Kultur Sel yang Terorganisasikan atau Kultur Organ
5.1. Kultur Ujung Pucuk
Istilah kultur pucuk (shoot culture) atau kadang-kadang disebut kultur ujung pucuk (shoot tip culture) mengacu pada kultur yang menggunakan eksplan yang memiliki meristem pucuk secara lengkap. Tujuannya adalah untuk perbanyakan pucuk melalui pembentukan berkali-kali pucuk cabang ketiak. Teknik ini menghasilkan pucuk baru yang bisa digunakan sebagai eksplan yang bisa berproliferasi secara berulang-ulang. Pucuk yang tidak teratur atau kumpulan pucuk diakarkan untuk membentuk plantlet kemudian dapat ditanam secara in vivo. Teknik ini digunakan secara luas dalam perbanyakan mikro.
Kultur Jaringan Tanaman 63
a. Ukuran eksplan
Secara konvensional, kultur pucuk dimulai dengan mengkulturkan potongan pucuk batang utama atau pucuk cabang yang berukuran 20 mm, dipisahkan dari pucuk yang sangat aktif tumbuh atau dari buku tunas dorman. Eksplan dalam ukuran yang lebih panjang juga kadang-kadang digunakan dengan keuntungan: (1) memiliki sebagian besar pucuk atau bagian cabang yang memiliki satu atau beberapa mata tunas, dan (2) kadang-kadang pucuk dari kultur pucuk lainnya juga digunakan. Bila buku pucuk batang utama dan pucuk cabang digunakan sebagai eksplan, istilah kultur ujung pucuk digunakan secara luas pada jenis kultur ini.
Menggunakan eksplan dalam ukuran besar mempunyai keuntungan jika dibandingkan dengan penggunaan eksplan ukuran yang lebih kecil dalam menginisiasi pucuk, yaitu: (1) mempunyai kemampuan yang sangat baik pada kondisi in vitro, (2) lebih cepat memulai pertumbuhan, dan (3) mengandung lebih banyak buku tunas cabang. Akan tetapi, semakin besar ukuran eksplan, semakin sulit menghindari kontaminasi mikroorganisme, sehingga secara praktis penggunaan eksplan yang lebih besar dapat dilakukan asalkan memperbaiki kondisi teknik aseptik.
Kultur pucuk juga sering digunakan secara langsung dari pucuk yang diperoleh dari kultur ujung meristem. Eradikasi virus dilakukan pada saat perbanyakan pucuk. Kadang-kadang juga digunakan ujung pucuk yang telah dipisah-pisahkan atau dimaserasi. Kultur ujung atau meristem digunakan untuk mengeliminasi bakteri, yang dilakukan dengan mengkulturkan eksplan yang sangat kecil dan plantlet tunggal dapat dihasilkan dari setiap eksplan. Istilah ini paling sering tidak digunakan.
Kultur Jaringan Tanaman 64
b. Pengaturan proliferasi pucuk
Pertumbuhan dan proliferasi pucuk aksiler (tunas cabang) pada kultur pucuk biasanya dirangsang dengan mengintegrasikan penggunaan zat pengatur tumbuh (ZPT) sitokinin di dalam medium kultur. Seringkali perlakuan ZPT efektif mengurangi bahkan meniadakan dominansi meristem apikal sehingga pucuk aksiler dapat dihasilkan dalam jumlah banyak. Pucuk seperti ini digunakan sebagai eksplan bagi perbanyakan tanaman.
c. Meniadakan ujung pucuk
Pada tanaman tertentu, menghilangkan ujung pucuk merupakan alternatif dalam memberi peran ZPT untuk mengurangi dominansi meristem apikal. Pembuangan ujung pucuk sangat efektif pada beberapa jenis Ros (Bressan et al., 1982)dan beberapa kultuivar Apel (Yae et al., 1987). Pemangkasan ujung pucuk atau “tipping” biasanya dilakukan ketika bahan tanaman akan disubkulturkan, seperti pembuangan buku apikal pada subkultur pertama meningkatkan jumlah cabang pada kultur pucuk Pistacia (Barghchi, 1986).Macam pemangkasan pucuk yang efektif terjadi bila pucuk digunakan sebagai pemangkasan mikro.
Standardi (1982) dan Shen dan Mullins (1984) mendapatkan proliferasi pucuk terbaik varietas Kiwi dan Pear melalui menanam kumpulan pucuk bagian bawah yang tertinggal pada fase ini, ke medium baru untu proliferasi selanjutnya. Hanya beberapa tanaman yang tidak memerlukan sitokinin maupun efektif meniadakan dominansi apikal. Geneve et al. (1990) melaporkan bahwa calon pucuk Gymnocladus dioicus menghasilkan 1-5 pucuk, akan tetapi hanya satu yang tumbuh hingga ketinggian yang memadai. Apabila pucuk ini dihilangkan, pucuk lainnya akan tumbuh.
Kultur Jaringan Tanaman 65 Gambar 5.1. Kultur ujung pucuk (George et al., 2008).
d. Menanam eksplan secara horisontal
Pada tanaman Pear, membuang ujung pucuk menyebabkan pertumbuhan pucuk aksiler dalam pengendalian, akan tetapi jumlah pucuk yang terbentuk menjadi berkurang. Cara fisik yang paling efektif untuk memeriksa dominansi apikal dicapai dengan memangkas ujung dan atau menempatkan eksplan secara horizontal di atas medium (Lane, 1979; MacKay dan Kitto, 1988). Perlakuan akan efektif dengan banyak tanaman berkayu lainnya: penem-patan potongan pucuk secara horizontal yang mengandung 2-3 buku menghasilkan pucuk aksiler yang lebih banyak pada kultur Acer rubrum, Amelanchier spicata, Betula nigra, Forsythia
intermedia and Malus domestica, dibandingkan dengan eksplan
yang ditanam secara vertikal (McClelland dan Smith, 1990). Hasil yang paling baik pernah dilaporkan pada tanaman Lilac
Kultur Jaringan Tanaman 66 (Hildebrandt dan Harney, 1983) dan beberapa kultivar Apel (Yae
et al., 1987).
e.Pertumbuhan pucuk
Sayangnya, tidak semua pucuk yang terbentuk selama kultur berasal dari buku aksiler. Seringkali, pucuk adventif juga terbentuk baik secara langsung dari pucuk yang dikulturkan atau secara tidak langsung dari kalus pada bagian dasar massa pucuk yang disubkulturkan. Sebagai contoh: Nasir dan Miles (1981)
mendapatkan bahwa subkultur batang bawah tanaman apel,
beberapa pucuk baru terbentuk pada bagian dasar kumpulan pucuk, keduanya adalah pucuk adventif dan aksiler dihasilkan pada kultur
Hosta (Papachatzi et al., 1981); dan proliferasi pucuk dari
beberapa macam ujung pucuk tanaman kentang berasal dari kalus organogenik (Roca et al., 1978). Asal muasal yang paling pasti terjadinya pucuk hanya dapat ditentukan melalui uji anatomi yang lebih teliti. Hussey (1983) menamakan bahwa kedua pucuk adventif dan aksiler adalah ‘mixed cultures’. Pucuk adventif, utamanya yang terbentuk secara langsung dari kalus biasanya tidak diinginkan.
Pucuk yang berasal dari tunas aksiler biasanya identik secara genetik dengan tetuanya, sedangkan kemungkinan bahwa pucuk tersebut berasal dari kalus akan berbeda pada satu atau beberapa sifat. Secara genetik, tanaman yang menyimpang akan diperoleh pada frekuensi yang tinggi dari kalus yang baru diinisiasi, akan tetapi bisa terjadi jumlah yang signifikan jika masa pucuk yang menyatu pada bagian bawah kalus di angkat ke atas untuk mendapatkan eksplan bagi subkultur. Penggunaan protokol yang kaku, hanya menggunakan pucuk aksiler, dapat menimbulkan masalah bagi beberapa tanaman lain dimana jumlah pucuk yang terbentuk relatif sedikit atau lambat.
Kultur Jaringan Tanaman 67 Beberapa peneliti berhasil menggunakan batasan yang lebih luwes dan dengan pro-porsi pucuk adventif yang dapat diterima (sebagai contoh: Kalanchoe blossfeldiana - Schwaiger dan Horn, 1988). Konsekuensinya derajad variasi di antara anakan: bisa dan tidak diterima oleh konsumen. Pembentukan kalus dan selanjutnya berkembang menjadi pucuk adventif bisa selalu dikendalikan melalui modifikasi ZPT di dalam medium kultur. Pemecahan ujung meristem atau kulturnya pada cara tertentu dapat menyebabkan terbentuknya pucuk adventiv yang dapat digunakan dalam perbanyakan tanaman.
f. Metode
Eksplan utama
Pada kebanyakan tanaman herbaceous, eksplan dari ujung pucuk dapat diperoleh dari buku ketiak dan utama tanaman utuh, dan terdiri dari meristem batang utama dengan bentuk yang agak bulat mengandung beberapa calon daun. Pada beberapa helai primordia daun cabang yang telah berkembang sempurna terdapat meristem buku aksiler. Pada beberapa spesies seperti Eucalyptus, akan menguntungkan untuk memulai kultur pucuk dengan potongan batang tanaman donor yang memiliki satu atau beberapa buku (buku batang). Pucuk akan tumbuh dari buku, berikan perlakuan setelahnya sebagaimana yang dipraktekkan pada kultur ujung pucuk. Penggunaan eksplan dari buku tidak mengacaukan dengan kultur buku dimana suatu metode perbanyakan pucuk digunakan berbeda dengan kultur pucuk.
Ujung pucuk tanaman berkayu atau tanaman tahunan lainnya akan sulit dihindarkan dari kontaminasi. Oleh karena itu, Standardi dan Katalano (1985) memilih kultur pucuk tanaman
Actinidia chinensis dari ujung meristem yang sangat mudah
disterilisasi. Ujung pucuk tanaman tahunan berkayu lebih baik dari pada tanaman herba untuk menghindari substansi fenolik yang
Kultur Jaringan Tanaman 68 tidak diinginkan saat dikulturkan di dalam medium tumbuh. Buku yang dikulturkan dari bagian dewasa tanaman semak atau tanaman berkayu dapat juga ditumbuhkan secara in vitro dan faktor-faktor musim dapat menyebabkan dormansi alamiah sejumlah buku dari beragam sumber sehingga kultur hanya dapat dilakukan pada waktu tertentu selama setahun.
Eksplan ujung pucuk atau buku cabang biasanya lebih baik untuk diinduksi untuk tumbuh yang diperoleh dari pucuk muda sebagaimana pada bibit atau tanaman muda. Pucuk muda yang kadang-kadang tumbuh pada buku bagian batang atau yang terbentuk akibat pemangkasan batang tanaman perdu atau berkayu merupakan sumber alternatif. Akan tetapi, melalui pengembangan teknik yang baik memungkinkan untuk memperbanyak tanaman hias berkayu tertentu, tanaman kehutanan, dan pohon buah-buahan, menggunakan eksplan dari pucuk tanaman dewasa. De Fossard et
al. (1977) dapat menginisiasi Eucalyptus ficifolia dengan kultur
ujung pucuk dari pohon yang berumur 36 tahun. Akan tetapi mendapatkan eksplan dari tanaman kehutanan akan menjadi sulit untuk menghindarkan dari kontaminasi tanpa menutup atau melindungi bagian pucuk tersebut untuk beberapa waktu sebelum di pisahkan dari induknya (fase 0).
Eksplan Sekunder
Fase II subkultur yang diinisiasi dari pucuk aksiler dipisahkan dari kumpulan pucuk utama. Penggunaan eksplan sekunder dari pucuk utama (kumpulan) akan mempunyai pengaruh pada penampilan subkultur selanjutnya. Proliferasi pucuk yang sangat tinggi kadang-kadang diperoleh dari eksplan buku atau melalui pemisahan massa dasar pucuk. Ujung pucuk merupakan eksplan sekunder terbaik bagi tanaman Rosa ‘Fraser McClay’, akan tetapi eksplan dari buku tanaman Cherry (‘F12/1’) menghasilkan pucuk dua kali lebih banyak, dan massa bagian bawah tiga kali lebih banyak dari pada ujung pucuk (Hutchinson,
Kultur Jaringan Tanaman 69 1985). Pada tanaman Sitka spruce, kultur apeks yang telah disubkulturkan sebelumnya mampu memproliferasikan sejumlah buku pada frekuensi yang tinggi dibanding dengan yang diperoleh dari buku aksiler (John dan Murray, 1981). Sumber eksplan dapat juga memberi pengaruh yang sangat kuat bagi pertumbuhan selanjutnya ketika telah ditanam di lapangan. Hal tersebut sebagaimana diilustrasikan oleh Marks dan Meyers (1994) pada tanaman Daphne odorata.
Untuk memperkecil resiko perubahan genetik pada hasil kultur, eksplan untuk subkultur dan pucuk yang akan dikulturkan pada fase III, seharusnya dipilih dari pucuk baru yang berasal dari buku aksiler. Disarankan untuk menentukan dosis kandungan ZPT di dalam medium sehingga pucuk adventif tidak terbentuk, meskipun jumlah pucuk yang terbentuk menjadi berkurang. Pada beberapa contoh, kalus yang diperoleh dari dasar atau bagian bawah eksplan dapat diorganisasikan sehingga mampu menghasilkan tanaman yang stabil secara genetik. Kultur fase II yang cirinya tanpa akar, pucuk perlu disisipkan dan diperlakukan seperti miniatur penyetekan, dan ketika telah berakar akan menjadi tanaman yang dikehendaki. Alternatifnya adalah merangsang pemanjangan kumpulan pucuk dan tumbuhnya pucuk pada kondisi
ex vitro.
Media dan Zat Pengatur Tumbuh
Hal yang perlu diperhatikan dalam kultur pucuk bagi kebanyakan tanaman budidaya adalah kebutuhan sitokinin konsentrasi tinggi pada fase II untuk merangsang pertumbuhan pucuk aksiler yang banyak. ZPT sitokinin biasanya sangat efektif dalam meniadakan dominansi pucuk apikal. Penggunaannya dapat dikombinasikan dengan memangkas pucuk aksilar, atau menempatkan eksplan dalam posisi horizontal. Perlakuan dengan sitokinin tidak hanya merangsang pembentukan kumpulan pucuk
Kultur Jaringan Tanaman 70 (pucuk aksiler dan atau pucuk adventif), akan tetapi juga (bila penggunaan komponen yang tidak tepat atau pada konsentrasi yang terlalu tinggi) menyebabkan terbentuknya pucuk yang terlalu pendek untuk diakarkan dan ditransfer. Karena sifat sitokinin seperti itu, atau karena ketidaktepatan cara kultur yang diaplikasikan, beberapa tanaman tidak mampu menghasilkan kumpulan pucuk pada fase II dan eksplan tetap pada status dominansi apikal. Sebagai contoh, kultur pucuk tanaman
Gymnocladus dioicus, meskipun pembentukan beberapa pucuk
aksiler dengan kehadiran BA dan sitokinin, suatu pucuk akan mendominasi pucuk lainnya (Geneve et al., 1990). Akan tetapi banyak jenis tanaman lainnya sangat cocok dengan kultur buku.
g. Pemanjangan
Panjang pucuk aksiler yang dihasilkan dari kultur pucuk agak beragam menurut jenis tanaman yang dikulturkan. Spesies yang mengalami sistem pemanjangan pucuk secara in vivo akan menghasilkan pucuk aksiler yang mudah dipisahkan seperti dalam penyambungan mikro, dan secara individu dapat diakarkan. Pucuk dominan apikal yang belum bercabang juga dapat diperlakukan dengan cara yang sama. Pada kondisi ekstrim dimana tanaman mempunyai pertumbuhan “rosette” yang cenderung menghasilkan kumpulan pucuk dalam kultur. Bila diperbanyak secara mikro, akan sulit untuk memisahkan individu pucuk untuk digunakan sebagai eksplan sekunder. Secara praktis hanya bisa dilakukan untuk memisahkan kumpulan pucuk menjadi pucuk-pucuk tunggal dan ditanam kembali pucuk-pucuk tersebut. Kumpulan pucuk seperti ini dapat diinduksi untuk membentuk akar ketika tanaman berbentuk perdu diperlukan (sebagaimana banyak spesies yang dijual dalam pot dengan daun yang menarik). Selain itu perlu mengkhususkan pemanjangan pucuk sebelum diakarkan (fase IIIa). Kultur pucuk yang diperlakukan seperti ini yang membentuk
Kultur Jaringan Tanaman 71 pucuk aksiler dikurangi, dan merangsang tumbuhnya pucuk. Individu pucuk lebih mudah dikulturkan dan dapat diakarkan melalui penyambungan mikro.
h. Pengakaran dan penanaman
Pada fase II, zat pengatur tumbuh sitokinin ditambahkan ke dalam medium kultur pucuk untuk merangsang tumbuhnya pucuk aksiler yang biasanya menghambat pertumbuhan akan. Pucuk-pucuk tunggal atau kumpulan Pucuk-pucuk harus segera dipindahkan pada medium lain untuk pengakaran sebelum dipindahkan ke lingkungan in vivo sebagai tanaman muda. Strategi alternatif bagi beberapa tanaman lainnya adalah mengakarkan tanaman secara ex
vitro. Perlakuan yang diaplikasikan bisa bervariasi menurut tipe
pertumbuhannya, sifat proliferasi pucuk tanaman yang dihasilkan selama kultur pada fase II, dan ukuran tanaman yang diinginkan petani.
i. Aplikasi terbaru
Kultur pucuk secara konvensional menjadi metode paling penting dalam mikropropagasi tanaman meskipun kultur buku juga semakin penting. Teknik ini sangat luas dilakukan oleh banyak laboratorium kultur jaringan komersial bagi perbanyakan kebanyakan tanaman hias dab tanaman berkayu jenis herba. Akan tetapi diperlukan sejumlah manipulasi untuk menghasilkan plantlet agar tidak lebih mahal jika dibandingkan dengan metode lainnya. Keberhasilan-keberhasilan yang telah dicapai adalah dengan mengotomatiskan beberapa fase dalam proses ini ketika teknik ini digunakan untuk memperbanyak secara masal dan dalam penggunaan robot bagi pemisahan dan penanaman.
Kultur Jaringan Tanaman 72 5.2. Kultur Meristem
a. Proliferasi pucuk dari ujung meristem
Barlass dan Skene (1978; 1980a,b; 1982a,b) menunjukkan bahwa pucuk dapat terbentuk secara adventif ketika ujung pucuk tanaman grapevine atau jeruk dipotong-potong beberapa bagian sebelum dikulturkan. Tideman dan Hawker (1982) juga berhasil menggunakan potongan tanaman Asclepias rotundifolia tetapi tidak berhasil pada tanaman Euphorbia peplus. Biasanya, struktur seperti daun pertama-tama muncul dari satu potongan, kemudian membesar dan membentuk pucuk dari bagian bawah yang membengkak. Pucuk aksiler sering terbentuk dari pucuk adventif yang pertama terbentuk. Kultur pucuk dipindahkan ke dalam medium cair sambil digojog akan membentuk priliferasi massa pucuk.
Meskipun memungkinkan untuk terjadinya proliferasi yang sangat tinggi, pucuk daun biasanya akan menjadi hyperhydric. Akan tetapi, beberapa spesies paling tidak pucuknya meng-alami reduksi ukuran menjadi lebih kecil dari pada pucuk yang baru berproliferasi (dengan menambahkan ZPT yang menghambat, Ziv
et al., 1994) yang kemudian memadai untuk perbanyakan dalam
massa yang sangat banyak. Beberapa teknik kultur lainnya yang sama yang terdiri dari meristem pucuk pada dasar kalus kadang-kadang dapat terbentuk eksplan ujung pucuk atau dari dasar kultur pucuk.
Kultur Jaringan Tanaman 73 Gambar 5.2. Kultur buku tunggal dan ganda (George et al., 2008)
5.3. Kultur Buku Tunggal dan Ganda (Penyetekan In Vitro)