Media Tanam Kultur Jaringan Tanaman Salah satu faktor penentu keberhasilan pelaksanaan kerja
3.1. Komponen Dasar Medium Kultur Jaringan
Pada prinsipnya medium diberikan kepada sel-sel tanaman
in vitro dengan maksud memberikan nutrisi sesuai dengan
kebutuhan sel-sel tanaman tersebut secara alami sebagai tanaman utuh yang tumbuh di alam. Tumbuhan di alam bebas bersifat autotrof, memerlukan nutrisi sederhana yang terdapat di dalam tanah berupa garam-garam mineral dan air untuk meneruskan siklus hidupnya. Hal ini dapat dipahami karena sebagian terbesar tubuh tumbuhan tersusun atas unsur-unsur penyusun zat anorganik tersebut. Pada kultur in vitro tumbuhan, untuk keperluan hidupnya, sel-sel pada eksplan juga memerlukan nutrisi yang komposisinya jauh lebih komplek karena eksplan sedikit banyak telah kehilangan sifat autotrofnya.
Komponen dasar medium kultur dapat bermacam-macam, secara umum medium kultur jaringan harus mengandung unsur-unsur sebagai berikut:
a. Garam-garam anorganik: (1) unsur makro: C, H, O, N, S, P, K,
Ca, dan Mg; (2) unsur mikro: Cl, S, Mo, Zn, Cu, Fe, dan Co;
b. Zat-zat organik: (1) gula, (2) Myo-Inositol, (3) vitamin, (4)
asam-asam amino, dan (5) zat pengatur tumbuh;
c. Substansi organik komplek: (1) air kelapa, (2) ekstrak
buah-buahan, (3) ekstrak ragi (yeast), (4) pepton, (5) tripton, dan (6) hydrolisat kasein;
d. Bahan pemadat: (1) agar-agar, (2) gelrite, (3) phytagel, dan (4)
sea plaque agarose;
e. pH, dan
Kultur Jaringan Tanaman 28 Kebutuhan zat-zat anorganik
Unsur makro. Air merupakan zat terbanyak pada tubuh tumbuhan,
oleh karena itu air juga merupakan bagian terbesar di dalam medium kultur. Air selain sebagai bahan untuk membentuk material tubuh, juga sebagai medium untuk reaksi-reaksi kimia dan fisika. Air juga berguna untuk transpor dan distribusi zat-zat yang terlarut di dalamnya. Pada medium kultur jaringan digunakan air murni yang sudah mengalami demineralisasi, deionisasi dan didestilasi dengan gelas dua kali.
Kebutuhan garam-garam mineral di dalam jaringan kurang lebih sama dengan tanaman lengkap. Garam-garam mineral merupakan gabungan unsur-unsur esensial makro dan mikro. Konsentrasi optimum dari tiap-tiap komponen untuk mencapai kecepatan pertumbuhan yang maksimal sangat bervariasi. Menurut Gamborg dan Shylluk (1981) biasanya berkisar 25-60 mM.
Unsur makro dibutuhkan dalam jumlah cukup besar, pada umumnya diberikan dalam bentuk persenyawaan. George dan Sherrington (1984) menyebutkan beberapa persenyawaan nutrisi makro yang umum digunakan pada medium kultur jaringan, antara lain: KNO3; NH4NO3; Ca(NO3).4H2O; NaNO3; CaCl2.2H2O; MgSO4.7H2O; KCl; KH2PO4; NH4H2PO4; NaH2PO4.2H2O; Na2SO4; (NH4)2SO4; NH4Cl; K2SO4.
Nitrogen (N). Nitrogen diberikan dalam bentuk
persenyawaan yang bermacam-macam, antara lain: KNO3;
NH4NO3; Ca(NO3).4H2O; NaNO3; NH4H2PO4; (NH4)2SO4; NH4Cl. Kebutuhan terbesar adalah untuk menyusun asam-asam nukleat, protein, sebagai koenzim atau persenyawaan lain yang mengandung N seperti klorofil, alkaloid, derivat purin dan pirimidin dan beberapa hormon endogen. Sumber nitrogen pada medium kultur adalah ion ammonium (NH4)+ dan nitrat (NO3)-. Jumlah ion ammonium yang digunakan berkisar antara 2-8 mM, sedangkan nitrat berkisar antara 25-40 mM. Pengambilan unsur
Kultur Jaringan Tanaman 29 nitrat memerlukan pH rendah, sebaliknya pengambilan ammonium menyebabkan pembebasan H- sehingga medium menjadi asam. Medium Murashige dan Skoog (MS) menyediakan nitrogen dalam bentuk garam NH4N03, ini merupakan strategi yang baik dan mempunyai keuntungan ganda, karena selain sumber N-nya lengkap juga dalam bentuk garam efeknya terhadap penurunan pH medium berkurang (George dan Sherrington, 1984).
Fosfor (P). Fosfor diberikan pada medium kultur jaringan
dalam bentuk persenya-waan KH2PO4 atau K2HPO4; NH4H2PO4; NaH2PO4. Ion PO4- total yang diberikan pada medium bervariasi antara 0,5 - 20 mM.L-1. Unsur P di dalam sel diubah menjadi persenya-waan RNA dan DNA, zat-zat yang sangat penting yang bertanggung jawab atas sifat-sifat keturunan. Unsur P diperlukan sebagai aktifator enzim untuk memacu pertumbuhan pada jaringan meristematik. Kelebihan unsur P dapat menghambat pertumbuhan eksplan, karena akan terjadi persaingan penyerapan dengan unsur lain seperti seng (Zn), besi (Fe) dan tembaga (Cu).
Kalium (K). Kalium diberikan pada medium dalam bentuk
KNO3; KH2PO4 atau K2HPO4, KCl dan K2SO4. Ion K+ total yang diberikan pada medium bervariasi antara 1,837 - 25,180 mM.L-1. Unsur K sangat diperlukan untuk memacu pembelahan sel, sintesa karbohidrat dan protein, pembuatan klorofil serta untuk mereduksi nitrat (Kyte, 1983). Kalium berpengaruh pada hidratasi, menambah atau mengurangi hidratasi pada misel sehingga mempengaruhi masuknya nutrien ke dalam sel.
Sulfur (S). Sulfur atau belerang diberikan pada medium
dalam bentuk: MgSO4.7H2O; (NH4)2SO4; K2S04; FeSO4.7H2O; MnSO4.4H2O; ZnSO4.7H2O; CuSO4.5H2O. Pemberian bele-rang berkisar antara 0,75-3,00 mM.L-1. Sulfur ada di dalam beberapa molekul protein dan enzim yang selain berguna untuk memacu perkembangan akar, juga berguna untuk ketahanan atau proteksi tubuh tumbuhan. Belerang diserap dalam bentuk SO4-, antara lain
Kultur Jaringan Tanaman 30 dijadikan aneurin, biotin, persenyawaan asam amino yang ada belerangnya misalnya, cystein dan methionin.
Calsium (Ca). Kalsium atau kapur diberikan pada medium
dalam bentuk: Ca(NO3).4H2O; CaCl2H2O; Ca3(PO4). Pemberian ion Ca berkisar antara 1-3 mM.L-1. Pemakaian Ca-nitrat ada kelemahannya karena sangat higroskopis, sehingga di dalam wadahnya seringkali dijumpai kristalnya berair. Sebaiknya Ca-nitrat dibuat larutan stok dan disimpan di dalam kulkas. Ca-fosfat juga ada kelernahannya yaitu tidak mudah larut. Untuk melarutkannya, sejumlah tertentu Ca-fosfat dimasukkan ke dalam
Erlenmeyer 50 ml, kemudian diberi tetes HCl 0,1 N, campuran ini
digojok sambil dipanasi sampai larut (tampak jernih). Kalsium diperlukan untuk pembentukan dinding primitif, sebagai Ca-pectat yaitu bagian integral dari dinding sel, penting sebagai kation selular dan kofaktor enzim. Kalsium mempengaruhi hidratasi, permeabilitas dan penyerapan nutrien. Kalsium juga empengaruhi tingginya pH, menetralissasikan racun, misalnya pada asam oksalat. Asam oksalat dengan Ca akan menjadi Ca-oksalat berbentuk kristal dan diisolasi atau dimumifikasikan di dalam sel tertentu menjadi sel-sel kristal.
Magnesium (Mg). Magnesium terutama diberikan pada
medium dalam bentuk MgSO4.7H2O. Magnesium diperlukan sebagai elemen utama dalam pembentukan klorofil, berperan penting sebagai aktivator enzim terutama dalam proses fosforilasi dan sintesis protein degan cara membentuk komplek enzim-substrat.
Unsur mikro. Unsur hara mikro adalah unsur yang diperlukan
dalam jumlah sedikit. Fungsinya belum diketahui secara pasti, tetapi tidak adanya zat-zat ini dapat menyebabkan kelainan pertumbuhan. Air dan bahan kimia yang tingkat kemurniannya rendah seringkali terkontaminasi oleh unsur hara mikro. Bentuk persenyawaan hara mikro yang umum digunakan pada beberapa
Kultur Jaringan Tanaman 31 medium kultur menurut George dan Sherrington (1984) adalah: MnSO4.4H2O; ZnSO4.7H2O; H3BO3; KI; CuSO4.5H2O; NaMoO4.2H2O; CoCl2.6H2O; FeCl3.6H2O; Fe III citrate; FeSO4.7H2O; NaFeEDTA; Na2EDTA.2H2O; Fe(SO4)3; Fe III
tartrate.
Besi (Fe). Besi diperlukan dalam jumlah sedikit lebih
banyak daripada unsur mikro yang lain, berikan dalam bentuk
chelat. Pemberian Fe bersama-sama dengan NaEDTA
dimaksudkan agar besi tetap pada jangkauan pH yang luas dalam jangka waktu yang lama hingga dapat diserap oleh jaringan tanaman. Fe berperan penting dalam sintesis klorofil, konversi energi pada fotosintesis dan respirasi dengan melakukan reduksi oksidasi, bagian dari sitokrom. Besi diberikan pada medium kultur jaringan berupa FeCl3.6H2O; Fe III trate; FeSO4.7H2O; NaFeEDTA 2H2O; Fe(SO4); Fe III tartrate.
Boron (Bo). Boron diberikan pada medium kultur sebagai
asam borat (boric acid, H3BO3). Berperan dalam translokasi karbohidrat, juga terlibat dalam diferensiasi seluler dan per-kembangan. Ikatan boron organis memungkinkan adanya diferensiasi dan penyusunan struktur halus dari dinding sel sehingga memudahkan transport karbohidrat dan penyerapan ion ke dalam sel; sebagai aktifator dan inaktifator bagi zat pengatur tumbuh. Kalau boron kurang, zat pengatur tumbuh menjadi terlalu banyak sehingga menghambat pertumbuhan.
Molybdenum (Mo). Molibdenum diberikan pada medium
sebagai sodium molybdat (Na2MoO4.2H2O), berpartisipasi pada konversi nitrogen ke ammonia dan fiksasi nitrogen, ikut dalam metabolisme protein, sintesis asam askorbat, dan kofaktor enzim.
Manganese (Mn). Manganese merupakan elemen esensial
yang terdapat pada membran kloroplas, berperan sebagai aktivator enzim dengan bertindak sebagai perantara pada proses fosforilasi atau sebagai gugus redoks Mn2+. Bahan pembentuk klorofil dan
Kultur Jaringan Tanaman 32 aktif dalam fotosintesis, metabolisme protein dan pembentukan vitamin C. Pada medium kultur diberikan dalam bentuk MnSO4.
Cobalt (Co). Cobalt merupakan e1emen dari molekul
vitamin B kompleks, esensial untuk fiksasi nitrogen. Pada medium kultur jaringan diberikan dalam bentuk persenyawaan Cobalt
Chloride (CoCl2).
Zincum (Zn). Zincum berperan sebagai aktivator enzim,
penyusun khlorofil, pemacu pembentukan zat pengatur tumbuh terutama IAA. Pada medium kultur jaringan diberikan dalam bentuk zinc sulphate (ZnSO4).
Cuprum (Cu). Cuprum merupakan bagian dari enzim, Cu
bereaksi menjadi komponen phenolase, lactase dan askorbat
oksidase. Ikut ambil bagian dalam proses fotosintesis dan reduksi
nitrit. Cuprum diberikan pada medium kultur jaringan dalam bentuk Cupric sulfate (CuSO4 5H2O).
Chlorine (Cl). Chlorine sebagai ion berpengaruh terhadap
aktifitas enzim, memacu proses fotosintesis. Chlorine diberikan pada medium kultur jaringan berupa Calcium Chloride (CaCl2).