Teknik Aseptis
4.1. Sterilisasi Ruang Kerja, Medium, Alat -alat dan Eksplan Sebagaimana telah diuraikan pada bahasan Laboratorium
Kultur Jaringan Tumbuhan, kegiatan aseptis dimulai di dalam ruang steril dan ruang inkubasi/kultur, kegiatan utama yang dilakukan meliputi sterilisasi dan penanaman eksplan di atas atau
Kultur Jaringan Tanaman 50 di dalam medium kultur. Laboratorium sederhana setidaknya mempunyai dua ruangan tersebut, yang kebersihannya senantiasa harus diperhatikan. Ruang kerja yang kotor, akibat terlalu banyak orang yang lalu lalang di dalamnya, dapat mengundang timbulnya kontaminasi. Ruang kultur yang tidak terpelihara dapat mengundang serangga-serangga kecil untuk masuk ke dalam botol-botol yang berisi medium kultur.
Serangga-serangga kecil ini menimbulkan permasalahan tersendiri karena spora, jamur, dan bakteri biasanya ikut terbawa masuk ke dalam botol kultur. Ruang kerja harus mudah dibersihkan dan dilengkapi dengan AC sehingga senantiasa kering dan sejuk. Kegiatan sterilisasi medium dan alat-alat dikerjakan di ruang persiapan. Kebersihan dan organisasi laboratorium yang efisien, ditunjang dengan peralatan yang memadai, dapat menciptakan kondisi aseptis yang terkendali.
a. Sterilisasi ruang kerja
Ruang kerja yang digunakan untuk pekerjaan aseptis adalah ruang steril. Ruangan ini harus senantiasa bersih, dinding dan lantai dibersihkan setiap pagi dengan zat anti kuman/desinfektan. Udara di dalam ruangan disterilisasi dengan lampu Ultra Violet (UV) yang kekuatannya disesuaikan dengan besarnya ruangan yang dipakai. Lampu ini hanya dinyalakan jika ruangan tidak dipakai dan harus dimatikan ketika digunakan untuk bekerja. Radiasi UV tidak berbahaya bagi manusia karena tidak mengion, namun demikian harus diwaspadai karena dapat mengubah DNA dengan pembentukan dimer antara dua basa timin pada satu rantai DNA. Penetrasi sinar UV utamanya pada bagian superfisial dari jaringan sehingga dapat melukai kulit dan retina mata. Sinar UV dapat menghasilkan ozon sehingga peneliti yang akan bekerja harus menunggu 15-30 menit setelah UV dimatikan, maksudnya supaya ozon tidak terhirup.
Kultur Jaringan Tanaman 51 Peneliti yang akan bekerja di dalam ruangan ini harus memakai jas laboratorium, masker dan tutup kepala, juga harus mencuci tangan dengan sabun antiseptik, kalau perlu menggunakan sarung tangan dari karet. Di dalam ruangan ini terdapat alat-alat yang dapat menciptakan kondisi aseptis yang terkendali, antara lain Laminar Air Flow Cabinet (LAFC) dan
sterile box (entkas).
Laminar air flow cabinet. Alat ini sangat baik dan efisien,
namun harganya relatif mahal untuk menciptakan atmosfir yang steril untuk pekerjaan-pekerjaan aseptis. Prinsip kerja alat ini yaitu dengan hembusan udara yang sudah disaring (Gambar 4.1).
Gambar 4.1. Laminar air flow cabinet (LAFC).
Udara yang dihisap oleh blower dihembuskan melalui HEPA (high efficiency particulate air) filter dengan porositas 0,22 μm, spora-spora jamur dan bakteri akan tertahan, sehingga udara yang berhembus keluar sudah suci hama, LAFC kadang-kadang
Kultur Jaringan Tanaman 52 dilengkapi dengan UV. Sebelum mulai bekerja, permukaan meja kerja LAFC disemprot dan dilap dengan kain yang telah dibasahi alkohol 70% atau spiritus, semua alat-alat dimasukkan ke dalam ruang kerja.
Alat-alat dan medium harus sudah steril baik permukaan maupun bagian dalamnya, untuk botol kultur yang berisi medium, permukaannya disemprot atau dilap dengan alkohol 70%. Untuk LAFC yang dilengkapi dengan UV, sebelum bekerja lampu UV dinyalakan selama 30-60 menit untuk mematikan kontaminan pada permukaan ruang kerja. Di dalam LAFC juga sering dilengkapi dengan instalasi gas yang diperlukan untuk sterilisasi alat-alat dengan pembakaran, tetapi ini dapat diganti dengan lampu spiritus atau bactisinerator.
Sterile box (entkas). Alat lain untuk dapat menciptakan
ruang kerja yang steril dengan harga yang relatif murah adalah
sterile box (entkas). Alat ini berwujud seperti kotak yang terbuat
dari bahan kaca (Gambar 4.2.), plywood, papan kayu atau yang lebih sederhana misal-nya dari kardus yang di dalamnya dilapisi aluminum foil. Steril box atau entkas dapat dibuat dengan ukuran sesuai dengan yang dikehendaki. Hal yang penting untuk diperhatikan adalah tangan kita dapat menjangkau setiap dinding entkas karena akan memudahkan untuk membersihkannya.
Kultur Jaringan Tanaman 53 Gambar 4.2. Skema Sterile box (entkas) yang terbuat dari bahan
Kultur Jaringan Tanaman 54 Sebelum mulai bekerja, dinding entkas dibersihkan lebih dahulu dengan menggunakan kain yang sudah dibasahi alkohol 70%. Ruang kerja di dalam entkas disterilisasi dengan formalin
tablet yang ditaruh di dalam cawan porselin kecil dan diletakkan di
sudut-sudut ruangan entkas, setiap cawan berisi satu tablet. Uap formalin ini dapat mensterilkan udara yang terdapat di dalam entkas. Alat-alat dan botol kultur yang berisi medium disemprot permukaannya satu per satu dengan alkohol 70% kemudian dimasukkan ke dalam entkas, dibiarkan 30 menit baru mulai bekerja. Pada entkas juga dapat ditambahkan lampu UV, entkas ini seluruh dinding luarnya harus ditutup dengan aluminum foil, hal ini diperlukan untuk menghindari mata dan kulit dari bahaya radiasi UV.
b. Sterilisasi medium dan alat-alat
Media yang mengandung bahan-bahan yang tahan panas, sterilisasinya dilakukan dengan pemanasan basah, menggunakan alat yang namanya autoclave, bekerjanya dengan tekanan uap. Standar teknis untuk sterilisasi ini adalah pada temperatur 121oC, tekanan antara 15-17 psi dengan waktu antara 15-40 menit, bergantung dari banyaknya media yang disterilisasi. Untuk 15 ml media dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 75 ml, sterilisasi dilakukan dengan tekanan 15 psi selama 20 menit. Volume yang lebih besar membutuhkan tekanan yang lebih tinggi dengan waktu yang lebih lama.
Autoclave yang digunakan ada bermacam-macam, mulai
dari yang paling sederhana sampai yang dapat diprogram
(programmable). Autoclave sederhana pemanasan airnya
menggunakan kompor gas, sedangkan pengaturan suhu tekanan dan waktunya dilakukan secara manual. Pada waktu mengoperasikan autoclave ini, jangan tergesa-gesa menutup klep pembuang sebelum udara yang ada di dalam autoclave diganti
Kultur Jaringan Tanaman 55 seluruhnya oleh uap air yang mendidih sehingga akan tercapai temperatur 121°C (langkah ini tidak dikerjakan untuk autoclave yang programmable).
Setelah waktu sterilisasi selesai (15-20 menit), klep-klep pembuang dibuka pelan-pelan, tekanan uap di dalam autoclave pelan-pelan akan sama dengan tekanan atmosfir, pembukaan klep pembuang yang tergesa-gesa akan mengakibatkan medium yang ada di dalam botol kultur mendidih dan meluap. Alat lain yang mempunyai prinsip kerja mirip dengan autoclave adalah (pressure
cooker), alat yang biasa digunakan untuk memasak di dapur ini
kapasitasnya sangat terbatas, sehingga tidak dianjurkan untuk pekerjaan pada skala laboratorium karena tidak efisien. Autoclave yang paling modern adalah yang programmable, dapat diatur waktu, suhu dan tekanannya secara automatis sehingga dapat dijalankan sambil mengerjakan pekerjaan yang lain.
Tabel 4.1. Lama waktu minimal untuk sterilisasi media Volume Setiap
Wadah (ml)
Waktu Minimal Sterilisasi pada Suhu 121oC (Menit) 25 – 50 75 250 – 500 1.000 1.500 2.000 15 20 25 30 35 40 Sumber: Indrianto, 2003.
Sterilisasi medium kultur dengan menggunakan autoclave mempunyai banyak kelemahan, antara lain:
sukrosa akan terurai menjadi fruktosa dan glukosa;
penggunaan temperatur yang tinggi pada autoclave dapat mengakibatkan terbentuknya caramel gula yang berwarna
Kultur Jaringan Tanaman 56 coklat, merupakan racun di dalam medium kultur;
sejalan dengan lamanya waktu sterilisasi, pH medium dapat mengalami perubahan, terjadi pengendapan garam-garam dan depolimerisasi agar.
Beberapa komponen medium ada yang tidak stabil kalau kena panas yang tinggi, misalnya GA3, Ca-panthothenate dan
Thiamin-HCl harus disterilisasi dengan ultrafiltrasi (Millipore filter) pada suhu ruangan (25oC). Dengan memakai ultrafiltrasi larutan yang berisi bahan-bahan yang termolabil, dimasukkan ke dalam medium kultur yang telah steril. Langkah ini dikerjakan di dalam ruang steril (LAFC) ketika medium agar telah agak dingin tetapi belum memadat. Ada beberapa macam millipore filter yaitu yang terbuat dari polyethylene film sekali pakai (disposable), dan ada millipore filter yang dilengkapi dengan holder, filter holder ini dapat disterilisasi dengan autoclave (autoclavable). Porositas dari filternya juga bermacam-macam, mulai dari 0,22 hingga 0,45 μm. Untuk larutan termolabil dalam jumlah sedikit (5-50 ml) dengan mudah dapat disterilisasi dengan Millipore filter yang dipasang pada ujung syrink (alat suntik). Dalam jumlah besar (50-5000 liter) sterilisasi dengan ultrafiltrasi ini harus dibantu dengan pompa vakum.
Alat-alat yang digunakan di dalam ruang steril antara lain:
scalpel, pinset bermacam-macam ukuran, petridish, cork borrer,
pipet, alat-alat gelas (botol kultur dsb.), gunting, kertas saring. Alat-alat tersebut, sebelum disterilisasi, dibersihkan terlebih dahulu kemudian dibungkus rapi dengan kertas coklat. Alat-alat yang akan disterilisasi dengan autoclave tidak boleh dibungkus dengan aluminum foil sebab uap air tidak dapat masuk ke dalam bungkusan. Untuk botol kultur, sebelumnya harus dicuci kemudian ditutup dengan aluminum foil atau bahan lain yang terbuat dari karet, kain atau plastik yang tahan panas. Botol kultur dengan penutup yang berulir, tidak boleh ditutup terlalu rapat ketika
Kultur Jaringan Tanaman 57 disterilisasi, ini diperlukan agar tidak terjadi perbedaan tekanan dengan ruangan di dalam autoclave, perbedaan tekanan akan mengakibatkan pecahnya botol kultur.
c. Sterilisasi eksplan
Eksplan (explant) adalah bagian kecil dari tanaman baik itu sel, jaringan, ataupun organ yang digunakan untuk memulai suatu kultur. Eksplan yang digunakan di dalam kultur jaringan harus yang masih muda (primordium), sel-selnya masih bersifat meristematik. Sel-sel yang bersifat meristematik dicirikan dengan sifatnya yang selalu membelah, selnya berukuran kecil tetapi inti selnya relatif besar, penuh plasma, vacuola kecil-kecil, dinding sel tipis terdiri dari dinding primitif yang berupa selulosa mikrofibril. Bagian tanaman yang bersifat meristematik antara lain terdapat pada ujung (kuncup) batang atau akar, dikenal dengan nama meristem apikal, pada batang disebut shoot apical meristem sedangkan meristem yang terdapat pada kuncup di ketiak daun disebut meristem aksiler atau bud primordium (Gambar 4.3).
Gambar 4.3. Tanam dikotil dengan kuncup apikal dan aksilar dimana di dalamnya terdapat sel-sel yang meristematik (Dermen and Stewart, 1973).
Kultur Jaringan Tanaman 58 Bagian tanaman yang bersifat meristematik seringkali terdapat dalam keadaan terbuka sehingga kotoran dan berbagai kontaminan seringkali menempel pada bagian permukaannya. Kontaminan ini dapat berupa bakteri, jamur dan spora-sporanya, serangga dan telur-telurnya, protozoa, dan sebagainya. Keadaan ini terutama dijumpai pada tanaman donor yang tumbuh di lapangan.
Kultur jaringan mensyaratkan kondisi aseptis yang terkendali, jika kontaminan ini tidak dihilangkan maka medium yang mengandung banyak nutrisi akan dengan cepat dipenuhi oleh mikrobia kontaminan tersebut. Untuk mengurangi adanya kontaminan pada permukaan eksplan, tanaman donor sebaiknya ditanam di dalam rumah kaca. Pada beberapa jenis tanaman seperti ketimun dan umbi akar wortel, seringkali dijumpai adanya kontaminan internal yang terdapat di dalam jaringan tanaman. Kontaminan internal ini sangat sulit untuk diatasi, karena sterilisasi permukaan tidak akan efektif.
Eksplan yang digunakan ukurannya sangat bervariasi dari yang hanya dapat dilihat dengan mikroskop (mikroskopis) misalnya mikrospora, shoot apical meristem, embrio dan sebagainya, sampai yang berukuran 1 cm atau lebih: misalnya, ruas batang, daun, hipokotil, biji, rhizom dan sebagainya. Bagian-bagian tanaman tersebut seringkali masih tertutup oleh jaringan/ sarung-sarung daun, misalnya pada daun tebu, hal ini akan memudahkan prosedur sterilisasi karena secara alamiah bagian daun yang ada di dalamnya masih suci hama. Eksplan yang berukuran terlalu besar akan membawa resiko kontaminasi yang lebih besar, namun jika digunakan eksplan yang terlalu kecil pertumbuhan dan respon yang diharapkan juga tidak sebaik jika menggunakan eksplan yang berukuran besar. Dilemma ini menyebabkan tidak adanya metoda sterilisasi eksplan yang baku untuk semua tanaman. Hal penting yang harus diperhatikan pada sterilisasi eksplan adalah bahwa eksplan dan mikrobia kontaminan
Kultur Jaringan Tanaman 59 keduanya adalah jasad hidup, kontaminasi harus dihilangkan tanpa mematikan eksplan.
Bahan pensteril yang umum digunakan untuk sterilisasi eksplan adalah calcium hypochlorite, sodium hypochlorite, sublimat/mercuric chloride (HgCl), alkohol, dan sebagainya. Konsentrasi dan lama waktu sterilisasi sangat bervariasi bergantung dari jenis eksplan dan tempat tumbuhnya. Eksplan yang ditumbuhkan dalam rumah kaca relatif lebih bersih, sedangkan yang berasal dari lapangan pada umumnya lebih kotor, lebih terkontaminasi sejak dari awalnya sehingga prosedur sterilisasi harus dibuat lebih keras dengan meningkatkan konsentrasi bahan pensteril atau dengan memperpanjang waktu sterilisasi.
Semua bahan-bahan pensteril adalah toksik terhadap eksplan, sehingga perlu dilakukan pencucian yang berulang-ulang agar semua bahan pensteril yang menempel dapat tercuci. Untuk meningkatkan penetrasi bahan pensteril, seringkali ditambahkan 1 atau 2 tetes agensia pembasah (Triton-X, Tween 20 atau Tween 80) yang fungsinya menambah tegangan pada permukaan eksplan. Penggunaan pompa vakum juga dapat meningkatkan penetrasi bahan pensteril pada permukaan jaringan sehingga dapat meningkatkan efisiensi sterilisasi.
Prasterilisasi dengan mencuci eksplan menggunakan sabun/detergent dan dibiarkan beberapa saat di bawah pancuran air yang mengalir selama 15-30 menit juga diperlukan untuk memecah koloni kontaminan agar lebih peka terhadap bahan pensteri1. Bahan yang sudah bersih dikecilkan ukurannya kemudian dibawa ke dalam ruang steril untuk disterilisasi lebih lanjut. Untuk sterilisasi eksplan kadang-kadang digunakan dua atau lebih bahan pensteril, misalnya direndam di dalam larutan
sodium hypochlorite kemudian dicuci dengan air steril dilanjutkan
Kultur Jaringan Tanaman 60 dengan air steril.
Tabel 4.2. Efektifitas beberapa bahan pensteril (Yeoman dan McLeod (1977) dalam Bhojwani dan Razdan, 1983) Agen Pensteril Konsentrasi Lama
(menit) Efektifitas Calcium hypochlorite Sodium hypochlorite Hydrogen peroxide Bromine water Silver nitrate Mercuric chloride Antibiotics 9 – 10 % 2 % 10 – 12 % 1 – 2 % 1 % 0,1 – 1 % 4 – 50 mgL-1 5 – 30 5 – 30 5 – 15 2 – 10 5 – 30 2 – 10 30 – 60 Sangat bagus Sangat bagus Bagus Sangat bagus Bagus Memuaskan Cukup bagus Untuk eksplan yang berdaging (umbi kentang, wortel), eksplan yang tertutup sarung daun (pucuk tebu), dan biji muda yang masih terdapat di dalam buah (anggrek) dapat disterilisasi dengan merendam di dalam alkohol beberapa saat, kemudian dilewatkan di atas nyala api dan dibiarkan sampai nyala api padam, cukup efektif untuk membawa kultur bebas dari kontaminasi.
Kultur Jaringan Tanaman 61