Kultur Sel yang Belum Terorganisasikan atau Kultur Jaringan
6.4. Kultur Protoplas
Salah satu karakteristik sel tumbuhan adalah terdapatnya dinding sel yang tebal dan kaku mengelilingi dan melindungi membran plasma serta bagian dalam dari sel. Sebagai pendukung mekanik dari jaringan tanaman, dinding sel sangat komplek dan sangat tinggi diferensiasinya. Pada sel-sel tertentu dinding sel primer, sekunder dan tertier terkumpul secara berlapis-lapis selama pertumbuhan.
Protoplas adalah sel hidup yang telah dihilangkan dinding selnya sehingga sebagai satu satunya pembatas antara faktor lingkungan luar dengan bagian dalam dari sel hidup hanya berupa membran plasma saja. Protoplas sudah berhasil diisolasi dari banyak spesies tumbuhan, ketiadaan dinding sel sebagai barier mekanik memungkinkan dilakukannya peleburan protoplas yang diperoleh dari sel-sel somatik dari jenis tanaman yang berbeda. Sebagai hasil dari hibridisasi somatik, dimungkinkan terjadinya kombinasi genetik baru.
Protoplas pada dasarnya adalah sel hidup dikurangi dinding selnya atau sering disebut sebagai sel telanjang dan sebagai satu-satunya pembatas adalah membran plasma. Sel yang sudah kehilangan dinding selnya akan menghadapi perubahan tekanan osmotik yang sangat drastis dan berbeda dengan lingkungannya semula. Tekanan osmotik yang terlalu tinggi atau terlalu rendah dapat merusakkan viabilitas protoplas, namun pada lingkungan
Kultur Jaringan Tanaman 121 dengan tekanan osmotik yang cocok dapat memelihara kestabilan protoplas lebih lama. Dinding sel yang harus dihilangkan pada isolasi protoplas terdiri dari suatu senyawa yang komplek. Struktur utamanya berupa selulosa dan hemiselulosa dengan substansi pektat sebagai bahan pengikat antar sel tanaman. Penghilangan dinding sel dapat dilakukan secara mekanik atau enzimatik, sedangkan eksplan yang dapat digunakan untuk isolasi protoplas adalah semua bagian tanaman yang masih muda.
Isolasi Protoplas
Karakteristik sel tumbuhan adalah adanya dinding sel yang tebal dan kaku mengelilingi dan melindungi membran plasma serta bagian dalam dari sel hidup. Apabila sel telah kehilangan dinding selnya, maka satu-satunya pembatas antara lingkungan luar dengan bagian dalam dari sel yang hidup adalah membran plasma atau
plasmalemma. Membran plasma adalah suatu selaput yang terdiri
dari protein, lemak dan oligosakharida. Oligosakharida yang mengikat lemak disebut glikolipid, dan yang mengikat protein disebut glikoprotein. Glikolipid dan glikoprotein membentuk suatu lapisan yang disebut glikokalik.
Sebagai pendukung mekanik dari jaringan tanaman, dinding sel sangat komplek dan sangat tinggi diferensiasinya. Proses pembentukan dinding sel dimulai pada saat sel membelah, terjadi dinding yang pertama yaitu dinding primitif yang tersusun atas pektin atau protopektin, disebut lamella tengah. Kemudian diikuti dengan penebalan primer yaitu pelapisan selulosa mikrofibril (secara aposisi). Penebalan sekunder juga dikerjakan dengan cara aposisi tetapi zatnya adalah lignin. Penebalan dinding sel dapat terjadi dengan cara: penebalan primer secara aposisi dengan zat selulose, kemudian penebalan sekunder dengan lignin disisipkan di antara serabut selulose (intussuscepsi), dan penebalan tersier secara aposisi lagi dengan zat lignin.
Kultur Jaringan Tanaman 122 Permasalahan yang dijumpai pada isolasi protoplas adalah sebagai berikut. Penghilangan dinding sel, dinding sel yang harus dihilangkan pada isolasi protoplas umumnya terdiri dari suatu senyawa yang komplek. Penghilangan dinding sel harus diikuti dengan terbebasnya protoplas dalam jumlah yang cukup banyak. Protoplas yang sudah tidak berdinding akan menghadapi perubahan tekanan osmosa yang sangat drastis dan berbeda dengan lingkungannya semula, sehingga di dalam medium untuk isolasi maupun budidaya harus ditambahkan zat anti blasting untuk mencegah pecahnya protoplas. Biasanya digunakan sorbitol atau mannitol (0,5-0,7 M).
Protoplas sebagai sel telanjang harus tetap mampu mengadakan reproduksi, dan pada waktunya harus dapat membentuk dinding selnya kembali apabila dibudidayakan pada medium yang sesuai. Untuk mendapatkan protoplas yang maksimal, diperlukan bahan tanam atau eksplan yang cocok. Protoplas dapat diisolasi dengan cara mekanik atau ensimatik. Cara mekanik dikerjakan dengan memotong eksplan di dalam larutan plasmolitikum. Protoplas akan mengkerut, sehingga dapat ditekan keluar dari dinding sel. Deplasmolisis selanjutnya akan menyebabkan terlepasnya protoplas dari sel-sel. Kelemahan penggunaan teknik ini adalah relatif sukar, jumlah protoplas yang dihasilkan tidak banyak, keefektifannya dibatasi hanya pada sel-sel yang dapat diplasmolisa seperti jaringan penyimpan dan tidak dapat digunakan pada jaringan meristem karena dinding selnya masih sangat erat berhubungan dengan protoplas. Kelebihannya dapat meniadakan efek dari aktifitas ensim yang kadang-kadang merusak atau mengganggu metabolisme yang sangat komplek di dalam protoplas.
Sejak ditemukan o1eh Cocking pada tahun 1960, isolasi protoplas secara enzimatik hampir selalu digunakan untuk setiap
Kultur Jaringan Tanaman 123 jenis tanaman sampai sekarang. Dengan teknik tersebut dapat dihasilkan populasi protoplas dengan jumlah kerapatan yang tinggi (2,5 x l06 protoplas gram-1 jaringan daun). Larutan enzim yang digunakan untuk isolasi protoplas komposisinya bermacam-macam. Untuk melisiskan dinding sel dengan baik dapat dilakukan dengan meng-gunakan kombinasi dua macarn enzim yaitu
Cellulase dan Pectinase secara simultan. Pektinase akan
melonggarkan ikatan antara sel yang satu dengan sel yang lain atau melepaskan sel, sedangkan Cellulase akan menghancurkan dinding selulosa sehingga sel menjadi telanjang.
Tabel 6.1. Enzim yang umum digunakan untuk isolasi protoplas
Cellulase Cellulase Onozuka R-10
Cellulysin Driselase Meicelase Pectinase Pectinase Pectyolase Y-23 MaceraseMacerocym R-10 Pectinol Hamicellulase Rhozyme HP150 Hamiselulase
Enzim yang digunakan untuk isolasi protoplas harus dilarutkan di dalam larutan plasmolitikum. Untuk memperoleh protoplas yang masih berkemampuan hidup dianjurkan untuk menggunakan konsentrasi enzim minimal. Konsentrasi dapat bervariasi antara 0,25-5%, tergantung pada beberapa faktor yaitu macam enzim, sumber protoplas, temperatur dan lamanya inkubasi. Beberapa peneliti telah menggunakan kombinasi ensim; Larkin (1976) menggunakan Cellulase Onozuka P1500 3% dan
Kultur Jaringan Tanaman 124 dan perhiasan bunga Petunia. Hahne et a1. (1982) menggunakan larutan enzim yang terdiri dari Cellulase (Roem, Darmstadt) 1%,
Pectinase (PATE, Hoeschst) 0,1%, Macerozyme Rl0 0,1% dan mannitol 0,4 M pada pH 5,8. Ensim Cellulase yang sering
digunakan ialah Driselase, Sellulisin dan Cellulase Onozuka R-10. Sedangkan enzim lain yang sering digunakan bersama
Cellulase ialah Hemisellulase (Rhozyme HP 150) dan Pectinase
(Macerase, Macerozyme, Pectiol AC, Pectolyase Y-23, Pectinase,
Pectic Acid asetic Transferase). Enzim-enzim yang digunakan
untuk isolasi protoplas merupakan produk dari beberapa jenis mikroorganisme (terutama sejenis jamur). Enzim-enzirn tersebut umumnya diperdagangkan dengan tingkat kemurnian yang berbeda-beda, hal ini menunjukkan masih adanya komponen-komponen lain di dalamnya misalnya, sellulase mungkin di dalamnya juga terdapat hemisellulase.
Ketersediaan enzim yang tidak murni sebenarnya juga menguntungkan karena dapat menghidrolisis komponen dinding sel yang bukan merupakan substrat dari enzim utama. Enzim
Cellulase Onozuka R-10 misalnya, diketahui mengandung hemisellulase, enzim ini memang paling sering digunakan untuk
isolasi protoplas dari berbagai jenis tanaman. Sterilisasi enzim dilakukan dengan menggunakan filter yang porositasnya 0,22-0,24 μm, karena enzim bersifat termolabil. Filter diletakkan pada ujung alat injeksi, larutan enzim dilewatkan pada filter tersebut, sehingga larutan yang keluar adalah larutan enzim steril.
Sel yang sudah kehilangan dinding selnya akan menghadapi perubahan tekanan osmosa yang sangat drastis dan berbeda dengan lingkungannya semula. Tekanan osmotik yang terlalu tinggi atau terlalu rendah dapat merusakkan viabilitas protoplas, namun di dalam lingkungan dengan tekanan osmotik yang cocok dapat memelihara kestabilan protoplas lebih lama. Oleh karena itu protoplas membutuhkan proteksi osmotik di dalam
Kultur Jaringan Tanaman 125 medium sampai dinding sel terbentuk, osmotikum dibutuhkan mulai dari isolasi sampai kultur. Di dalam medium kultur biasanya digunakan osmotikum Mannitol atau Sorbitol (0,5-0,7 M), osmoti-kum lain yang juga sering digunakan adalah glukosa dan sukrosa.
Protoplas yang sudah dikulturkan secara perlahan mulai meregenerasikan dinding selnya, sintesis dinding sel baru umumnya berlangsung beberapa jam setelah protoplas dikulturkan dan akan terus berlangsung selama 2-3 minggu. Pada saat ini, tekanan osmotik medium perlahan-lahan harus diubah (diturunkan) dengan jalan meneteskan medium tanpa mannitol atau sorbitol. Bila tekanan osmotik medium tidak diubah, tekanan osmotik yang tinggi dapat menghambat pembelahan sel. Strategi yang digunakan untuk mengurangi osmotikum secara gradual adalah dengan mencampur osmotikum mannitol dan sukrosa di dalam medium kultur. Sukrosa akan dengan cepat dimetabolisasikan oleh protoplas sehingga dapat mengurangi osmolaritas dari medium kultur.
Sebagai eksplan yang digunakan untuk isolasi protoplas sebaiknya dipakai jaringan atau organ yang sel-selnya masih muda. Sel-sel yang masih muda atau meristem diperkirakan dinding selnya baru sampai penebalan primer dari zat pektin dan selulosa, sehingga relatif lebih mudah untuk dihancurkan. Eksplan yang demikian berasal dari jaringan parenkim primer, daun atau organ tanaman yang lain, kalus dari hasil budidaya jaringan dan kultur suspensi sel. Mesofil daun adalah yang paling banyak digunakan, sel-sel mesofil daun mem-punyai keistimewaan, yaitu mengandung kloroplas atau plastida sehingga mudah diidentifikasi, letak sel yang baru dengan sel yang lain relatif renggang (Gambar 6.1) sehingga memudahkan penetrasi larutan enzim.
Kultur Jaringan Tanaman 126 Gambar 6.7. Struktur anatomi daun, jaringan mesofil terdiri dari palisade parenkim dan spon parenkhim (George et al., 2008).
Protoplas yang berasal dari mesofil daun akan berwarna hijau, sedangkan yang berasal dari kalus atau kultur suspensi sel hasil budidaya jaringan akan berwarna putih jernih. Hal ini sangat penting untuk pemilihan pasangan fusi. Inkubasi eksplan dalam larutan enzim biasanya bervariasi antara 2-24 jam tergantung dari konsentrasi larutan enzim, macam bahan dan jenis tanaman yang digunakan. Untuk bahan daun biasanya di inkubasi semalam atau 12-18 jam dalam larutan enzim, diletakkan di atas penggojok berkecepatan rendah, kondisi gelap, pada suhu 28°C.
Kultur Jaringan Tanaman 127 Gambar 6.8. Prosedur isolasi protoplas secara enzimatik dengan
eksplan daun (George and Sherrington, 1984).
Setelah waktu inkubasi selesai, suspensi protoplas harus dipisahkan dari larutan enzim. Masih terdapatnya sisa-sisa larutan enzim dapat menghambat pembentukan sel kembali. Oleh karena itu harus dilakukan prosedur pemurnian protoplas atau purifikasi. Purifikasi dilakukan dengan penyaringan, centrifugasi dan pencucian. Untuk mendapatkan protoplas intak dapat diberi perlakuan gradient sukrosa. Sukrosa dengan berat molekul tertentu akan dapat mengendapkan debris yang berupa sisa-sisa jaringan epidermal, jaringan pengangkut. Protoplas yang rusak dan agregat sel, sedangkan protoplas yang viabel akan tetap mengapung dipermukaan larutan.
Kultur Jaringan Tanaman 128 Metode lain yang hampir sama dengan prinsip di atas adalah dengan menggunakan larutan ficoll (polisukrosa). Hasil protoplas intak yang diperoleh dapat bermacam-macam tergantung dari sumber eksplannya. bila dilihat dengan mikroskop akan tampak berbetuk bulat. Pada umumnya ditemukan adanya
vacuolated protoplast, protoplas dengan kloroplas yang tersebar di
sekitar membran plasma bagian dalam, protoplas dengan kloroplas menggerombol dekat membran plasma secara monopolar, protoplas yang mengandung zat warna antosianin dan protoplas yang tidak berwarna.
Protoplas lengkap yang diperoleh setelah prosedur purifikasi dapat dibudidayakan atau diinduksi ke arah fusi untuk itu protoplas-protoplas harus berada dalam kondisi yang cukup densitas maupun viabilitasnya. Biasanya dalam kisaran jumlah tertentu untuk masing-masing tanaman. Apabila kurang atau lebih dari kisaran tertentu protoplas akan sukar tumbuh dan berkembang. Protoplas tembakau optimum pada kerapatan sekitar 105 protoplas ml-1 atau 1-5 x l06 protoplas g-1 jaringan daun. Protoplas Petunia optimum pada konsentrasi sekitar 2,5 x 106 protoplas ml-1. Konsentrasi protoplas dapat dideterminasi dengan menggunakan
Haemositometer modifikasi Fuchs-Rosenthal dengan kedalaman
0,2 mm atau dengan manipulasi yang sama seperti penghitungan populasi mikroorganisme dalam mikrobiologi.
Viabilitas protoplas dapat diuji dengan pengecatan menggunakan cat Fluorescein, yaitu FDA (Fluoresceindiacetat),
Calcofluor White (untuk regenerasi dinding sel) atau pewarnaan
ganda FDA dengan PI (Propidium Iodide). Dua cat fluorescein yang disebut pertama, hanya dapat mewarnai protoplas yang viabel, karena cat hanya dapat terkumpul pada plasmalemma protoplas yang masih hidup, dapat dideteksi dengan mikroskop
fluoresensi. PI dapat mewarnai sel-sel mati, dengan pewarnaan
Kultur Jaringan Tanaman 129 Dodds dan Roberts (1983) menggunakan Evan's Blue 0,1% untuk menguji viabilitas protoplas. Protoplas yang viabel akan mampu menolak masuknya zat warna biologis tersebut. Impermeabilitas sel untuk cat ini dapat digunakan sebagai indikator viabilitas protoplas
Protoplas sudah berhasil diisolasi dari banyak spesies tumbuhan, ketiadaan dinding sel sebagai barier mekanik memungkinkan protoplas dipergunakan untuk berbagai keperluan: (1) dilakukannya peleburan protoplas yang diperoleh dari sel-sel
somatik dari jenis tanaman yang berbeda, sebagai hasil dari hibridisasi somatik, dimungkinkan terjadinya kombinasi genetik baru;
(2) studi introduksi DNA asing, organel, partikel bakteri atau virus, dan
(3) mendapatkan tanaman dengan sifat yang lebih baik melalui variasi somaklon.
Kultur protoplas dapat dilaksanakan derigan berbagai cara misalnya dengan meneteskan suspensi protoplas pada dasar
petridish, atau dengan cara meneteskan pada dasar petridish
kemudian membaliknya (hanging drop culture). Protoplas juga dapat dikulturkan dengan meneteskan suspensi protoplas di atas medium padat sehingga membentuk lapisan tipis, atau dengan meresuspensikan pada medium agar yang masih cair kemudian dituangkan pada petridish sehingga membentuk lapisan tipis protoplas yang terjerat di dalam matrik agar, cara ini mirip dengan
plating sel pada kultur suspensi sel. Medium yang digunakan untuk
kultur protoplas dapat menggunakan medium MS atau B5, di dalam medium kultur harus mengandung osmotikum sorbitol atau
mannitol yang diperlukan sampai dinding sel terbentuk.
Perkembangan protoplas dapat diamati secara langsung di bawah mikroskop inverted, dalam waktu 2-3 minggu protoplas
Kultur Jaringan Tanaman 130 yang viabel telah dapat meregenerasikan dinding selnya secara penuh. Pada saat ini, tekanan osmotik medium perlahan-lahan diubah dengan meneteskan medium tanpa mannitol atau sorbitol. Bila tekanan osmotik medium tidak diubah dapat menghambat pembelahan sel. Indikator terbaik untuk melihat perkembangan protoplas adalah dengan pengecatan Calcofluor White (CW), cat ini spesifik mengikat 1-3 glucan pada dinding sel. Protoplas yang dicat dengan CW dapat divisualisasikan dengan mikroskop
fluorescent.
Tatalaksana isolasi dan kultur protoplas dikerjakan sebagai berikut:
Persiapan larutan-larutan: I. Larutan Enzim (LM)
1,2 % w/v Cellulase Onozuka 10; 0,4 % w/v Macerozyme R-10; 13 % w/v Mannitol; dilarutkan dalarn larutan CPW pH 5,8 Sterilisasi dengan millipore filter.