Organisasi dan Fasilitas Laboratorium
Kultur Jaringan Tanaman
Teknik kultur jaringan (kultur in vitro) mensyaratkan kondisi steril, baik ruang, peralatan, bahan, maupun seluruh rangkaian kerjanya. Hal ini disebabkan karena pertumbuhan eksplan di dalam kultur harus selalu dalam kondisi aseptis. Untuk itu, semua tahapan pelaksanaan teknik kultur in vitro harus dilaksanakan di dalam laboratorium yang harus ditunjang oleh organisasi dan perlengkapan laboratorium yang memadai serta tata cara kerja yang teliti dari si peneliti.
Laboratorium tidak harus dibangun baru, ruang-ruang di dalam laboratorium yang sudah ada dapat direnovasi untuk keperluan kultur jaringan. Namun demikian pendirian laboratorium baru merupakan langkah yang terbaik. Laboratorium sebaiknya mempunyai pembagian ruangan yang diatur sedemikian rupa sehingga tiap kegiatan terpisah satu dengan yang lainnya, tetapi masih dapat saling berhubungan dan mudah dicapai. Dalam bagian ini akan diuraikan skema umum laboratorium kultur jaringan, prinsip dan fungsi ruang, serta peralatan yang ada di dalamnya. 2.1. Laboratorium Kultur Jaringan
Laboratorium yang baik untuk pekerjaan teknik kultur jaringan harus memenuhi kriteria: aman, bersih, dan memiliki organisasi dan penataan ruang yang sesuai. Lokasi dari laboratorium itu sendiri sebaiknya jauh dari sumber yang sering menimbulkan polusi. Kondisi bagian dalam laboratorium seperti lantai, dinding, meja, alat-alat yang digunakan, dan udara di
Kultur Jaringan Tanaman 18 ruangan laboratorium mutlak bersih. Diusahakan agar bebas dari debu, karena debu adalah sumber kontaminan yang paling potensial.
Selain itu, yang tidak menguntungkan adalah bahwa negara kita terletak di daerah beriklim tropis, debu-debu begitu banyak mendominasi ruangan udara di sekitar kita sehingga sulit untuk dihindari. Oleh karena itu sebagai upaya pembuatan laboratorium bebas debu, kita harus merancang laboratorium yang tertutup rapat tanpa ada ventilasi. Jendela-jendela dibuat permanen dari kaca (tidak bisa dibuka).
Di dalam ruangan, diberi pengatur udara (Air Conditioner,
AC) untuk mempertahankan suhunya konstan 25-28oC, dan
sebaiknya dipasang exhauster untuk menyedot debu yang ada di dalam ruangan. Lantai laboratorium juga harus dibersihkan secara rutin dengan antiseptik, meja dan dinding juga harus dibersihkan dengan larutan antiseptik. Umumnya permukaan meja dan dinding dilapisi dengan porselin supaya kedap air dan mudah dibersihkan. Ruangan di dalam laboratorium harus dijaga tetap bersih dan bebas dari debu, hewan kecil dan serangga.
Setiap orang yang akan masuk laboratorium harus melepas sepatunya dan menggantinya dengan alas kaki yang ada di dalam laboratorium serta harus mengenakan jas praktikum. Kebersihan laboratorium secara umum sangat menentukan keberhasilan kerja kultur jaringan. Sarana dasar seperti aliran listrik, air yang cukup dan gas harus dimiliki.
Pelaksanaan kerja kultur jaringan tumbuhan memiliki tahapan-tahapan dan urutan kerja yang khusus. Oleh karena itu laboratorium harus diatur sedemikian rupa sehingga ada tingkatan sterilitas ruangan sesuai dengan tahapan kerja tadi, termasuk alur keluar-masuknya pekerja di dalam laboratorium tersebut. Tahapan-tahapan kerja di dalam laboratorium kultur jaringan dibagi dalam empat kelompok yaitu:
Kultur Jaringan Tanaman 19 a. Persiapan
Merupakan tahap awal kerja kultur jaringan, dimulai dari penyiapan tanaman sebagai sumber eksplan yang ditanam di green
house, kemudian menyiapkan alat-alat, botol-botol kultur dan
pembuatan medium (meracik, merebus dan membaginya ke dalam botol-botol sampai pada sterilisasi).
b. Inokulasi
Inokulasi meliputi sterilisasi, pengambilan/pengirisan bagian tanaman yang akan dijadikan sebagai eksplan, kemudian menanamnya di dalam atau di atas medium buatan yang telah disediakan. Untuk inokulasi eksplan ini diperlukan kondisi yang absolut steril.
c. Pemeliharaan
Setelah diinokulasi, botol kultur diletakkan di rak-rak pemeliharaan di ruang inkubator untuk diikuti pertumbuhan dan perkembangannya sampai menjadi plantlet. Untuk pemeliharaan tersebut dibutuhkan ruang yang tidak perlu steril tetapi harus bersih, dengan pengatur suhu 25-28oC, dan pencahayaan dengan lampu neon (Tube Lamp, TL), 1000-3000 lux.
d. Aklimatisasi
Aklimatisasi merupakan proses penyesuaian/adaptasi
plantlet dari kondisi heterotrof di dalam botol kultur ke kondisi
autotrof yang dapat ditanam pada kondisi alamiahnya di tanah. Proses aklimatisasi dilaksanakan di dalam green house dengan memberikan perlakuan kelembaban, intensitas cahaya dan temperatur. Setelah melampaui masa aklimatisasi, tanaman dapat dibawa keluar dari green house untuk ditanam di lapangan.
Masing-masing tahapan pekerjaan tersebut harus terpisah satu dengan lainnya dan dengan menggunakan peralatan tersendiri. Berdasarkan adanya urutan tahapan kerja seperti tersebut di atas,
Kultur Jaringan Tanaman 20 maka dasar penataan ruang laboratorium adalah urutan kegiatan dan sterilitas ruangan. Oleh karena itu pembagian ruangan laboratorium yang baik meliputi: (1) ruang persiapan, (2) ruang transfer (inokulasi) atau ruang steril, (3) ruang kultur (inkubator dan ruang plantlet), dan (4) ruang aklimatisasi (Gambar 2.1). (1) Ruang persiapan
Ruangan persiapan dipergunakan sebagai tempat untuk mempersiapkan eksplan, medium dan alat-alat. Ruang persiapan biasanya dibagi menjadi beberapa ruangan kecil yang dipergunakan untuk menyimpan medium dan alat-alat yang sudah steril, untuk menyimpan alat-alat gelas, bahan-bahan kimia dan pembuatan medium (ruang timbang), dan ruangan untuk mencuci. Persiapan eksplan yang dilakukan meliputi pencucian, dan pemotongan/pembuangan bagian-bagian tanaman yang tidak dipergunakan, serta perlakuan awal untuk mengurangi kontaminan yang ada di permukaan tanaman. Persiapan medium meliputi penimbangan bahan kimia medium, pengenceran medium, penuangan ke dalam wadah kultur dan sterilisasi. Sesuai dengan fungsinya, fasilitas yang dibutuhkan di dalam ruangan ini adalah meja tempat meletakkan alat-alat pemanas, meja untuk alat-alat timbang, meja untuk bekerja dan tempat mencuci, semua meja adalah statis dari beton dan beralas porselin.
Peralatan yang diletakkan di dalam ruangan ini terdiri dari: (1) oven, (2) magnetic stirrer dengan atau tanpa pemanas, (3) alat-alat gelas standar: labu takar berbagai ukuran pipet pasteur, (4)
erlenmeyer berbagai ukuran, gelas piala pengaduk gelas wadah
kultur: botol, tabung reaksi, cawan petri, (5) lemari alat-alat gelas, (6) alat-alat untuk mencuci, (7) rak-rak pengering, (8) alat-alat diseksi: spatula, pisau, scalpel, pinset, gunting, cutter, (9) borrer berbagai ukuran, (10) blender, (11) bidistilling water, (12) agarose
dispenser, (13) kompor gas, (14) autoclave, (15) lampu bunsen
Kultur Jaringan Tanaman 21 dan media ke ruang lain, dan (17) growth chamber, untuk praper-lakuan dingin pada tanaman berbunga, khususnya yang akan dipergunakan untuk kultur mikrospora.
Gambar 2.1. Penataan Ruangan Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman
(2) Ruang timbang
Ruangan ini dipergunakan untuk tempat menyimpan bahan-bahan kimia medium dan mempersiapkan medium kultur. Persiapan medium kultur meliputi penimbangan bahan kimia medium, pengenceran larutan stok, membagi-bagi dalam botol kultur dan sterilisasi. Ruang timbang berhubungan langsung dengan ruang persiapan. Fasilitas yang diperlukan dalam ruangan ini adalah meja kerja dan meja untuk alat-alat timbang beralas porselin. Peralatan yang diletakkan di ruangan ini terdiri dari: (1) timbangan analitik, (2) lemari es dan freezer untuk menyimpan
Kultur Jaringan Tanaman 22 larutan stok, (3) hot plate dengan magnetic stirrer, (4) bunsen dengan kaki tiga, (5) pH meter, (6) lemari bahan kimia dan alat-alat (aluminum foil, kertas timbang, kertas saring, dsb.), (7) hood tempat penimbangan bahan-bahan kimia yang karsinogenik, dan (8) blender/homogenizer.
(3) Ruang stok
Ruang stok dipergunakan untuk menyimpan alat-alat steril dan medium yang sudah jadi (steril). Di dalam pelaksanaan teknik kultur jaringan, sebelum penanaman eksplan maupun sub-kultur dilakukan, medium kultur harus sudah disiapkan minimum tiga hari sebelum diperlukan. Medium yang sudah jadi harus disimpan di dalam ruangan yang dingin dan gelap. Fasilitas yang diperlukan di ruangan ini berupa meja kerja beralas porselin. Ruang stok harus berhubungan langsung dua arah, satu arah dengan ruang persiapan (setelah media disterilisasi di ruang persiapan, dapat langsung dibawa ke ruangan ini), dan arah yang lain dengan ruang transfer atau ruang steril, ruangan ini meskipun tidak harus steril tetapi kebersihannya harus tetap terjaga.
Alat-alat yang terdapat di ruangan ini meliputi: (1) kereta dorong, (2) rak-rak untuk meletakkan medium steril, dan (3) oven untuk menyimpan alat-alat steril.
(4) Ruang steril/transfer
Ruang transfer merupakan ruangan dimana semua kegiatan aseptis dimulai. Kegiatan yang dilakukan meliputi: sterilisasi, isolasi bagian-bagian tanaman dan penanaman eksplan dalam medium. Kegiatan subkultur, sterilisasi medium dengan ultra-filtrasi juga dilakukan di ruangan ini. Ruangan ini mutlak steril, sehingga sedapat mungkin bebas dari debu dan hewan kecil, dinding ruangan dilapis porselin atau bahan lain yang kedap air dan mudah dibersihkan. Ruangan ini juga dilengkapi dengan tempat cuci tangan sehingga memudahkan petugas yang akan
Kultur Jaringan Tanaman 23 memulai dengan pekerjaan aseptis, pengatur suhu (AC), lampu
ultra violet dan lampu TL biasa. Ruang transfer harus terisolasikan
sedemikian rupa tetapi masih dapat berhubungan dengan ruang stok, ruang inkubasi, dan ruang mikroskop. Pintu penghubung harus selalu dalam keadaan tertutup.
Ruang transfer dilengkapi dengan alat-alat sebagai berikut: (1) laminar air flow cabinet (LAFC), peralatan utama untuk melakukan pekerjaan aseptis, (2) dissecting microscope, (3) cart yang selalu disemprot dengan alkohol 70%, (4) alat-alat diseksi:
scalpel, pinset, spatula, gunting, jarum, (5) millipore filter, (6) syrink, (7) hand sprayer untuk alkohol, (8) tempat alkohol, (9)
bunsen burner/lampu alkohol/bacticinerator, (10) entkas, (11) timbangan kecil, (12) electrofusion chamber, (13) vacum pump, dan (14) centrifuge, untuk proses isolasi mikrospora dan protoplas. (5) Ruang inkubasi/kultur
Ruang kultur merupakan ruang besar dengan kemungkinan perluasan bila diperlukan. Kebersihannya harus diperhatikan dan sedapat mungkin dihindari terlalu banyak keluar-masuknya orang-orang yang tidak berkepentingan. Ruangan ini dipergunakan untuk memelihara eksplan yang telah ditanam pada medium secara aseptis. Kultur yang telah tumbuh dan memperbanyak diri, secara terarur harus disubkultur, tergantung dari jenis eksplan dan tipe kultur. Subkultur dilakukan setiap 3-6 minggu sekali, hal ini berarti tiap bulan ada pelipatan jumlah kultur.
Botol-botol kultur diatur dengan menempatkannya pada rak-rak terbuka yang bertingkat (3-4 tingkat) dengan lampu
fluorescent, jarak tiap tingkat 40-50 cm. Jarak antara rak harus
diatur sedemikian rupa sehingga memudahkan lalulintas pemeriksa kultur. Di dalam ruang kultur, lingkungan fisik diatur sedemikian rupa sehingga mendukung pertumbuhan yang optimal. Untuk itu perlu ada pengaturan terhadap suhu dan cahaya. Unsur-unsur dari
Kultur Jaringan Tanaman 24 cahaya yang perlu diperhatikan adalah kualitas, lama penyinaran, dan intensitas cahaya.
Kualitas cahaya. Cahaya putih merupakan cahaya yang
baik untuk pertumbuhan kultur. Lampu fluorescent (TL) biasa digunakan sebagai sumber cahaya dalam ruang kultur. Keseimbangan spektrum lampu fluorescent sangat baik dan efisien dalam penggunaan energi bila dibandingkan dengan lampu pijar. Bentuk lampu memungkinkan penyebaran cahaya yang baik, dengan panas yang dikeluarkan relatif rendah, bila transformer dapat diletakkan di luar ruang kultur. Pada lampu pijar hampir 90% merupakan enersi panas sehingga mempengaruhi suhu ruangan. Pada ruang kultur juga dapat diberikan campuran lampu pijar dan f1uorescent secara bersamaan.
Intensitas cahaya. Intensitas cahaya yang baik dari lampu
fluorescent adalah antara 100-400 foot candle (l000-4000 lux).
Intensitas cahaya diatur dengan menempatkan sejumlah lampu dengan kekuatan tertentu pada jarak antara 40-50 cm dari tabung kultur pada luas area tertentu.
Lama penyinaran. Seberapa lama cahaya harus diberikan
pada eksplan sehingga berpengaruh positif terhadap
pertumbuhannya, sangat tergantung dari jenis tanaman dan respon yang diinginkan. Untuk proses morfogenesis, umumnya diperlukan pencahayaan terus menerus, sebaliknya untuk induksi kalus umumnya tidak memerlukan pencahayaan. Untuk pertumbuhan
plantlet, yang segera akan dilakukan aklimatisasi, umumnya
memerlukan periode penyinaran selama 14-16 jam. Panjang penyinaran diatur dengan alat automatic timer switch atau timer.
Suhu. Suhu di dalam ruang kultur yang baik adalah pada
suhu normal yaitu antara 25-28°C. Pengaturan suhu dilakukan dengan menggunakan AC, karena ruang kultur merupakan ruang tertutup yang sedikit sekali mempunyai aliran udara bebas. Beberapa perlakuan khusus kadang-kadang memerlukan suhu
Kultur Jaringan Tanaman 25 rendah (18-20°C), sehingga diperlukan adanya growth chamber yang dapat diatur suhu dan pencahayaannya.
Alat-alat yang diperlukan di dalam ruang kultur adalah: (1) rak-rak kultur 3-4 tingkat dengan lampu fluorescent, jarak tiap tingkat 40-50 cm, (2) timer untuk mengatur lama penyi-naran, (3) AC untuk mengontrol suhu ruangan, (4) binocular microscope dan
loupe/kaca pembesar, (5) tangga aluminium untuk melihat kultur
di rak yang tinggi, (6) shaker, untuk inkubasi kultur dengan medium cair.
(6) Ruang mikroskop
Ruangan ini dipergunakan untuk pengamatan dan analisa selama kultur berjalan, reaksi suatu kultur dalam media perlakuan sering diikuti sejak awal inisiasi. Untuk membedakan morfologi eksplan atau struktur internal pada kultur mikrospora, sel dan protoplas yang terjadi pada awal perkembangannya, diperlukan bantuan mikroskop. Untuk keperluan tersebut dipergunakan
binocular microscope (stereoscope), inverted microscope, fluorescent microscope, yang dilengkapi dengan peralatan untuk
fotografi. Penelitian-penelitian yang lebih canggih seperti fusi protoplas, microinjection DNA atau organel ke dalam sel atau protoplas, memerlukan mikroskop dengan mikro manipulator. Ruangan ini harus senantiasa kering/tidak lembab dan bersih, untuk pengoperasian fluorescent microscope, diperlukan ruangan yang gelap total. Meja dari beton untuk tempat meletakkan mikroskop diperlukan di dalam ruangan ini.
Alat-alat yang terdapat di dalam ruangan ini adalah: (1)
inverted microscope, (2) stereoscope, (3) student microscope, (4) fluorescent microscope, (5) micromanipulator, (6) alat-alat
fotografi, dan (7) alat-alat untuk pengamatan sitologis, misalnya gelas preparat dan penutup, jarum, microtome dan sebagainya.
Kultur Jaringan Tanaman 26