nitrobenzyl
bromide (HNB) dan 7-azaindole memacu embriogenesis somatik
pada kultur kalus citrus yang telah mengalami habituasi.
Sitokinin. Sitokinin adalah derivat dari adenin, kinetin (6-furfuryl-aminopurin) dan zeatin adalah sitokinin alami yang umum
digunakan secara meluas pada medium kultur. Sitokinin disintesis melalui modifikasi biokimia dari adenin, terjadi pada ujung akar dan biji yang tumbuh. Kebalikan dari auksin, sitokinin ditransport melalui xylem dari akar ke pucuk. Sitokinin hanya aktif jika ada auksin, pemberian sitokinin bersama auksin pada medium kultur dapat memacu pembelahan sel dan morfogenesis. Sitokinin mempengaruhi transport auksin, pertumbuhan kuncup lateral (mematahkan dominasi apikal), perkembangan daun, menghambat proses penuaan daun dan mempengaruhi perkembangan kloroplas. Sitokinin sintetik seperti N-6-benzyl-aminopurine (BAP) lebih sering digunakan pada medium kultur jaringan.
Phenylurea, substansi aktif yang terdapat pada air kelapa
mempunyai efek yang sama dengan zeatin, penggunaannya memerlukan konsentrasi yang lebih tinggi. Thidiazuron (N-enyl-N-1,2,3-thiazol-5-ylurea), yang secara komersial digunakan sebagai
defoliant, karena kemampuannya untuk menstimulasi produksi ethylene, dapat digunakan untuk memacu pembentukan dan
Kultur Jaringan Tanaman 37 proliferasi tunas in vitro. Substansi lain yang mempunyai aktifitas seperti sitokinin adalah endosperma cair pada kecambah jagung.
Diferensiasi selular dan morfogenesis in vitro terutama dikendalikan oleh interaksi antara konsentrasi auksin dan sitokinin yang diberikan pada medium kultur. Manipulasi rasio auksin: sitokinin dapat mempengaruhi organogenesis, pada perbandingan auksin sitokinin yang tinggi memacu pembentukan akar, perbandingan yang sebaliknya akan memacu pembentukan tunas. Jika perbandingan auksin sitokinin seimbang hanya terbentuk kalus.
Gambar 3. 1. Efek auksin + sitokinin (George dan Sherrington, 1984)
Ada beberapa perkecualian:
a. Proliferasi tunas aksiler pada beberapa spesies tanaman dapat dipacu dengan auksin bersama sitokinin.
b. Induksi kalus pada beberapa monokotil dapat dipacu pada medium yang ditambahkan auksin dengan konsentrasi tinggi tanpa sitokinin.
Kultur Jaringan Tanaman 38 dengan auksin konsentrasi rendah atau tanpa auksin.
Gibberelin (GA). Pada 1926 Kurasawa mendapatkan
kecambah padi yang tumbuh abnormal karena terinfeksi oleh sejenis jamur Gibberella fujikuroy. Substansi yang menyebabkan pertumbuhan seedling padi menjadi sangat cepat (abnormal) tadi diketahui sebagai gibberelic acid (GA3). GA merupakan zat pengatur tumbuh yang dalam bentuk larutan pada suhu tinggi mudah kehilangan sifatnya sebagai zat pengatur tumbuh. GA merupakan keluarga persenyawaan yang didasarkan pada struktur
entgibberellane. Ada 34 GA yang telah diidentifikasi secara kimia,
beberapa diantaranya ditemukan pada embrio dimana dapat memicu produksi alfa amilase yang dapat mengubah cadangan makanan pada biji menjadi gula sehingga dapat digunakan oleh embrio untuk pertumbuhannya. GA disintesis dari asam mevalonat pada jaringan muda dari tunas dan biji yang sedang berkecambah, ditransport di dalam xylem dan phloem. GA berpengaruh pada pertumbuhan batang, pembesaran dan pembelahan sel, induksi perkecambahan biji, produksi enzim selama perkecambahan, dan pembentukan bunga. Seperti halnya auksin, GA juga dapat memacu pembentukan akar.
George dan Sherrington (1984) mengatakan bahwa pemacuan pembentukan akar dapat terjadi karena GA dapat menyebabkan peningkatan jumlah auksin endogen pada medium kultur yang biasa digunakan adalah GA3.
Kultur Jaringan Tanaman 39 Tabel 3.1. Zat pengatur tumbuh yang umum digunakan pada
kultur jaringan
Zat Pengatur Tumbuh Singkatan Berat Molekul
Absisic acid ABA 264,3
Indole-3-acetic acid IAA 175,2
Naphthalene ecetic acid NAA 186,2
2,4-Dichlorophenoxy acetic acid 2,4-D 221,04
Indole-3-butyric acid IBA 203,2
6-Purfurylaminopurine Kinetin 215,2 6-Benzylaminopurine BA 225,2 N6-(∆2 -isopentenyl)-adenine 2iP 203,3 Trans-6-(4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl) aminopurine Zeatin 219,2
Gibberellic acid GA3 346,4
Abscisic acid (ABA). Abscisic acid adalah persenyawaan
tunggal dengan berat molekul 264,31 larut dalam NaHCO3 cair,
kloroform, aceton dan ether. ABA disintesis dari asam mevalonat
pada daun-daun tua terutama sebagai respon terhadap stres air (kekeringan). ABA ditransport dari daun melalui phloem, ABA dapat bergerak ke akar di dalam phloem dan kemudian kembali ke pucuk melalui xylem. ABA berperan pada penutupan stomata, transport fotosintat ke arah biji-biji yang sedang tumbuh. Pada kultur in vitro tumbuhan, ABA digunakan untuk menginduksi embriogenesis mikrospora, ABA juga dapat menghambat proses perkecambahan yang terlalu dini pada embrio somatik .
Ethylene. Ethylene adalah zat pengatur tumbuh yang
berbentuk gas, disintesis dari methionine di dalam berbagai jaringan tumbuhan sebagai respon terhadap stres. Pada umum-nya, gas ethylene disintesis pada jaringan-jaringan yang mengalami
Kultur Jaringan Tanaman 40 secara difusi dari tempat sintesisnya. Peranannya adalah dalam membebaskan dormansi, diferensiasi dan pertumbuhan tunas, pembentukan akar adventiv, pemasakan buah, induksi pembungaan, dan lain-lain. Ethylene jarang diper-gunakan pada kultur in vitro. Penggunaan ethylene inhibitor seperti silver nitrate atau sulfat (ZnSO4), cobalt atau nickel chloride (CoC12, NiCl2), dan asam salisilat pada medium kultur dapat meningkatkan regenerasi pucuk dan produksi embrio somatik, tetapi hasilnya sering kali kontradiktif. Ethylene dapat mempercepat perusakan sitokinin dan menstimulasi perakaran pada kultur in vitro.
Substansi organik komplek
Substansi organik komplek biasanya belum dikenal benar isi komposisinya, termasuk di dalamnya pepton, tripton, hydrolisat
casein, yeast ekstract, malt ekstract, dan bermacam-macam
tanaman seperti, air kelapa, endosperma jagung, ekstrak: pisang, tomat, kentang, jeruk, nenas dll. Substansi organik komplek ini jika digunakan terlalu tinggi dapat merugikan pertumbuhan sel. Disarankan untuk melakukan pengujian dahulu dengan interval 1-5 gL-1, untuk menetapkan pengaruhnya terhadap pertumbuhan. Jumlah air kelapa yang biasanya ditambahkan pada medium adalah 2-15 % v/v. Substansi organik kompleks ini kelemahannya tidak konsisten kadarnya dan tidak diketahui dengan pasti komposisinya. Keasaman (pH) medium
Keasaman atau pH merupakan simbol dari derajat keasaman atau kebasaan dari larutan yang ditunjukkan dengan konsentrasi ion hidrogen. pH tertentu diperlukan untuk pertumbuhan jaringan tanaman agar tidak mengganggu fungsi membran sel dan sitoplasma. pH yang diperlukan pada medium kultur biasanya berkisar antara 4,6-5,8. Pengaturan pH medium dilakukan dengan menggunakan sodium hydroxyde (1N NaOH),
Kultur Jaringan Tanaman 41 digunakan untuk menaikkan pH medium (menjadi lebih alkalin, basa) dan hydrochloric acid (1N HCl), untuk menurunkan menjadi lebih asam. pH medium harus dipertahankan konstan selama kultur berlangsung karena akan mempengaruhi ketersediaan hara yang dapat diserap oleh sel dan jaringan tanaman untuk pertumbuhannya. Ada suatu persenyawaan komplek yang mampu membuat pH suatu medium tetap pada jangkauan tertentu, misalnya besi yang berikatan dengan chelat, dan KH2PO4 juga dapat berfungsi sebagai buffer.
pH juga penting pada proses embriogenesis somatik pada kultur umbi akar wortel, stadium preglobular embrio dapat dipertahankan dan ditingkatkan jumlahnya pada medium dengan pH di bawah 4,5. Jika pH dinaikkan, embrio somatik melanjutkan pertumbuhannya melalui tahapan-tahapan yang normal seperti pada embrio zigotik, yaitu globular, jantung, torpedo dan kotiledon (atau identik dengan sistem yang berlaku pada monokotil).
Bahan Pemadat (Gelling Agent)
Gelling agent digunakan untuk untuk memadatkan
medium, bahan pemadat yang sering digunakan pada medium adalah agar (7-10 g.L-1), bahan pemadat lain (jarang digunakan) adalah gelrite, gelrite lebih bening dari agar-agar. Pemakaian
gelrite juga lebih sedikit untuk mencapai kepadatan yang sama
dengan agar, yaitu 2 gL-1. Agarose juga sering digunakan untuk kultur protoplas dan mikrospora. Penggunaan bahan pemadat ini mengandung banyak kelemahan:
a. hanya sebagian eksplan yang kontak dengan medium b. terjadi gradient nutrisi yang tidak sama
c. mobilitas hara menjadi kurang baik, dan
Kultur Jaringan Tanaman 42 3.3. Beberapa Macam Medium Dasar
Ada beberapa macam medium dasar, pada umumnya diberi nama sesuai dengan nama penemunya. Beberapa di antaranya adalah:
a. medium Murashige dan Skoog, MS (1962), medium yang paling populer digunakan untuk hampir semua macam tanaman, terutama tanaman herbaceous. Medium ini paling banyak digunakan untuk kultur kalus dan tunas, mempunyai konsentrasi garam-garam mineral yang tinggi, dan senyawa N dalam bentuk ammonium dan nitrat;
b. medium Gamborg, B5 (1968), digunakan untuk kultur suspensi sel kedelai, alfalfa dan leguminosa lain;
c. medium White, W63 (1963), merupakan medium dasar dengan konsentrasi garam-garam mineral yang rendah, digunakan untuk kultur akar;
d. medium Vacint dan Went, VW (1949), digunakan untuk kultur embrio anggrek;
e. medium Nitsch dan Nitsch, NN (1969), digunakan untuk kultur mikrospora dan kultur sel pada tembakau;
f. medium Chu, N6 (1978), digunakan untuk kultur jaringan serealia terutama padi;
g. medium Lloyd dan McCown, WPM (1980), untuk tanaman berkayu, dan
h. medium Kao dan Michayluk (1975), digunakan untuk kultur protoplas Cruciferae, Gramineae dan Leguminosae (George dan Sherrington, 1984).
Pembuatan Medium Murashige dan Skoog
Untuk membuat medium kultur jaringan, kita harus
menimbang setiap komponen bahan kimia yang tertera pada resep. Langkah ini menjadi kurang praktis, memerlukan banyak waktu dan mengurangi ketepatan. Selain itu timbangan yang digunakan
Kultur Jaringan Tanaman 43 untuk menimbang sejumlah kecil bahan kimia kadang-kadang tidak tersedia. Jalan keluar yang harus ditempuh adalah dengan membuat larutan stok, setiap larutan stok dapat dipergunakan untuk 40, 50 dan bahkan 100 liter medium.
Larutan stok dibuat menjadi beberapa kelompok: stok besi (iron), stok micronutrient, vitamin dan stok hormon. Untuk
macro-nutrient tidak dibuat stok, jadi harus ditimbang satu per satu, tetapi
jika diperlukan dapat dibuat larutan stok secara tunggal, tidak dikelompokkan menjadi satu. Hal yang perlu diperhatikan dalam pembuatan larutan stok adalah kepekatannya. Larutan yang dibuat terlalu pekat akan mengalami pengendapan sejalan dengan lama waktu penyimpanan, jika hal ini terjadi stok harus dilarutkan dengan pemanasan terlebih dahulu sebelum digunakan. Larutan stok harus disimpan dalam lemari es (kulkas). Larutan stok kadang-kadang terkontaminasi, ditumbuhi mikroorganisme, stok yang terkontaminasi tidak dapat dipergunakan lagi. Jadi kebersihan harus dijaga dan jangan membuat larutan stok terlalu banyak. Bahan dan Alat
a. Tabel formula dan bahan-bahan kimia untuk medium MS b. Akuades
c. Aluminum foil, kertas timbang, tissue, kertas label, timbangan analitik
d. Gelas piala 600 ml, 50 m1
e. Labu takar 100 ml, gelas ukur 100 m1
f. Erlenmeyer 1000 ml, 100 ml, 50 ml, atau botol kultur g. Pipet, pengaduk
h. Magnetic stirrer dengan hot plate i. pH meter
Kultur Jaringan Tanaman 44 Pembuatan Larutan Stok untuk Medium MS
a. Stok besi (IRON), dalam 200 m1 (40 ka1i konsentrasi) Prosedur kerjanya adalah sebagai berikut:
• Ditimbang 1.492 mg Na2EDTA dan 1.112 mg Fe2SO4.7H2O, kedua bahan tersebut dilarutkan dalam kira-kira 75 ml akuades secara terpisah. Larutan Na2EDTA dipanaskan sampai hampir mendidih, kemudian masukkan larutan Fe2SO4.7H2O sedikit demi sedikit sambil diaduk (dengan magnetic stirrer). Kedua 1arutan akan tercampur, bening dan berwama kuning emas, jika larutan keruh, tambahkan beberapa tetes HCl 1 N lalu dipanaskan. Biarkan dingin pada suhu kamar, tambahkan akuades sampai volume menjadi 200 ml. Masukkan dalam botol khusus berwama gelap, beri label: IRON MS 40X, 5 ml.l-1
• Simpan dalam kulkas, untuk membuat 1 liter medium MS, diperlukan 5 ml larutan stok besi.
b. Stok Hara Mikro (Micronutrient): da1am 100 ml (100 ka1i
konsentrasi)
Hara mikro diperlukan dalam jumlah sangat sedikit. Oleh karena itu stok hara mikro dibuat dalam satu wadah sebagai stok campuran.
• Ditimbang bahan-bahan kimia hara mikro dengan timbangan analitik, masing-masing:
MnSO4.H2O 2.230 mg ZnSO4.4H2O 860 mg H3BO3 620 mg KI 83 mg NaMoO4.2H2O 25 mg CuSO4.5H2O 2,5 mg CoC12.6H2O 2,5 mg
• Masukkan satu per satu bahan kimia di atas dalam gelas piala 200 ml yang berisi akuades kurang lebih 80 ml. Setiap kali memasukkan bahan kimia harus segera dilarutkan (diaduk),
Kultur Jaringan Tanaman 45 memasukkan semua bahan kimia, kemudian dilarutkan, akan terjadi presipitasi (pengendapan). Untuk melarutkan bisa dibantu dengan magnetic stirrer.
• Tambahkan akuades sampai volume menjadi 100 ml. • Masukkan dalam botol khusus, tutup yang rapat, beri label:
MIKRO MS lOOX, 1 ml.l-1
• Simpan di dalam kulkas, untuk membuat medium MS 1 liter, diperlukan 1 ml stok mikro.
c. Stok Vitamin: dalam 200 ml (50 kali konsentrasi)
Vitamin dapat dibuat dalam satu wadah sebagai stok campuran. Prosedur kerjanya adalah
• Timbang bahan-bahan di bawah ini :
Glycine 100 mg; Nicotinic acid 25 mg Pyridoxine-HCl 25 mg; Thiamine-HCl 5 mg • Larutkan satu per satu dalam gelas piala 600 ml yang berisi
akuades steril kira-kira sebanyak 150 m1.
• Tambahkan akuades steril sampai volume mencapai 200 ml • Masukan dalam botol khusus, tutup yang rapat, beri label:
VITAMIN MS. 50 X 4 ml.l-1
• Simpan di dalam kulkas, untuk membuat 1 liter medium MS, diperlukan 4 ml stok vitamin.
d. Stok Zat Pengatur Tumbuh
Zat pengatur tumbuh diperlukan dalam jumlah yang sangat terbatas. Kelarutan dari masing-masing zat pengatur tumbuh juga berbeda-beda. Biasanya stok zat pengatur tumbuh dibuat dengan kepekatan 100-500 mg l-1.
e. Stok Kinetin: 500 mg.l-1 (500 ppm)
• Timbang kinetin 50 mg, masukan dalam gelas piala 100 ml berisi akuades kira-kira 70 ml
Kultur Jaringan Tanaman 46 • Sambil diaduk, teteskan sedikit larutan HCl 1 N dan dipanaskan
sebentar sampai larutan menjadi jernih
• Setelah dingin, masukkan ke dalam labu takar 100 ml; tambahkan akuades sampai volume menjadi 100 ml.
• Pindahkan dalam erlenmeyer 100 ml atau wadah lain yang bersih, tutup rapat, beri label: KINETIN 500 ppm
• Simpan di dalam kulkas.
f. Stok IAA; NAA; 2,4-D; IBA: 500 mg.l-1 (500 ppm)
• Timbang bahan sebanyak 50 mg, tuangkan masing-masing bahan dalam gelas piala 100 ml yang berisi akuades kira-kira 70 ml.
• Sambil diaduk teteskan sedikit demi sedikit larutan KOH 1 N dengan hati-hati sampai larut benar (jernih).
• Pindahkan ke dalam labu takar 100 ml, tambahkan akuades sampai volume menjadi 100 ml.
• Pindahkan ke dalam wadah stok, tutup yang rapat, beri label:
IAA 500 ppm 2,4-D 500 ppm NAA 500 ppm IBA 500 ppm
• Simpan di dalam lemari es.
g. Myo-Inositol dan Sukrosa
Karena jumlahnya cukup banyak, tidak dibuat stok, keduanya harus ditimbang setiap kali membuat medium.
Pembuatan Medium MS Padat Sebanyak 1 Liter
• Siapkan erlenmeyer 1000 ml yang berisi 500 ml akuades
• Timbang setiap komponen bahan kimia makronutrien (sesuai dengan tabel), larutkan satu per satu, untuk mempercepat kelarutan dapat dibantu dengan magnetic stirrer.
• Masukan 5 ml larutan stok IRON
• Masukan 1 ml larutan stok MICRONUTRIENT • Masukan 4 ml larutan stok VITAMINE
Kultur Jaringan Tanaman 47 • Masukan zat pengatur tumbuh (sesuai kebutuhan)
• Timbang 100 mg Myo-Inositol, masukan ke dalam erlenmeyer dan larutkan
• Timbang 30 g sukrosa, masukan ke dalam erlenmeyer dan larutkan.
• Tambahkan akuades sampai volume mencapai 1000 ml
• Ukur pH menjadi 5,6-5,8 menggunakan HCl 1 N atau KOH 1 N. • Timbang 8 g agar (pemadat), masukan ke dalam erlenmeyer,
panaskan (sambil diaduk) sampai (pemadat) larut.
• Dalam (pemadat) keadaan masih cair, bagilah medium ke dalam botol kultur kira-kira 40 ml botol-1.
• Tutup rapat dengan aluminium foil dan beri label sesuai dengan perlakuan;
• Masukkan ke dalam autoclave dan sterilisasi pada suhu 121o
C selama 15 menit dengan tekanan 15 psi;
• Setelah tekanan turun hinga nol (0), medium yang sudah steril segera dikeluarkan dari autoclave, jangan menunggu sampai dingin di dalam autolave, dan
• Medium yang sudah steril disimpan di dalam ruang penyimpanan.